Artigo de método

Diferenciação e caracterização de progenitores neurais e neurônios de células-tronco embrionárias do rato

DOI:

10.3791/61446

⸱

15 de maio de 2020

 ,  ,  , 
1Departments of Biochemistry and Molecular Biology, Penn State College of Medicine, Penn State Hershey Cancer Institute

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descrevemos o procedimento para a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias do rato em células neuronais usando o método de queda de suspensão. Além disso, realizamos uma análise fenotípica abrangente através do RT-qPCR, imunofluorescência, RNA-seq e citometria de fluxo.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descrevemos o procedimento passo-a-passo para cultivar e diferenciar células-tronco embrionárias do camundongo em linhagens neuronais, seguido por uma série de ensaios para caracterizar as células diferenciadas. As células-tronco embrionárias do rato E14 foram usadas para formar corpos embrionários através do método de queda suspensa, e então induzidas a se diferenciar em células progenitoras neurais por ácido retinóico, e finalmente diferenciadas em neurônios. A reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa quantitativa (RT-qPCR) e os experimentos de imunofluorescência revelaram que os progenitores e neurônios neurais exibem marcadores correspondentes (nestin para progenitores neurais e neurofilamento para neurônios) nos dias 8 e 12 pós-diferenciação, respectivamente. Experimentos de citometria de fluxo em uma linha E14 expressando um repórter gfp orientado pelo promotor Sox1 mostraram que cerca de 60% das células no dia 8 são GFP positivas, indicando a diferenciação bem sucedida das células progenitoras neurais nesta fase. Finalmente, a análise do RNA-seq foi utilizada para traçar o perfil das alterações transcriômicas globais. Esses métodos são úteis para analisar o envolvimento de genes e caminhos específicos na regulação da transição da identidade celular durante a diferenciação neuronal.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Desde sua primeira derivação da massa celular interna dos blastocistos do camundongo em desenvolvimento1,2, as células-tronco embrionárias do rato (mESC) têm sido usadas como ferramentas poderosas para estudar a autoconexão e diferenciação das células-tronco3. Além disso, estudar a diferenciação do MEESC leva a uma tremenda compreensão dos mecanismos moleculares que podem melhorar a eficiência e a segurança na terapia baseada em células-tronco no tratamento de doenças como distúrbios neurodegenerativos4. Em comparação com os modelos animais, este sistema in vitro oferece muitas vantagens, incluindo simplicidade na prática e avaliação, baixo custo na manutenção de linhas celulares em contraste com os animais e relativa facilidade em manipulações genéticas. No entanto, a eficiência e a qualidade dos tipos de células diferenciadas são frequentemente afetadas por diferentes linhas de mESCs, bem como pelos métodos de diferenciação5,6. Além disso, os ensaios tradicionais para avaliar a eficiência de diferenciação dependem do exame qualitativo de genes marcadores selecionados que carecem de robustez e, portanto, não conseguem compreender as mudanças globais na expressão genética.

Aqui pretendemos usar uma bateria de ensaios para avaliação sistemática da diferenciação neuronal. Utilizando ambas as análises in vitro tradicionais em marcadores selecionados e RNA-seq, estabelecemos uma plataforma para medição da eficiência de diferenciação, bem como as alterações transcriômicas durante este processo. Com base em um protocolo previamente estabelecido7,geramos corpos embrionários (EBs) através da técnica de queda suspensa, seguidos pela indução usando quantidade suprafisiológica de ácido retinóico (RA) para gerar células progenitoras neurais (NPCs), que foram posteriormente diferenciadas aos neurônios com meio de indução neural. Para examinar a eficiência da diferenciação, além dos ensaios tradicionais de RT-qPCR e imunofluorescência (IF), realizamos RNA-seq e citometria de fluxo. Essas análises fornecem uma medição abrangente da progressão da diferenciação específica do estágio.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. cultura mESC

