Obtenção de Microglia Humana de Tecido Cerebral Humano Adulto

O sistema nervoso central (SNC) é construído de uma complexa rede de neurônios e células gliais¹. Entre as células gliais, a microglia funciona como as células imunes inatas do CNS^2,3. A Microglia é responsável pela manutenção da homeostase no CNS⁴saudável . A microglia também desempenha um papel importante no neurodesenvolvimento, podando as sinapses². A microglia é central para a fisiopatologia de várias doenças neurológicas, incluindo, mas não restritas; Doença de Alzheimer⁵, Doença de Parkinson⁶, derrame⁷, esclerose múltipla^8,lesão cerebral traumática^9,dor neuropática^10,lesão medular¹¹ e tumores cerebrais como gliomas¹².

Estudos relacionados à homeostase e doenças do CNS utilizam microglia de roedores devido à escassez de protocolos de isolamento primário primário humano¹³. A microglia de roedores se assemelha à microglia humana primária na expressão de genes como Iba-1, PU.1, DAP12 e receptor M-CSF e tem sido eficaz na compreensão do cérebro normal e doente¹³. Curiosamente, a expressão de vários genes relacionados imunológicos como TLR4, MHC II, Siglec-11 e Siglec-3 varia entre microglia humana e^{roedora 13}. A expressão de vários genes também varia na expressão temporal e em doenças neurodegenerativas em ambas as espécies^14,15. Essas diferenças significativas fazem da microglia humana um modelo essencial para estudar a função da microglia na homeostase e na doença. A microglia humana primária também pode ser uma ferramenta eficaz para a triagem pré-clínica de potenciais candidatos a medicamentos¹⁶. As razões acima mencionadas sublinham a crescente necessidade de protocolos econômicos para o isolamento da microglia humana primária.

Desenvolvemos um protocolo para isolamento da microglia humana primária do tecido cerebral humano adulto coletado como resultado de uma janela cirúrgica criada para ressecções tumorais ou outras ressecções cirúrgicas. O método aqui é consideravelmente diferente dos métodos existentes. Conseguimos isolar e cultivar microglia após um tempo de trânsito de cerca de 75 minutos do local de coleta de tecidos para iniciar o protocolo de isolamento em laboratório. Usamos o supernascer de células fibroblastos L929 para promover o crescimento de microglia isolada. Este método foca especificamente na cultura e desenvolvimento apenas de microglia primária. A cultura resultante preparada é de cerca de 80% de microglia. Enquanto outros protocolos fornecem uma cultura enriquecida de microglia por centrífuga de gradiente de densidade, citometria de fluxo e contas magnéticas, o protocolo é uma maneira rápida, simples, robusta e econômica de cultivar microglia humana primária^{17,,18,,19,,20}. A capacidade de utilizar tecido cerebral adulto vivo removido cirurgicamente em vez de tecidos cerebrais fixos de cadáveres prova uma vantagem adicional deste método em contraste com os procedimentos existentes^18,,21.

Todos os tecidos foram adquiridos após liberação ética dos comitês de ética do Instituto Indiano de Tecnologia Jodhpur e do All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur.

1.Aquisição e processamento de tecidos (Dia 0)

1. Colete o tecido em um tubo de 50 mL contendo 10 mL de líquido cerebrospinal artificial gelado (aCSF) (2 mM CaCl₂∙2H₂O, 10 mM de glicose, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 2,5 mM NaH₂PO₄, 1 mM MgCl₂∙6H₂O, 202 mM de sacarose)²⁰. Certifique-se de que o tubo é mantido no gelo se o tecido precisar ser transferido para um local diferente.
   NOTA: Prepare aCSF em água destilada autoclavada. Filtre-o com filtro de seringa de 0,22 μm no capô laminar. Isso pode ser armazenado por 1 mês a 4 °C.
2. Limpe o tubo de coleta cuidadosamente com 70% de álcool e transfira para uma câmara de fluxo de ar asséptico laminar.
3. Descarte a ACSF cuidadosamente e pese tecido em uma condição asséptica. O peso tecidual é essencial para calcular o volume de trypsin-EDTA necessário para etapas subsequentes.
4. Mantenha o tecido em aCSF quente fresco a 37 °C por 5 minutos. Este passo é fundamental para evitar a morte celular.
5. Descarte aCSF e lave o tecido uma vez com 1x PBS (salina tamponada de fosfato) a 37 °C. Certifique-se de que todo o sangue seja lavado com lavagens repetidas da PBS (conforme necessário).
6. Incubar o tecido em PBS quente, a 37 °C, por 5 min.
7. Descarte a PBS cuidadosamente e transfira tecido para uma placa de Petri esterilizada. O PBS pode ser removido com uma pipeta. Isso evitará qualquer perda de tecido.
8. Pique o tecido em pedaços pequenos (pelo menos 1 mm³) usando um bisturi estéril. O tecido finamente picado fornece maior área de superfície tecidual para dissociação tecidual, garantindo maior rendimento.
9. Transfira o tecido picado para um tubo de 50 mL contendo tecido de 10 mL/g de 0,25% trypsin-EDTA e misture por pipetação através de uma pipeta sorológica de 10 mL. Adicione 2 mL de trippsina/EDTA a uma placa de Petri e lave bem a placa com a ajuda da pipeta. Adicione este trypsin de volta ao tubo falcão. Isso minimiza a perda de tecido e células durante o dicing.
10. Incubar o tubo em um agitador por 30 minutos a 37 °C a 250 rpm. Esta etapa aumenta a dissociação das células do tecido.
11. Ao final da incubação, adicione 10 mL de meio neutralizante (50% DMEM/50% F12 com glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 10% FBS) para neutralizar a trippsina. Misture com uma pipeta sorológica de 10 mL. A quantidade de mídia neutralizante adicionada deve ser igual à quantidade de trippsina usada.
12. Centrifugar o tubo a 2.000 x g a 4 °C por 10 minutos.
13. Descarte o supernasciante e suspenda a pelota em 1 mL de cultura média (50% DMEM/50% F12 com glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 20% supernanato L929, 10% FBS).
    NOTA: As células L929 são cultura no DMEM (DMEM com glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 10% FBS). O método de cultura recomendado pela ATCC deve ser seguido para a cultura celular. O supernascido deve ser coletado do frasco de cultura que é pelo menos 75% confluente. Pode ser coletado a granel e armazenado a -80 °C para evitar a degradação dos fatores de crescimento. Recomenda-se adicionar L929 supernacido separadamente em frascos em vez de adicionar ao meio de cultura de estoque.
14. Emplaque as células em um frasco T-25, adequado para células aderentes, e adicione 4 mL de meio de cultura adicional. Incubar o frasco a 37 °C com 5% de CO₂. Agite cuidadosamente o frasco para dispersar o tecido de forma homogênea. Evite trazer a mídia para o pescoço do frasco, enquanto treme, pois isso pode aumentar as chances de contaminação.

