Entrega de anticorpos no cérebro usando ultrassom de varredura focalizado

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para abrir transitoriamente a barreira hematoencefálica (BBB) focalmente ou em todo o cérebro do rato para fornecer anticorpos fluorescentes e ativar microglia. Também é apresentado um método para detectar a entrega de anticorpos e ativação de microglia por histologia.

Resumo

Apenas uma pequena fração de anticorpos terapêuticos voltados para doenças cerebrais são tomados pelo cérebro. O ultrassom focado oferece a possibilidade de aumentar a absorção de anticorpos e o engajamento através da abertura transitória da barreira hematoencefálica (BBB). Em nosso laboratório, estamos desenvolvendo abordagens terapêuticas para doenças neurodegenerativas em que um anticorpo em diversos formatos é entregue em todo o BBB utilizando microbolhas, concomitante com aplicação de ultrassom focalizada através do crânio visando múltiplas manchas, uma abordagem que chamamos de ultrassom de varredura (SUS). Os efeitos mecânicos de microbolhas e ultrassom nos vasos sanguíneos aumentam o transporte paracelular através do BBB, separando transitoriamente junções apertadas e aumentando a transcitose mediada por vesículas, permitindo que anticorpos e agentes terapêuticos cruzem efetivamente. Além disso, o ultrassom também facilita a absorção de anticorpos do cérebro intersticicial em células cerebrais, como neurônios onde o anticorpo se distribui por todo o corpo celular e até mesmo em processos neuróticos. Em nossos estudos, anticorpos fluorescentes rotulados são preparados, misturados com microbolhas baseadas em lipídios preparados internamente e injetados em camundongos imediatamente antes de o SUS ser aplicado ao cérebro. O aumento da concentração de anticorpos no cérebro é então quantificado. Para explicar alterações na homeostase cerebral normal, a fagocitose microglial pode ser usada como marcador celular. Os dados gerados sugerem que o fornecimento de ultrassom de anticorpos é uma abordagem atraente para tratar doenças neurodegenerativas.

Introdução

O ultrassom terapêutico é uma tecnologia emergente voltada para o tratamento de doenças cerebrais de forma não invasiva, em parte facilitando o acesso de agentes terapêuticos ao ^{cérebro1,2,3}. Como apenas uma pequena fração de anticorpos terapêuticos voltados para doenças cerebrais são absorvidos e retidos no ^cérebro4, o ultrassom terapêutico oferece a possibilidade de aumentar sua absorção e engajamento ^{direcionado5,6}.

Em nosso laboratório, estamos desenvolvendo abordagens terapêuticas para doenças neurodegenerativas nas quais um anticorpo em vários formatos é entregue através da barreira hematoencefálica (BBB) usando microbolhas. Para isso, o ultrassom é aplicado através do crânio no cérebro em vários pontos usando um modo de varredura que chamamos de ultrassom de varredura (SUS)⁷. A interação mecânica entre a energia do ultrassom, os microbolhas injetadas por via intravenosa e a vasculatura cerebral separa transitoriamente as junções apertadas do BBB em um determinado volume de sônica, permitindo anticorpos e outras cargas, incluindo agentes terapêuticos para efetivamente atravessar essa ^{barreira7,8,9} . Além disso, o ultrassom tem sido mostrado para facilitar a absorção de anticorpos do cérebro intersticicial em células cerebrais, como neurônios, onde o anticorpo se distribui por todo o corpo celular e até mesmo em processos neuróticos5,10.

A doença de Alzheimer é caracterizada por uma patologia amilóide-β e ^tau11, e uma série de modelos animais está disponível para dissecar mecanismos patogênicos e validar estratégias terapêuticas. Uma abordagem do SUS, pela qual o ultrassom é aplicado em um padrão sequencial em todo o cérebro, quando repetida em várias sessões de tratamento, pode reduzir a patologia da placa amiloide no cérebro de camundongos mutantes de proteína precursora amilóide-β (APP) e ativar microglia que toma o amiloide, levando à melhoria na função ^cognitiva7. A abertura do BBB com ultrassom e microbolhas também reduz a patologia tau em pR5, K3 e rTg4510 tau transgênicos camundongos5,12,13. É importante ressaltar que, enquanto a microglia remove depósitos de proteína extracelular, um dos mecanismos de liberação subjacentes às patologias intraneuronas induzidas pelo SUS é a ativação da autofagia ^neuronal12.

