Artigo de método

Um modelo de cultura celular para estudar o papel das interações neurônio-glia na isquemia

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DOI:

10.3791/61388

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14 de novembro de 2020

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1Centro de Investigação em Ciências da Saúde (CICS-UBI), Universidade da Beira Interior, 2Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade da Beira Interior

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos uma abordagem simples usando meios de cultura específicos que permitem o estabelecimento de culturas enriquecidas com neurônios e astrócitos, ou culturas neuron-glia do córtex embrionário, com alto rendimento e reprodutibilidade.

Resumo

O AVC isquêmico é uma condição clínica caracterizada pela hipoperfusão do tecido cerebral, levando à privação de oxigênio e glicose, e à consequente perda neuronal. Inúmeras evidências sugerem que a interação entre células gliais e neuronais exerce efeitos benéficos após um evento isquêmico. Portanto, para explorar potenciais mecanismos de proteção, é importante desenvolver modelos que permitam estudar interações neurônio-glia em um ambiente isquêmico. Aqui apresentamos uma abordagem simples para isolar astrócitos e neurônios do córtex embrionário de ratos, e que, usando meios de cultura específicos, permite o estabelecimento de culturas enriquecidas com neurônios ou astrócitos ou culturas neuron-glia com alto rendimento e reprodutibilidade.

Para estudar a conversa cruzada entre astrócitos e neurônios, propomos uma abordagem baseada em um sistema de co-cultura no qual neurônios cultivados em deslizamentos são mantidos em contato com uma monocamada de astrócitos banhados em placas multiwell. As duas culturas são mantidas separadas por pequenas esferas de parafina. Essa abordagem permite a manipulação independente e a aplicação de tratamentos específicos a cada tipo celular, o que representa uma vantagem em muitos estudos.

Para simular o que ocorre durante um acidente vascular cerebral isquêmico, as culturas são submetidas a um protocolo de privação de oxigênio e glicose. Este protocolo representa uma ferramenta útil para estudar o papel das interações neurônio-glia no derrame isquêmico.

Introdução

Segundo dados da Organização Mundial da Saúde, cerca de 5,5 milhões de pessoas morrem todos os anos por acidente vascular cerebral isquêmico1. Essa condição é caracterizada pela interrupção do fluxo sanguíneo para uma determinada região cerebral, resultando em uma perda reversível ou irreversível no fornecimento de oxigênio e nutrientes para o tecido, o que altera a função tecidual e leva à disfunção mitocondrial, desregulação de cálcio, excitoxicidade do glutamato, inflamação e perda celular2,,3.

Além das células vasculares, as células neuronais e gliais estão envolvidas na fisiopatologia do derrame isquêmico4. Em particular, os astrócitos são essenciais para a manutenção dos neurônios e recentemente mostraram-se um papel crítico na resposta à lesão isquêmica5. Este tipo de célula gliaial exerce funções de suporte estrutural, defesa contra estresse oxidativo, síntese de neurotransmissores, estabilização da comunicação célula-célula, entre outras6. Junto com os neurônios, os astrócitos desempenham um papel direto na transmissão sináptica, regulando a liberação de moléculas como triphosfato de adenosina, ácido gama-aminobutírico e glutamato7. Parte da lesão induzida pela isquemia é causada pela liberação excessiva de glutamato e seu acúmulo na fissura sináptica, levando à superativação de receptores N-metil-D-aspartato, ativando cascatas de sinalização a jusante, resultando em excitotoxicidade8. Uma vez que os astrócitos são capazes de remover o glutamato da fissura sináptica e convertê-lo em glutamina, eles são cruciais na defesa contra a excitotoxicidade, exercendo assim um efeito neuroprotetor sobre a isquemia. Essas células também desempenham um papel na neuroinflamação induzida pela isquemia. Após o insulto isquêmico, os astrócitos ativados sofrem alterações morfológicas (hipertrofia), proliferam e mostram um aumento na expressão de proteína ácida fibrilar gliana (GFAP). Eles podem se tornar reativos (astrogliose), liberando citocinas pró-inflamatórias como o fator necrose tumoral-α, interleucina-1α e interleucina-1β, e produzindo radicais livres, incluindo óxido nítrico e superóxido, que por sua vez pode induzir a morte neuronal9,,10. Em contraste, os astrócitos reativas também podem ter um efeito neuroprotetor, uma vez que liberam citocinas anti-inflamatórias, como transformar fator de crescimento-β, que é regulado após o derrame11. Além disso, podem gerar uma cicatriz glianal, que pode limitar a regeneração tecidual inibindo o broto axonal; no entanto, essa cicatriz gliaria pode isolar o local da lesão do tecido viável, evitando assim uma onda cascata de danos teciduais descontrolados12,13.