  1. Cubra uma placa tratada com 10 cm de tecido com gelatina de 0,1% e deixe que a gelatina se estafina por pelo menos 15-30 minutos antes de aspirar.
  2. Sementes γ camundongos embrionários (MEFs) um dia antes de cultivar os mESCs no meio mESC pré-aquecido (médio águia modificado de Dulbecco (DMEM) com 15% de soro bovino fetal (FBS), aminoácidos não essenciais, β-mercaptoetanol, L-glutamina, penicilina/estreptomicina, piruvato de sódio, LIF, PD0325901 (PD) e Chir99021 (CH)).
  3. Permita que os MEFs irradiados de γ se acomodem e se anexem à superfície da placa antes de estancar as células E14.
  4. Descongele E14 ESCs em banho-maria de 37 °C e transfira rapidamente as células em um tubo cônico de 15 cm com meio mESC quente. Pelota as células a 200 x g por 3 min e remova o supernasce.
  5. Resuspengem as células em 10 mL de mESC médio e emplaque as células na placa de cultura contendo os MEFs irradiados γ anteriormente. Incubar a cultura celular em uma incubadora de 37 °C abaixo de 5% de CO2.
  6. Para a passagem de cultura, aspire e o médio e lave a placa com 1x PBS estéril. Adicione 0,05% de trippsina suficiente para cobrir a superfície da placa e incubar a 37 °C por 3 min.
  7. Neutralizar a trippsina com mESC médio e pipeta para gerar suspensão unicelular. Centrifugar as células a 200 x g por 3 min e remover o supernante.
  8. Conte as células com um hemótmetro ou contador de células e sementes cerca de 5,0 x 105 células em uma placa de cultura de 10 cm.
  9. Resuspenque as células em 10 mL de mESC médio, plaque as células na placa de cultura de tecido revestida de gelatina e incuba culturas como descrito anteriormente.
    NOTA: Recomenda-se que os mESCs sejam aprovados a cada 2 dias para evitar que as células se diferenciem em suas colônias. O fenol vermelho no médio funciona apenas como um indicador de pH e dependendo da densidade celular, pode ficar amarelado (mais ácido), mais cedo do que 2 dias. Portanto, pode ser necessário mudar o meio todos os dias. Os MEFs irradiados γ acabarão morrendo depois de algumas passagens.