Aqui, delineamos um processo experimental, pelo qual anticorpos fluorescentes rotulados são preparados, e depois misturados com microbolhas à base de lipídios interna, seguidos de injeção retroorbital em camundongos anestesiados. A injeção retroorbital é uma alternativa à injeção da veia da cauda que descobrimos ser igualmente eficaz e simples de realizar repetidamente. Isso é imediatamente seguido pela aplicação do SUS no cérebro. Para determinar a absorção de anticorpos terapêuticos, os camundongos são sacrificados e o aumento da concentração de anticorpos no cérebro é então quantificado. Como proxy da mudança na homeostase cerebral, a atividade fagocítica microglial é determinada pela histologia e reconstrução volumosa 3D.

Os dados gerados sugerem que a entrega de ultrassom de anticorpos é uma abordagem potencialmente atraente para tratar doenças neurodegenerativas. O protocolo pode ser aplicado da mesma forma a outros candidatos a medicamentos, bem como a cargas modelo, como dextrans fluorescentemente rotulados de tamanhos ^definidos14.

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram aprovados pelo comitê de ética animal da Universidade de Queensland.

1. Preparação interna de microbolhas

1. Pese uma razão molar de 9:1 de 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholina e 1,2-distearoyl-sn-gliceo-3-phosphoethanolamine-N-[amino (polietilenoglicol)-2000] (sal de amônio). 0,5 mg de mistura lipídica é necessário por 1 mL de solução de microbolhas. Alternativamente, os lipídios já podem ser comprados em clorofórmio, se o uso de lipídios pré-dissolvidos passar a passo 1.3.
2. Dissolva o lipídio em um pequeno volume de clorofórmio em um copo de vidro.
3. Evaporar o clorofórmio com um evaporador ou um fluxo de nitrogênio.
4. Reidratar a filme lipíduo seco com 10 mL de PBS + 10% de glicerol + 10% de solução propilenoglicol que foi filtrada através de filtro de 0,22 μm.
5. Coloque a solução lipídica rehidratada em um sonicator de banho de água definido para 55 °C (acima da temperatura de fusão dos lipídios) e sonicar até dissolver completamente.
6. Solução lipídica aliquot em frascos de HPLC de 1,5 mL autoclaved e parafuso nas tampas de septa.
7. Aspire todo o ar no frasco com uma seringa de 5 mL equipada com uma agulha de 27 G e crie um vácuo no frasco.
8. Adicione octofluoropropano ao frasco com a seringa incluída, elaborando o gás do recipiente. Encha o frasco com 1-2 mL de octafluoropropano lendo o volume na seringa.
9. Sele cada frasco com filme de parafina e leve à geladeira.
10. No dia do experimento, leve o frasco à temperatura ambiente, adicione 0,5 mL de solução naCl de 0,9% ao frasco, depois coloque o frasco em um amalgamador e aguta por 45 s (tempo predefinido) para produzir os microcompletos.