Assim, é imprescindível estabelecer modelos que permitam estudar interações neurônio-glia sob uma lesão isquêmica, a fim de encontrar estratégias terapêuticas que limitem ou revertam os efeitos da lesão isquêmica. Comparado com outros modelos usados para estudar lesões isquêmicas, ou seja, os modelos in vivo 14,,15,16, culturas organotípicas17,,18,,19 e fatias cerebrais agudas20,,21,,22, culturas celulares primárias são menos complexas, o que possibilita o estudo de contribuições individuais de cada tipo celular na fisiopatologia do derrame isquêmico e como cada tipo de célula responde a possíveis alvos terapêuticos. Tipicamente, para estudar as interações entre culturas enriquecidas por neurônios e culturas enriquecidas por astrócitos, são utilizados neurônios e células gliais de origem pós-natal23,,24ou células gliais pós-natais e neurônios embrionários25,,26. Aqui é proposto uma abordagem simples para estabelecer culturas enriquecidas com neurônios ou astrócitos e culturas neurônio-glia a partir do mesmo tecido. Essas células primárias são obtidas a partir do córtex embrionário de rato, uma região frequentemente afetada pelo acidente vascular cerebral27,28. Além disso, a dissociação do tecido é realizada apenas por um procedimento mecânico. Portanto, este protocolo permite isolar células no mesmo estágio de desenvolvimento, de forma rápida e barata, e com alto desempenho e reprodutibilidade.

O crosstalk entre astrócitos e neurônios pode ser explorado usando um sistema de co-cultura no qual neurônios cultivados em deslizamentos são mantidos em contato com uma monocamada de astrócitos semeados em placas multiwell. Pequenas esferas de parafina podem ser usadas para garantir a separação das duas culturas celulares. Esta abordagem permite manipulação independente de cada tipo de célula antes de serem colocados em contato. Por exemplo, é possível silenciar um gene específico em astrócitos e ver como ele pode influenciar a vulnerabilidade neuronal ou proteção contra danos induzidos por isquêmicos. Um método estabelecido para induzir condições isquêmicas in vitro é a privação de oxigênio e glicose (OGD)3, que consiste em substituir a atmosfera regular (95% de ar e 5% DE CO2) por uma atmosfera anoxica (95% N2 e 5% CO2),associada à omissão de glicose.

O método descrito é adequado para estudar as interações entre neurônios e astrócitos no contexto do AVC isquêmico, de forma simples, rápida, reprodutível e barata.

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Protocolo

Todos os animais utilizados foram criados no Centro de Pesquisa em Ciência da Saúde CICS-UBI, de acordo com os requisitos éticos nacionais para a pesquisa animal e com a Convenção Europeia para a Proteção de Animais vertebrados Usados para Fins Experimentais e Outros Científicos (Diretiva 2010/63/UE).

