Este protocolo é um método eficiente, econômico e robusto de isolar microglia primária de tecido cerebral vivo, adulto e humano. A microglia humana primária isolada pode servir como ferramenta para estudar processos celulares em homeostase e doenças.
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Artigo de método
Obtenção de Microglia Humana de Tecido Cerebral Humano Adulto
Neste artigo
Resumo
Resumo
Microglia são células imunes inatas residentes do sistema nervoso central (SNC). A microglia desempenha um papel crítico durante o desenvolvimento, na manutenção da homeostase, e durante a infecção ou lesão. Vários grupos de pesquisa independentes têm destacado o papel central que a microglia desempenha em doenças autoimunes, síndromes autoinflamatórias e cânceres. A ativação da microglia em algumas doenças neurológicas pode participar diretamente de processos patogênicos. A microglia primária é uma ferramenta poderosa para entender as respostas imunes no cérebro, interações células-células e fenótipos de microglia desregulados na doença. Microglia primária imita propriedades microgliais in vivo melhor do que linhas de células microgliais imortalizadas. Microglia adulta humana apresenta propriedades distintas em comparação com microglia fetal e roedora humana. Este protocolo fornece um método eficiente para o isolamento da microglia primária do cérebro humano adulto. Estudar essas microglias pode fornecer insights críticos sobre as interações célula-células entre microglia e outras populações celulares residentes no CNS, incluindo oligodenrócitos, neurônios e astrócitos. Além disso, a microglia de diferentes cérebros humanos pode ser cultivada para caracterização de respostas imunes únicas para medicina personalizada e uma miríade de aplicações terapêuticas.
Introdução
O sistema nervoso central (SNC) é construído de uma complexa rede de neurônios e células gliais1. Entre as células gliais, a microglia funciona como as células imunes inatas do CNS2,3. A Microglia é responsável pela manutenção da homeostase no CNS4saudável . A microglia também desempenha um papel importante no neurodesenvolvimento, podando as sinapses2. A microglia é central para a fisiopatologia de várias doenças neurológicas, incluindo, mas não restritas; Doença de Alzheimer5, Doença de Parkinson....
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Protocolo
Todos os tecidos foram adquiridos após liberação ética dos comitês de ética do Instituto Indiano de Tecnologia Jodhpur e do All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur.
1.Aquisição e processamento de tecidos (Dia 0)
- Colete o tecido em um tubo de 50 mL contendo 10 mL de líquido cerebrospinal artificial gelado (aCSF) (2 mM CaCl2∙2H2O, 10 mM de glicose, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2∙6H2O, 202 mM de sacarose)20. Certifique-se de que o tubo é mantido no gelo se o tecido precisar ser transferido para um l....
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Resultados
Usando o protocolo acima mencionado (Figura 1), conseguimos isolar microglia humana primária de tecidos cerebrais ressecados cirurgicamente vivos. As células cultivadas foram manchadas com Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) lectina para microglia (verde) e com proteína ácida fibrilar glia (GFAP) para astrócitos (vermelho) (Figura 2) como descrito anteriormente22,23<.......
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Discussão
Microglia garante homeostase no cérebro normal e desempenha papéis centrais na fisiopatologia de várias doenças neurológicas4. Microglia são centrais para o neurodesenvolvimento e formação de sinapses2. Estudos microgliais têm se mostrado fundamentais na compreensão do desenvolvimento e progressão de diversas doenças neurológicas4. A microglia de roedores é o modelo predominante de escolha para estudos microgliais primários, embora, a microglia de ro.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
O laboratório da SJ foi criado com subvenções institucionais da IITJ e é financiado por subvenções do Departamento de Biotecnologia (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) e do Ministério de Eletrônica e Tecnologia da Informação do Governo da Índia (nº 4(16)/2019-ITEA). As seções de tecido cerebral humano foram obtidas do All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur após a liberação do Comitê de Ética Institucional. Agradecemos a Mayank Rathor, membro do B.Tech Student da Design and Arts Society IIT Jodhpur, pelo apoio à videografia.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução antibiótica-antimicótica | Himedia | A002 | |
| Cloreto de cálcio | Sigma | 223506 | |
| Centrífuga (4 ° C) | Tubos | Sigma 146532 | |
| Abdos | P10203 | ||
| CO2< / sub> incubadora | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM com glutamina | Himedia | AL007S | |
| Soro bovino fetal | Himedia | RM9955 | |
| Tubo de frasco (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluoresceína Ricinus communis aglutinina-1 | Vector | FL-1081 | |
| Microscópio fluorescente | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield com DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP anticorpo | GA5 | 3670S | |
| Incubadora | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 linha celular | ATCC | NCTC clone 929 [célula L, L-929, derivado da cepa L] (ATCC CCL-1) | |
| Fluxo de ar laminar | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Cloreto de magnésio | Himedia | MB040 | |
| Fosfato monossódico | Merck | 567545 | |
| Mistura de nutrientes F-12 Presunto Médio | Himedia | Al106S | |
| Placa de Petri | Duran Grupo | 237554805 | |
| Solução salina tamponada com fosfato | Himedia | ML023 | |
| Cloreto | de potássioHimedia | MB043 | |
| Pipeta sorológica | Labware LW-SP1010 | ||
| Bicarbonato de sódio | Himedia | MB045 | |
| Sacarose | Himedia | MB025 | |
| Filtro de seringa (0,2μ, 25 mm de diâmetro) | Frascos de | SFPV25R | |
| T-25 adequados para cultura de células aderentes. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Tripsina-EDTA (0,25%) | Gibco | Rolamento 25200-056 |
Referências
- Allen, N. J., Barres, B. A. Glia - more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
- Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9
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Reimpressões e permissões