2. Controle de qualidade de microbolhas usando um contador de coulter

1. Retire a solução de microbolhas do amalgamador e desabafe o gás do frasco perfurando a septa com uma agulha de 19 G.
2. Diluir a solução de microbolhas realizando diluições seriais de duas etapas 1:5.000 adicionando 100 μL de solução de microbolhas em 5 mL de solução de fluxo filtrado usando uma seringa de 1 ml com agulha de 19 G, e, em seguida, tomar 100 μL de 1:50 solução de microbolhas diluídas e pipetação em solução de fluxo filtrado de 10 mL em um cuvette usando uma pipeta.
3. Verifique se o tanque de eletrólitos tem solução de fluxo suficiente e que o tanque de resíduos está vazio.
4. Coloque a cuvette na plataforma do contador coulter e bloqueie-a no lugar. Use uma abertura de 30 μm para aquisição de amostras.
5. No software, carregue o método operacional padrão (SOM) e selecione Editar som | concentração. Digite diluição de 5000x.
6. No software, escolha um nome de arquivo adequado. Por exemplo, microbubble_1_date.
7. Carregue e proteja o cuvette na plataforma.
8. No software selecione Executar| Verifique e verifique se a concentração amostral é inferior a 10%. Se esse número for superior a 10%, realize uma nova diluição das microbolhas com um fator de diluição maior.
9. Selecione 'Iniciar' para iniciar uma aquisição da amostra para obter a leitura inicial.
10. Enxágüe a abertura do contador Coulter com solução de fluxo filtrada após cada medição. Repita as etapas 2.2-2.9 para obter 3 réplicas.
11. Coloque uma cuvette com solução de microbolha diluída em um banho de água sonicator e sonicate por 30 s.
12. Meça a solução com microbolhas sônicas e rotule em branco.
13. No software, subtraia a leitura final da leitura inicial. Isso subtrai quaisquer partículas que não sejam microbolhas e não contenham gás.
14. Selecione Resultados de exibição no software, para exibir a concentração de microbolhas, distribuição de tamanho, tamanho médio e concentração de volume.

3. Rotulagem de anticorpos fluorescentes

1. Obtenha uma solução de 1 mg/mL de IgG do mouse no PBS sem quaisquer aditivos.
2. Rotule 1 mg de mouse IgG com AlexaFluor 647 em tampão de bicarbonato de sódio de 0,1 M seguindo as instruções dos fabricantes localizadas no kit. Esta quantidade de IgG fluorescentemente rotulado é suficiente para realizar este procedimento em 5-7 camundongos adultos onde uma dose de 5 mg/kg de anticorpo é administrada.
3. Adicione o corante à solução de IgG em 0,1 M de tampão de bicarbonato de sódio e incubar por 15 min a temperatura ambiente.
4. Purifique o anticorpo fluorescente rotulado, encaixendo a solução de anticorpos em uma coluna de spin e centrifugando a 1.000 x g por 5 min. O corante livre permanecerá na cama da coluna.
5. Use um espectotômetro para medir a concentração de proteínas. Meça a absorvância da solução conjugada em 280 nm e 650 nm (A280 e A650). Calcule a concentração de proteína na amostra usando a equação:
   Concentração de proteína (M) = [A280 - (A650 x 0,03)] x fator de diluição / 203.000.
6. Use um espectrômetro para calcular o grau de rotulagem usando a equação:
   corante de mols por proteína toupeira = fator de diluição A650 x / 239 000 x concentração de proteína (M).
   NOTA: Um grau aceitável de rotulagem é de 3-7 mols corante por proteína toupeira e tipicamente obtido grau de rotulagem é em torno de 6.