1. Cultura celular primária do córtex do embrião do rato

  1. Preparação média da cultura
    1. Prepare o Neurobasal Medium (NBM) adicionando os seguintes suplementos: 2% B27, 0,5 mM de glutamina, 25 μM de glutamato e 120 μg/mL gentamicina. Homogeneize, ajuste o pH para 7,2 e esterilize o meio com uma etapa de filtragem a vácuo, utilizando um filtro de 0,22 μm. Para a cultura celular neurônio-glia, suplementar o meio de cultura celular NBM com 10% do Soro Bovino Fetal Inativado por Calor (HI-FBS).
    2. Prepare o meio Mínimo Essencial De Águia Média (MEM) com os seguintes suplementos: carbonato de hidrogênio de sódio 2,2 g/L, insulina do pâncreas bovino 5 mg/L, Anidro D-glicose 3,4 g/L, penicilina (12 U/mL) /estreptomicina (12 μg/mL) e 10% HI-FBS. Homogeneize, ajuste o pH para 7,2 e esterilize o meio com uma etapa de filtragem.
  2. Preparação de materiais e equipamentos
    1. Puna a parte terminal de uma ponta de micropipette plástica de 1 mL de um lado para o outro, utilizando uma agulha com diâmetro específico (0,5 mm para S; 0,6 mm para M; 0,8 mm para L) e selar a abertura da ponta com uma chama.
    2. Esterilize todos os vidros. Durante toda a dissecção mantêm as ferramentas utilizadas (por exemplo, tesoura, pinça, bisturi) imersas em 70% de etanol. Pulverize os materiais com 70% de etanol antes de entrar na câmara de fluxo laminar.
    3. Coloque a temperatura do banho de água para 37 °C e coloque o meio de cultura celular no banho de água antes de iniciar o procedimento.
      NOTA: Para ensaios de imunocitoquímica, o revestimento de poli-D-lisina deve ser realizado em placas multiwell contendo tampas.
  3. Cultura do córtex embrionário de rato
    1. Remover os embriões de ratos de um rato Wistar fêmea com 15-16 dias de gestação (o fim do acasalamento, que deve durar 24h, é considerado o1º dia do desenvolvimento embrionário). Para isso, anestesiar a fêmea com cetamina (87,5 mg/kg) e xilazina (12 mg/kg) e remover os embriões. Em seguida, eutanize o rato fêmea por deslocamento cervical, seguindo o protocolo padrão.
    2. Coloque os embriões em um tubo estéril de 50 mL, adicione soro fisiológico tampão de fosfato (PBS) até cobrir os embriões e leve-os rapidamente para a sala de cultura.
    3. Ainda dentro do saco de gema, coloque os embriões em uma placa de Petri contendo 25 mL de PBS frio. Com a ajuda de tesouras e pinças, quebre o saco de gema, remova o embrião e transfira para outra placa de Petri contendo também PBS fria. O PBS na placa de Petri deve ser suficiente para cobrir todo o embrião.
      NOTA: Tenha cuidado ao abrir o saco de gema para evitar danificar o embrião. Em 1.3.3 e 1.3.4 usamos placas de Petri de 90 mm de diâmetro colocadas em cima de blocos de gelo cobertos com papel absorvente para manter o PBS em baixa temperatura.
    4. Para dissecção do embrião, transfira-o para outra placa de Petri contendo 30 mL de PBS frio. Coloque o embrião sob um microscópio dissecando e imobilize-o usando uma pinça. Faça a incisão inicial paralela ao córtex, indo da cavidade ocular até o fim da focinheira e tenha cuidado para não decapitar o animal.
    5. Remova cuidadosamente o couro cabeludo e as meninges usando pinças, a fim de não danificar o tecido cerebral cortical. Faça a próxima incisão para separar o córtex. Transfira o tecido cortical para um tubo de 15 mL contendo 5 mL de PBS usando uma pipeta Pasteur.
    6. Realize a digestão mecânica do tecido cerebral cortical utilizando as pontas plásticas de 1 mL preparadas em 1.2.1. Triturar 10 vezes com uma pipeta regular e repetir o processo usando pipetas com orifícios progressivamente menores (L, M e S), até que os pedaços tenham desmoronado.
    7. Após a digestão mecânica, centrifufique a suspensão a 400 x g por 3 min. Descarte o supernasce e resuspenque o sedimento com o meio de cultura celular apropriada previamente aquecido a 37 °C.
    8. Determinar o número total de células presentes na suspensão celular (densidade celular) usando uma câmara de Neubauer, fazer as diluições apropriadas e emplacar as células. A densidade celular inicial foi definida com base em um estudo anterior5.
      1. Para uma cultura enriquecida com neurônios, use 0,21 x 106 células/cm2 como a densidade celular inicial e mantenha as células em meio de cultura NBM sem HI-FBS.
      2. Para as culturas neurônio-glia, utilize 0,14 x 106 células/cm2 como densidade celular inicial e mantenha as células em média de cultura NBM suplementadas com HI-FBS de 10%.
      3. Para uma cultura enriquecida com astrócitos, use 0,26 x 106 células/cm2 como densidade celular inicial e mantenha as células em MEM suplementadas como indicado anteriormente.
      4. Coloque as células em uma incubadora a 37 °C, 95% O2 e 5% CO2.
        NOTA: Por períodos de cultura mais longos, um anti-mitótico como 27 μM 5-fluoro-2'-desoxyuridina com 68 μM uridine deve ser adicionado para suprimir o crescimento celular.

