Um modelo de cultura celular para estudar o papel das interações neurônio-glia na isquemia

Resumo

Aqui, apresentamos uma abordagem simples usando meios de cultura específicos que permitem o estabelecimento de culturas enriquecidas com neurônios e astrócitos, ou culturas neuron-glia do córtex embrionário, com alto rendimento e reprodutibilidade.

Resumo

O AVC isquêmico é uma condição clínica caracterizada pela hipoperfusão do tecido cerebral, levando à privação de oxigênio e glicose, e à consequente perda neuronal. Inúmeras evidências sugerem que a interação entre células gliais e neuronais exerce efeitos benéficos após um evento isquêmico. Portanto, para explorar potenciais mecanismos de proteção, é importante desenvolver modelos que permitam estudar interações neurônio-glia em um ambiente isquêmico. Aqui apresentamos uma abordagem simples para isolar astrócitos e neurônios do córtex embrionário de ratos, e que, usando meios de cultura específicos, permite o estabelecimento de culturas enriquecidas com neurônios ou astrócitos ou culturas neuron-glia com alto rendimento e reprodutibilidade.

Para estudar a conversa cruzada entre astrócitos e neurônios, propomos uma abordagem baseada em um sistema de co-cultura no qual neurônios cultivados em deslizamentos são mantidos em contato com uma monocamada de astrócitos banhados em placas multiwell. As duas culturas são mantidas separadas por pequenas esferas de parafina. Essa abordagem permite a manipulação independente e a aplicação de tratamentos específicos a cada tipo celular, o que representa uma vantagem em muitos estudos.

Para simular o que ocorre durante um acidente vascular cerebral isquêmico, as culturas são submetidas a um protocolo de privação de oxigênio e glicose. Este protocolo representa uma ferramenta útil para estudar o papel das interações neurônio-glia no derrame isquêmico.

Introdução

Segundo dados da Organização Mundial da Saúde, cerca de 5,5 milhões de pessoas morrem todos os anos por acidente vascular cerebral isquêmico¹. Essa condição é caracterizada pela interrupção do fluxo sanguíneo para uma determinada região cerebral, resultando em uma perda reversível ou irreversível no fornecimento de oxigênio e nutrientes para o tecido, o que altera a função tecidual e leva à disfunção mitocondrial, desregulação de cálcio, excitoxicidade do glutamato, inflamação e perda celular^2,,3.

Além das células vasculares, as células neuronais e gliais est....

Protocolo

Todos os animais utilizados foram criados no Centro de Pesquisa em Ciência da Saúde CICS-UBI, de acordo com os requisitos éticos nacionais para a pesquisa animal e com a Convenção Europeia para a Proteção de Animais vertebrados Usados para Fins Experimentais e Outros Científicos (Diretiva 2010/63/UE).

1. Cultura celular primária do córtex do embrião do rato

1. Preparação média da cultura
   1. Prepare o Neurobasal Medium (NBM) adicionando os seguintes suplementos: 2% B27, 0,5 mM de glutamina, 25 μM de glutamato e 120 μg/mL gentamicina. Homogeneize, ajuste o pH para 7,2 e esterilize o meio com uma etapa de filtragem a vácuo, utiliza....

Resultados

Para caracterizar as culturas, a imunocitoquímica para avaliar o número de células que expressavam GFAP ou MAP2, marcadores amplamente utilizados de astrócitos e neurônios (Figura 2),foi realizada em cada tipo de cultura cortical. Esta análise revelou que as culturas enriquecidas com astrócito apresentaram 97% das células expressas GFAP (Figura 2A). Em relação à cultura enriquecida com neurônios, 78% das células expressas MAP2, 4% das células expressas GFAP e 18.......

Discussão

O método aqui descrito consiste no isolamento de astrócito e neurônio do tecido cortical embrionário de ratos, permitindo o estabelecimento de culturas enriquecidas com neurônios ou astrócitos ou culturas neurônio-glia. Foi adaptado de um estudo anterior do nosso grupo^5,onde foram descritas as culturas embrionárias do neurônio cortical-glia e do neurônio enriquecidos com neurônios e as duas culturas caracterizadas. Usando essas culturas, Roque et al. descobriram que os astrócitos desempenham um pa.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de cultura de 24 poços	Thermo Fischer Scientific	142475
95% N2/5% CO2 cilindro de gás	ArLí quido
Anti-mouse conjugado com Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001	diluição 1/1000; período de incubação - 1 h à temperatura ambiente
Anti-coelho conjugado com Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11010	diluição 1/1000; período de incubação - 1 h à temperatura ambiente
suplemento B27 (50x)	Gibco	17504-044
Dako Fluorescência Meio de Montagem	Dako	S3023
D-glicose anidra	Fisher Scientific	G/0450/60	3.4 g/L
Microscópio de epifluorescência	Zeiss	AxioObserver Z1x	63x objetivo
Fetal Soro Bovino (FBS)	Biochrom	S0615	10%
Gentamicina	Sigma-Aldrich	G1272	120 µ g/mL
de Glutamato	Sigma-Aldrich	G8415 25	µ M
Glutamina	Sigma-Aldrich	G3126	0.5 mM
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	2 µ M; período de incubação - 10 min à temperatura ambiente
Câmara de incubação de hipóxia	Stemcell Technologies	27310	Câmara usada para indução de OGD
Insulina do pâncreas bovino	Sigma-Aldrich	I5500	5 mg/L
Cetamina	Sigma-Aldrich	K-002	87,5 mg/Kg
Mínimo Essencial Médio Eagle médio	Sigma-Aldrich	M0268	aquecer até 37 &graus; C antes do uso
Mouse Anti-MAP2	Santa Cruz Biotechnology	Sc-74421	diluição de 1/500; período de incubação durante a noite a 4 &graus; C
Meio neurobasal	Gibco	21103-049	aquecer até 37 > C antes
do uso Pastilhas de parafina para histologia	Sigma-Aldrich	1.07164	Ponto de solidificação 56-58° C
Paraformaldeído	Sigma -Aldrich	P6148	4% em PBS
Penicilina/Estreptomicina	Biochrom	A 2213	penicilina (12U/mL) /estreptomicina (12µ g / mL)
Poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	P1024
Rabbit Anti-GFAP	DAKO	Z0334	1/2000 diluição; período de incubação durante a noite a 4 ° C
Hidrogenocarbonato de sódio	Fisher Scientific	S/4240/60	2.2g/L
Xylazine	Sigma-Aldrich	X1126	12 mg/Kg