4. Configuração de ultrassom

1. Utilizando o sistema de ultrassom focado, adicione o espaçador de 5 mm ao bolus de água para posicionar o foco do ultrassom 9 mm abaixo do fundo do bolus de água.
2. Encha o bolus de água com aproximadamente 300 mL de água deionizada que foi desgaseada com um degasser inline por 20 minutos (o teor de oxigênio deve ser inferior a 3 ppm). Coloque a matriz anular no bolus de água e use um espelho dentário para verificar se não há bolhas de ar na superfície. Se estiver presente na superfície, remova a matriz anular e substitua-a no bolus de água.
3. Inicie o software de aplicativo. No menu forma de onda, selecione Definir ciclo de serviço de forma de onda. As configurações são PRF (Hz) 10, ciclo de responsabilidade 10%, foco 80 mm, frequência central 1 MHz, amplitude (pressão negativa de pico MPa) 0,65 MPa, índice mecânico = 0,65. Pressione definir para definir a forma de onda e armazená-la na memória.
   NOTA: O sistema de ultrassom focado é pré-calibrado pelo fabricante a partir de medições tomadas por um hidrofone calibrado.
4. No software do sistema de ultrassom focado, defina um plano de tratamento. Isso requer a definição de uma região de tratamento composta por múltiplos locais de tratamento individual, e a definição de ações a serem tomadas em cada um desses locais de tratamento. Neste caso, a zona de tratamento é um hemisfério do cérebro do camundongo.
5. Na janela do controlador de movimento, vá para a guia 'Digitalizar ' e Digite o valor de início, parada e incremento para movimento na dimensão x e valor de início, parada e incremento para movimento na direção y. Digite valores para X: start -4, stop 3.50 e Y: -3.00, stop 3, Increment 1.5, # loops: 1.
6. Defina as ações para os locais de tratamento. Na janela do controlador de movimento, selecione o botão Event . Na janela de edição de script, selecione uma lista de ações que serão executadas na ordem selecionada em cada local de tratamento. Defina o Tipo de Movimento para a grade raster na parte superior da janela do script. Na guia de eventos selecione Adicionar ações para movê-las para o painel de script e adicionar Mover Síncronia, Iniciar arb de arb de gatilho, esperar, interromper a arb de arb. Clique na ação de espera e selecione um tempo de espera de 6.000 ms.
   NOTA: Essas configurações farão do tratamento uma grade de 6 x 5 de pontos de tratamento espaçados a 1,5 mm de distância, com cada ponto tendo uma duração de tratamento de 6 s. A duração total para sonicar um cérebro de rato é de aproximadamente 3 minutos. Esta grade de tratamento de tamanho é adequada para camundongos adultos C57/Bl6 pesando aproximadamente 30 g. O tamanho da grade das manchas de tratamento pode ser ajustado para cima ou para baixo, dependendo do tamanho do mouse.

5. Preparação animal

1. Pesar o mouse com um equilíbrio preciso de 0,1g.
2. Camundongo anesthetize com 90 mg/kg de cetamina e 6 mg/kg de xilazina intraperitoneally. Teste para ausência de reflexos com uma pitada de dedo do dedo do dedo. Alternativamente, os camundongos podem ser anestesiados com isoflurano usando um aparelho anestésico inalatório apropriado com uma máscara facial apropriada. Se usar isoflurane, o rato deve ser colocado em uma almofada de calor durante o ultrassom para evitar hipotermia.
3. Use uma navalha elétrica para raspar o cabelo da cabeça do animal, em seguida, aplique creme de depilação com um broto de algodão, deixe ligado por 2-3 minutos ou até que o cabelo seja limpo com um pedaço úmido de gaze. Tome cuidado para que o creme de depilação não entre nos olhos do rato.
4. Marque o centro da cabeça do rato com um marcador permanente. O transdutor tem um buraco em seu centro e o foco do transdutor e ponto focal podem ser alinhados visualmente.
5. Encha um pequeno barco de pesagem que já teve o fundo cortado e substituído por plástico colado na parte inferior do barco de pesagem com gel de ultrassom. Isso serve como um espaçador de 8 mm e fornece um bom acoplamento na cabeça do mouse e permite a inspeção visual do foco do transdutor alinhado com a cabeça do mouse.

6. Preparação de microbolhas

1. Aqueça um frasco de microbolhas à temperatura ambiente. Para ativar, adicione 0,5 mL de solução NaCl de 0,9% ao frasco e coloque em um amalgamador para agitar por 45 s para produzir os microcompletos.
2. Vente o frasco perfurando o septa com uma agulha de 27 G.