2. Sistema de cocultura

  1. Preparação de materiais
    1. Aqueça a parafina a 150 °C em um bloco de aquecimento por aproximadamente 7 minutos. Mantenha a 150 °C até terminar o procedimento. Em seguida, com a ajuda de uma pipeta pasteur de vidro estéril de 1 mm de diâmetro, adicione uma pequena gota sobre as tampas esterilizadas e revestidas de PDL. As esferas de parafina são irregulares, mas têm aproximadamente 2 mm de diâmetro. As esferas permitirão que as duas culturas sejam separadas por aproximadamente 1,25 mm.
    2. Como a parafina não é estéril, coloque o multiwell com as esferas de parafina sob radiação ultravioleta por 15 minutos.
    3. Para estabelecer a cocultura, transfira o deslizamento de cobertura com as esferas de parafina usando uma pinça anteriormente imersa em 70% de etanol por 15 minutos.
  2. Co-cultura
    1. Quando as duas culturas estiverem prontas para uso (ou seja, após 7 dias na cultura sob as condições mencionadas na etapa 1.3.8), transfira os neurônios semeados nas tampas com esferas de parafina para os poços que contêm os astrócitos.
    2. 24 h antes que as duas culturas sejam trazidas em contato, mude o meio cultural dos neurônios e astrócitos para NBM complementado, ou não, com HI-FBS, dependendo do propósito do experimento.
    3. Depois de colocar ambos os tipos de células em contato, aguarde 8-12 h antes de iniciar os diferentes estímulos e procedimentos.
      NOTA: A representação esquemática do sistema de cocultura é mostrada na Figura 1.

3. Privação de oxigênio e glicose

  1. Preparação média da cultura
    1. Para os experimentos OGD, use a Solução de Sal Balanceado (HBSS) da Hank. Prepare o meio HBSS com os seguintes reagentes: 1,26 mM CaCl2, 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,49 mM MgCl2, 139,9 mM NaCl, 4,17 mM NaHCO3, 3,38 mM Na2HPO4 .4 Homogeneize e ajuste o pH para 7,2. Esterilize o meio por filtragem.
      NOTA: Se for o caso, suplemente a solução HBSS com glicose (HBSSglu+), adicionando 5,56 mM de glicose. Para culturas submetidas ao OGD não suplementar o meio HBSS com glicose (HBSSglu-).
  2. Procedimento OGD
    1. 7 dias após a semeadura das células, remova o meio de cultura e lave duas vezes com HBSSglu-. Depois de lavar adicione o meio de cultura de células HBSSglu e coloque o multiwell na câmara de hipóxia.
    2. Sele a câmara de hipóxia e adicione uma mistura de gás contendo 95% N2/5% DE CO2 por 4 min com um fluxo de 20 L/min para remover o oxigênio presente dentro da câmara. Depois disso, pare o fluxo e coloque a câmara de hipóxia em uma incubadora a 37 °C por 4h ou 6h, dependendo da extensão da isquemia pretendida.
    3. Após o período de OGD, substitua o hbssglu-médio pelo meio de cultura adequado para os procedimentos restantes.
      NOTA: O experimento OGD visa simular as condições in vitro que as células sofrem durante um evento isquêmico, por isso é importante certificar que todas as mídias usadas anteriormente são removidas.

4. Ensaio de imunocytoquímica

NOTA: Realize o ensaio de imunocitoquímica conforme descrito anteriormente5.

  1. Resumidamente, para caracterizar as diferentes culturas corticais, incubar as células durante a noite a 4 °C com o coelhinho anti-GFAP (1:2000) e a proteína anti-microtúbula do rato 2 (MAP2; 1:500); e depois 1h à temperatura ambiente com os seguintes anticorpos secundários: anti-coelho conjugado a Alexa Fluor 546 e anti-rato conjugado à Alexa Fluor 488, ambos a 1:1000 diluição.
  2. Rotule os núcleos celulares por incubação com 2 μM Hoechst 33342 por 10 min a temperatura ambiente.
  3. Montagem de tampas no meio de montagem da fluorescência e adquira imagens em um microscópio de epifluorescência com uma ampliação de 63x.