2.Cultura celular (dia 2)

1. Colete a mídia do frasco de cultura T-25 preparado no dia 0 em três tubos de centrífugas de 1,5 mL coletando o mesmo volume de mídia em cada tubo. Lave o frasco uma vez com 1 x PBS. Agite o frasco suavemente para remover quaisquer fragmentos de tecido remanescentes deixados. Evite o tremor severo do frasco, pois qualquer fragmento remanescente não afetará negativamente a cultura. Adicione 5 mL de mídia de cultura fresca ao frasco.
2. Centrifugar a mídia coletada a 1.466 x g (4000 rpm) a 4 °C por 4 minutos.
3. Descarte o supernasal de cada tubo e adicione 1 mL de meio de cultura a um dos tubos. Misture bem com a pipeta. Adicione em série a mídia mista com células a outros tubos. Misture bem com a pipeta e misture as células em um tubo.
4. Coloque as células em um frasco T-25 separado, adequado para células aderentes. Adicione 4 mL de cultura média e incubar o frasco a 37 °C com 5% de CO₂.

3.Cultura celular (dia 4)

1. Descarte a mídia de ambos os frascos e adicione 5 mL frescos de mídia cultural ao frasco.
2. Incubar o frasco a 37 °C com 5% de CO₂ durante 2 dias.

4. Cultura Celular (Dia 6)

1. As células estarão prontas para mais experimentos.

Usando o protocolo acima mencionado (Figura 1), conseguimos isolar microglia humana primária de tecidos cerebrais ressecados cirurgicamente vivos. As células cultivadas foram manchadas com Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) lectina para microglia (verde) e com proteína ácida fibrilar glia (GFAP) para astrócitos (vermelho) (Figura 2) como descrito anteriormente22,23,24,,25,26. 4′,6-diamidino-2-fenilômado (DAPI) foi usado para manchar núcleos (azul). No sexto dia do início do experimento, as células estavam prontas para mais experimentos. As células manchadas foram contadas cegas para microglia e astrócitos presentes na cultura. Cerca de 80% da cultura primária eram microglia (Figura 2).

Figura 1: Esquema do isolamento primário de microglia do cérebro adulto. O tecido removido cirurgicamente foi coletado em gelo frio de 10 mL de aCSF em um tubo de 50 mL e transferido para o laboratório. O tecido foi lavado com aCSF e PBS, respectivamente e finamente cortado, dissociado com a ajuda de trypsin-EDTA e banhado em um frasco T-25. No segundo dia, a mídia foi coletada e centrifuada. Pellet foi misturado em mídia fresca e banhado em um frasco T-25. A nova mídia foi adicionada ao primeiro frasco. A mídia foi alterada em ambos os frascos em dias alternados. As células estavam prontas para mais experimentos no dia 6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imunocitoquímica de microglia humana primária isolada. (A) Células isoladas foram banhadas em um escorregador de duas câmaras de poço e foram manchadas com GFAP para astrócitos (painel verde-primeiro) ou RCA para microglia (painel green-second). Os núcleos estavam manchados de azul com DAPI. O controle de RCA e controle secundário de anticorpos para GFAP é mostrado no inset. (B) As células isoladas foram banhadas em um escorregador de câmara de dois poços e foram manchadas com RCA para microglia (verde) e GFAP para astrócitos (vermelho). A segunda linha mostra o controle para RCA e controle secundário de anticorpos para GFAP. Os núcleos estavam manchados de azul com DAPI. (C) As células foram contadas pelo controle cego. Quantificação é representativa da contagem por um controle cego. Cerca de 80% das células eram microglia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.