7. Tratamento de ultrassom

1. Inverta o frasco de microbolhas e elabove suavemente 1 μL/g peso corporal da solução. A este adicione a solução de anticorpos fluorescentes rotulados e misture suavemente na seringa. O volume máximo injetado é de 150 μL.
   NOTA: Os microbolhas preparados internamente são aproximadamente 60 vezes menos concentrados do que os usados clinicamente (por exemplo, microbolhas Definity). Ajuste o volume ou concentração de modo que o número de microbolhas injetadas sejam semelhantes aos utilizados clinicamente (ou seja. Definity 1,2 x ¹⁰⁸ microbolhas/kg de peso corporal).
2. Injete a solução de microbolhas e anticorpos retroorbitamente, tomando o cuidado de injetar suavemente e lentamente. Em seguida, aplique pomada oftálmica nos olhos do rato.
3. Coloque o mouse no suporte da cabeça (veja Tabela de Materiais) e conserte o nariz do mouse. Em seguida, coloque o pequeno barco de pesagem cheio de gel de ultrassom em cima da cabeça.
4. Abaixe o bolus de água até que ele fique em cima do gel de ultrassom no barco de pesagem.
5. Use o joystick para mover o foco do transdutor para o centro da cabeça. Selecione Redefinir a Origem na guia de movimento.
6. Selecione a varredura completa. As etapas 7.3-7.6 levarão 2 min.
7. Para obter consistência, defina um temporizador para garantir um atraso de 2 minutos entre a injeção de microbolhas e a seleção completa da varredura.
8. Após o tratamento ser concluído, aplique pomada oftalmica nos olhos e coloque o rato em uma câmara de recuperação aquecida. Se a hipotermia for observada durante o procedimento, uma almofada de aquecimento pode ser colocada sob o mouse para fornecer calor suplementar durante o procedimento.

8. Colheita e processamento de tecidos

1. No ponto de tempo de interesse após o parto do ultrassom (pelo menos 1h para detectar altos níveis de anticorpo no cérebro) anestesia profundamente o camundongo com uma overdose de solução pentobarbitona (100 mg/kg) e transcardialmente perfumar o rato com 30 mL PBS. Uma boa perfusão é necessária para detectar especificamente anticorpos fluorescentes rotulados que foram entregues ao cérebro.
2. Colete o cérebro e corrija por imersão em 4% pfa por 24 h a 4 °C, depois lave com PBS.
3. Imagem do cérebro em um scanner infravermelho colocando o cérebro na bandeja e adquirindo uma imagem no canal de 700 nm.
   NOTA: Após a fixação, o cérebro é removido do PFA, lavado em PBS e seccionado. Alternativamente, pode ser colocado em solução crioprotectante de etileno glicol por 24 h a 4 °C ou até submergir, e depois movido para um novo crioprotetor contendo frasco e colocado a -20 °C para armazenamento a longo prazo.
4. Seção o cérebro frio na PBS usando um vibratome. Cole o cérebro na plataforma e corte seções de 30-40 μm e colete em PBS.
   NOTA: A autofluorescência lysosômica (predominante em seções de animais com mais de 12 meses) deve ser branqueada pela iluminação noturna das seções em uma caixa de câmara leve, à temperatura ambiente e em PBS contendo azida (0,02%) para bloquear o crescimento bacteriano.

9. Coloração de tecidos e aquisição de imagem

1. Transferir seções para solução de bloqueio (5% BSA em 0,2% Triton/PBS) por 2h à temperatura ambiente e, em seguida, lave as seções 3x substituindo a solução por 0,2% Triton/PBS.
2. Incubar seções a 4 °C durante a noite com os anticorpos primários contra Iba1 (diluição 1:1.000) e CD68 (diluição 1:500), em 0,2% Triton/PBS, seguido por lavagens 3x com 0,2% Triton/PBS.
3. Incubar seções por 2h à temperatura ambiente com anticorpos secundários fluorescentes (diluição 1:500), seguidas por lavagens 3x com apenas Triton/PBS de 0,2%.
   NOTA: Os núcleos também podem ser manchados usando a solução DAPI (0,5 μg/mL).
4. Transfira as seções para um slide e deslize com mídia de montagem em jogo rígido. Permita tempo suficiente para que o meio de montagem se solidifique antes da visualização e aquisição de imagens (durante a noite).
5. Com um microscópio confocal obter imagens de pilha de z (pelo menos 10 μm de profundidade e 0,3 μm de tamanho de passo, 10 imagens por animal) da área cerebral alvo do ultrassom usando um microscópio confocal e um objetivo de pelo menos 40x de ampliação.
   NOTA: Tenha cuidado para adquirir imagens dentro do alcance dinâmico do sinal, evitando a sub-/superexposição. Salve os arquivos de imagem no formato de software correspondente usado pelo microscópio.