5. Análise estatística

  1. Expresse dados como percentual do número total de células ou como percentual de controle e apresentados como a média ± erro padrão da média (SEM) de pelo menos 3 experimentos independentes realizados em triplicado.
  2. Realize análise estatística com software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA), usando o teste t do aluno não pago. Os resultados foram considerados significativos quando os valores de p < 0,05.

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Resultados

Para caracterizar as culturas, a imunocitoquímica para avaliar o número de células que expressavam GFAP ou MAP2, marcadores amplamente utilizados de astrócitos e neurônios (Figura 2),foi realizada em cada tipo de cultura cortical. Esta análise revelou que as culturas enriquecidas com astrócito apresentaram 97% das células expressas GFAP (Figura 2A). Em relação à cultura enriquecida com neurônios, 78% das células expressas MAP2, 4% das células expressas GFAP e 18...

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Discussão

O método aqui descrito consiste no isolamento de astrócito e neurônio do tecido cortical embrionário de ratos, permitindo o estabelecimento de culturas enriquecidas com neurônios ou astrócitos ou culturas neurônio-glia. Foi adaptado de um estudo anterior do nosso grupo5,onde foram descritas as culturas embrionárias do neurônio cortical-glia e do neurônio enriquecidos com neurônios e as duas culturas caracterizadas. Usando essas culturas, Roque et al. descobriram que os astrócitos desempenham um pa...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm conflito de interesses.

Agradecimentos

Os autores reconhecem o apoio de financiamento da Fundação para a Ciência e da Tecnologia por meio dos Projetos UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 e a bolsa SFRH/BD/135936/2018 à JP, por ''Programa Operacional do Centro, Centro 2020' através do projeto CENTRO-01-0145-FEDER-000013 e financiamento para a Plataforma PPBI-Português de Bioimagem através do Projeto POCI-01-0145-FEDER-022122.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placas de cultura de 24 poçosThermo Fischer Scientific142475
95% N2/5% CO2 cilindro de gásArLí quido
Anti-mouse conjugado com Alexa Fluor 488InvitrogenA11001diluição 1/1000; período de incubação - 1 h à temperatura ambiente
Anti-coelho conjugado com Alexa Fluor 546InvitrogenA11010diluição 1/1000; período de incubação - 1 h à temperatura ambiente
suplemento B27 (50x)Gibco17504-044
Dako Fluorescência Meio de MontagemDakoS3023
D-glicose anidraFisher ScientificG/0450/603.4 g/L
Microscópio de epifluorescênciaZeissAxioObserver Z1x63x objetivo
Fetal Soro Bovino (FBS)BiochromS061510%
GentamicinaSigma-AldrichG1272120 µ g/mL
de GlutamatoSigma-AldrichG8415 25µ M
GlutaminaSigma-AldrichG31260.5 mM
Hoechst 33342InvitrogenH13992 µ M; período de incubação - 10 min à temperatura ambiente
Câmara de incubação de hipóxiaStemcell Technologies27310Câmara usada para indução de OGD
Insulina do pâncreas bovinoSigma-AldrichI55005 mg/L
CetaminaSigma-AldrichK-00287,5 mg/Kg
Mínimo Essencial Médio Eagle médioSigma-AldrichM0268aquecer até 37 &graus; C antes do uso
Mouse Anti-MAP2Santa Cruz BiotechnologySc-74421diluição de 1/500; período de incubação durante a noite a 4 &graus; C
Meio neurobasalGibco21103-049aquecer até 37 > C antes
do uso Pastilhas de parafina para histologiaSigma-Aldrich1.07164Ponto de solidificação 56-58° C
ParaformaldeídoSigma -AldrichP61484% em PBS
Penicilina/EstreptomicinaBiochromA 2213penicilina (12U/mL) /estreptomicina (12µ g / mL)
Poli-D-lisinaSigma-AldrichP1024
Rabbit Anti-GFAPDAKOZ03341/2000 diluição; período de incubação durante a noite a 4 ° C
Hidrogenocarbonato de sódioFisher ScientificS/4240/602.2g/L
XylazineSigma-AldrichX112612 mg/Kg

Referências

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