Este método demonstra o uso da técnica de hibridização do norte para detectar miRNAs a partir do extrato total de RNA.
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Artigo de método
Análise de blot de RNA para detecção e quantificação de MicroRNAs vegetais
Neste artigo
Resumo
Resumo
MicroRNAs (miRNAs) são uma classe de não codificação expressa endógenamente expressa, ~21 nt pequenos RNAs envolvidos na regulação da expressão genética em plantas e animais. A maioria dos miRNAs atuam como interruptores negativos de expressão genética visando genes-chave. Nas plantas, as transcrições miRNAs primárias (pri-miRNAs) são geradas pela polimerase RNA II, e formam diferentes comprimentos de estruturas estáveis de laço-tronco chamadas pré-miRNAs. Uma endonuclease, semelhante a Dicer1, processa os pré-miRNAs em duplexes miRNA-miRNA*. Um dos fios do duplex miRNA-miRNA* é selecionado e carregado na proteína Argonaute 1 ou seus homólogos para mediar o decote dos mRNAs alvo. Embora os miRNAs sejam moléculas-chave de sinalização, sua detecção é frequentemente realizada por métodos baseados em PCR menos que ideais em vez de uma análise sensível da mancha do norte. Descrevemos um método norte simples, confiável e extremamente sensível que é ideal para a quantificação dos níveis de miRNA com sensibilidade muito alta, literalmente de qualquer tecido vegetal. Além disso, este método pode ser usado para confirmar o tamanho, estabilidade e a abundância de miRNAs e seus precursores.
Introdução
A recente descoberta de pequenas RNAs regulatórias, microRNAs, tem liderado pesquisas para entendê-las e seu papel em plantas e animais1. Precursores longos de miRNAs são processados em miRNAs maduros de 21 a 24 nt por HYL1 e proteínas específicas semelhantes a dicer2,,3. Um miRNA de 22 nt pode iniciar o silenciamento em cascata gerando siRNAssecundárias 4. Estudos têm mostrado o papel das miRNAs e siRNAs secundárias no desenvolvimento, destino celular e respostas ao estresse5,6.
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Protocolo
1. Preparação de um gel de poliacrilamida de 15% de desnaturação
- Pesar e adicionar 4,8 g de ureia, adicionar 3,75 mL de 40% de acrilamida: solução bisacrilamida (19:1) e 1 mL de 10x TBE pH 8.2 em um tubo estéril de 50 mL.
- Dissolva a ureia usando um banho de água a 60 °C em uma solução clara.
- Recarrege o volume para 10 mL usando água estéril recém-autoclavada e esfrie a mistura de gel à temperatura ambiente.
- Prepare a solução fresca de persulfito de amônio de 10% (p/v).
2. Montagem das placas de vidro e unidade de eletroforese
- Lave todos os aparelhos necessários para a eletroforese do g....
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Resultados
Nesta demonstração, detectamos e quantificamos a expressão do miR397 em diferentes tecidos de arroz indica var whiteponni(Figura 1). miR397 é um miRNA de 22 nt e miRNA conservado. A expressão do miR397 pode ser detectada em todas as amostras testadas. De acordo com os dados de sequenciamento de próxima geração, a amostra 1 (tecido de mudas) tem miR397 a 5 leituras por milhão (rpm). Detectamos seu sinal confortavelmente, indicando que o método é muito sensível e pode ser usa.......
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Discussão
Este método pode ser amplamente utilizado para detecção e quantificação de pequenos RNAs, incluindo miRNAs menos abundantes. O protocolo descreve principalmente os passos para desnaturar o RNA total em um buffer de carregamento, separação de tamanho por eletroforese de gel, transferência de RNA para uma membrana, cruzar o RNA para a membrana e hibridizar usando sondas oligo chamadas radiolabeled desejadas.
O passo crítico para qualquer experimento de manchas é o uso de RNA de boa qualidade par.......
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Divulgações
Nenhum conflito de interesses declarado.
Agradecimentos
Os autores reconhecem o acesso ao laboratório de radiação fornecido pelo instituto anfitrião e pelo BRIT para radioisótopos. O laboratório PVS é apoiado pelo Centro Nacional de Ciências Biológicas do Instituto Tata de Pesquisa Fundamental e bolsas (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) do Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia. MP reconhece DBT-Research Associateship, DBT, Governo da Índia.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução de acrilamida-bisacrilamida a 40% | Sigma | A9926 | |
| Persulfato de amônio (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Papel mata-borrão | whatmann papel mata-borrão I | 1001-125 | |
| Azul de bromofenol | Sigma | B5525-5G | |
| Pontas de carregamento capilar | BioRad | 2239915 | |
| Deionizado formamida | Ambion | AM9342 | |
| Bloco de aquecimento | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N + membrana de nylon | GE | RPN203B | |
| Frasco de hibridização | Sigma | Z374792-1EA | |
| Forno de hibridização | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N, N, N ', N'-Tetrametiletilenodiamina (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Scanner de tufão | 29187194 | |
| tela e PhosphorImager | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipetas | Gilson, modelos: P20 e P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Pipeta de plástico | Falcon | 357550 | |
| Aparelho de gel de poliacrilamida | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 coluna | GE | 27532501 | |
| Speed Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot aparelho | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb tampão de hibridização | Ambion | AM8670 | |
| Ureia | Fischer Scientific | 15985 | |
| Reticulador UV UVP | CL-1000L | ||
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Banho-maria | NEOLAB | D-8810 | |
| Xileno cianol | Sigma | X4126-10G |
Referências
- Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431, 356-363 (2004).
- Anushree, N., Shivaprasad, P. V. Regulation of Plant miRNA Biogenesis. Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).
- Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V.
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Reimpressões e permissões