10. Análise de imagem

1. Converta os arquivos de microscopia de pilha z usando o importador de arquivos de software de análise de imagens.
2. Abra os arquivos convertidos no software e ajuste a intensidade do canal Iba1 para observar células microgliais.
3. Corte uma única célula microglial desenhando uma caixa ao redor dela, selecione 'crop' e salve o novo arquivo.
4. Construa a renderização da superfície 3D do sinal IBA1 por:
   1. Abra o arquivo Imaris de célula única gerado na etapa anterior.
   2. Adicione uma superfície ao arquivo.
   3. Selecione o canal correspondente à coloração Iba1.
   4. Aplique um limiar que deve se sobrepor à mancha Iba1
   5. Selecione apenas a estrutura de interesse que está formando a célula microglial de interesse
5. Finalize o processo
   1. Obtenha e regise o volume da mancha Iba1
   2. Construa a renderização da superfície 3D da coloração CD68
   3. Dentro do subsfilo de superfície IBA1, mascarar o canal CD68 e remover os voxels fora da mancha IBA1
   4. Adicione uma nova superfície ao arquivo
   5. Selecione o canal correspondente à coloração cd68
   6. Aplique um limiar que deve se sobrepor à coloração do CD68 e esteja o mais próximo possível, correspondendo aos volumes de coloração
   7. Finalize o processo, pois apenas as estruturas intra-microglial CD68 estarão presentes neste arquivo e, portanto, não requerem outra etapa de filtragem de limiar
   8. Obtenha e regise o número e o volume médio das estruturas positivas do CD68
   9. Calcule o volume relativo das estruturas CD68 por suas estruturas IBA1 correspondentes como medida de ativação microglial em estado fagocítico.

Resultados

Usando este protocolo, anticorpos rotulados fluorescentemente são entregues ao cérebro e podem ser detectados, juntamente com a ativação de microglia. A conclusão que pode ser traçada é o uso de ultrassom focado e microbolhas marcadamente melhora a absorção cerebral de anticorpos e pode entregar anticorpos para todo o cérebro ou hemisfério de um rato quando usado em um modo de varredura. A Figura 1 mostra o dispositivo de aplicação de ultrassom TIPS (diferentes componentes rotulados) que é u...

Discussão

Anticorpos fluorescentes podem ser entregues ao cérebro usando ultrassom focado juntamente com microbolhas aplicadas em um modo de varredura. O parto de anticorpos, a morfologia microglial e o alargamento liossômico podem ser detectados por microscopia de fluorescência após o ultrassom de varredura. Microglia pode entrar em seus anticorpos e antígenos lysossomes que os anticorpos têm vinculado em um processo mediado por receptores ^fc4.

Há uma série de etapas críticas pa...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina	Avanti	850365C
1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilenoglicol)-2000]	Avanti	880128C
AlexaFluor 647 kit de rotulagem	de anticorpos Thermo Fisher	A20186
CD68 anticorpo	AbD Serotec	MCA1957GA	Uso 1:1000 diluição
Contador de relha de clorofórmio	Sigma-Aldrich	372978
(Multisizer 4e)
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 488	Thermo FIsher	A-11008	Use diluição 1:500
IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A-11077	Use diluição
1:500suporte de cabeça (modelo SG-4N, Narishige Japão)
Iba1 anticorpo	Wako	019-19741	Uso diluição 1:1000
Software de análise de imagem	Beckman Coulter	#8547008
Solução de fluxo de isofluxo	Beckman Coulter	B43905
Sistema de imagem de infravermelho próximo Odyssey Fc	Licor	2800-03
Octafluoropropano	Arcadophta	0229NC
Propilenoglicol	Sigma-Aldrich	P4347
TIPS (Sistema de Sonda de Imagem Terapêutica)	Philips Research	TIPS_007
	Bitplane