2. EB, NPC e diferenciação de neurônios

  1. Executar o protocolo de passagem de cultura mencionado anteriormente e contar as células (etapas 1.7-1.10).
  2. Método de queda de suspensão(dia 0)
    1. Para uma placa de cultura celular de 10 cm, contar cerca de 2,5 x 104 células onde 5,0 x 10 2 célulasserão suspensas em 20 μL de diferenciação (DMEM com 15% de FBS, aminoácidos não essenciais, β-mercaptoetanol, L-glutamina, penicilina/estreptomicina e pirudo de sódio). Cerca de 50 gotículas de 20 μL contendo as células podem ser banhadas em uma placa de 10 cm.
    2. Alíquotar o número apropriado de células, e então centrifugar as células a 200 x g por 3 min e remover o supernante.
    3. Resuspenncie as células no volume adequado do meio de diferenciação para uma densidade celular de 5,0 x 102 células por 20 μL (por exemplo, 2,5 x 104 células em 1 mL de meio de diferenciação).
    4. Usando uma micropipette ou uma pipeta repetidora, coloque 20 gotículas de μL da suspensão celular na tampa da placa de cultura tecidual. Certifique-se de que as gotículas não estão muito próximas umas das outras para evitar que elas se fundam.
      NOTA: As gotículas podem ser banhadas em uma placa de fixação tratada com cultura tecidual ou placa de suspensão, pois serão colocadas na tampa e não na placa em si. Para uma abordagem mais viável e estéril, plaque as gotículas em uma placa de cultura tecidual de fixação e transfira-as para uma placa de suspensão como descrito abaixo.
    5. Encha a placa com 5-10 mL de 1x PBS e coloque cuidadosamente a tampa de volta na placa. Incubar a cultura na incubadora de 37 °C.
      NOTA: O PBS é adicionado à placa de cultura para evitar que as gotículas sequem.
  3. No dia 2,use uma micropipette para coletar as gotículas da tampa e colocá-las em uma placa de suspensão de cultura celular de 10 cm preenchida com 10 mL de meio de diferenciação. Incubar a cultura em um agitador orbital tremendo em baixa velocidade na incubadora.
  4. No dia 4, para colher os EBs, coletar as células, centrífugas a 200 x g por 3 min, e remover o sobrenante.
    NOTA: Os EBs também podem ser lavados com 1x PBS de acordo com os requisitos dos experimentos subsequentes.
  5. Para continuar o procedimento e induzir a diferenciação do EB em células progenitoras neurais (NPCs), prepare o meio de diferenciação com ácido retinóico de 5 μM (RA).
  6. Remova o meio antigo pelo menos os EBs a 100 x g por 3 min ou deixe que os EBs se acomodem antes de aspirar o meio antigo. Adicione 10 mL do meio de diferenciação contendo RA de 5 μM à placa de cultura.
  7. No dia 6,substitua pelo menos metade do meio por meio fresco contendo RA de 5 μM, inclinando a placa e pipetando o meio como descrito acima.
    NOTA: Recomenda-se que pelo menos metade do meio seja substituída por um meio fresco contendo RA nos dias 5 e 7. Tome nota do indicador vermelho fenol; se ficar amarelado, é melhor substituir todo o meio.
  8. No dia 8,colhe os NPCs coletando as células, centrifugando a 200 x g por 3 min, e removendo o sobrenante.
    NOTA: Os NPCs também podem ser lavados com 1x PBS de acordo com as necessidades de experimentos subsequentes. Se necessário, os NPCs podem ser congelados e descongelados novamente para cultura e análise posteriores. Se os NPCs forem cultivados, a accutase também pode ser usada como alternativa à trippsina.
  9. Para continuar o procedimento e diferenciar os NPCs em neurônios, colete NPCs em um tubo cônico de 15 mL por centrifugação, dissociá-los com trippsina e incuba-los a 37 °C por 3 min. Pipetar os NPCs para garantir que todos os agregados de NPC sejam dissociados e neutralizar o trypsin com o meio.
  10. Filtre as células com coador de células de nylon de 40 μm e conte as células antes de emplacar-as a uma densidade de 1,5 x 105/cm2 em n2 médio (médio DMEM/F12 + 3 mg/mL de glicose + 3 mg/mL rico em lipídios albumina de soro bovino (LBSA) + 1:100 Suplemento N2 + 10 ng/mL bFGF + 50 U/mL pen/strep + 1 mM L-glutamine) em uma placa tratada de cultura tecidual para experimentos subsequentes de PCR e blot ocidental; ou em uma câmara de cultura de tecidos para experimentos de imunofluorescência.
  11. No dia 9,substitua o antigo meio por um novo meio N2.
  12. No dia 10,troque o n2 médio com n2/B27 médio (50% DMEM/F12 e 50% basal neural, 3 mg/mL LBA, 1:200 N2 suplemento, 1:100 B27 suplemento, 50 U/mL caneta/estreptococos, e 1 mM L-glutamina).
  13. Nos dias 11-12,colhe os neurônios da seguinte forma. Lave as células com 1x PBS, adicione trippsina e incuba a cultura na incubadora de 37 °C por 3 minutos antes de neutralizar a trippsina com média e centrífuga a 200 x g por 3 min.

3. Caracterização de mESCs e células diferenciadas

  1. Ensaio de fosfatase alcalina (AP)
    1. Use um kit para avaliar a atividade de fosfates alcalina (ver tabela de materiais).
    2. Retire o meio da placa de cultura e lave os ESCs com 1x PBS.
    3. Adicione 1 mL da solução fixa (consiste em formaldeído e metanol) fornecido com o kit à placa e incuba-o à temperatura ambiente por 2-5 min.
      NOTA: A super incubação na solução de correção pode comprometer a atividade AP.
    4. Remova a solução de correção, lave os ESCs com 1x PBS e deixe alguma quantidade de PBS na placa.
      NOTA: Mantenha os ESCs úmidos no PBS para não comprometer a atividade ap.
    5. Prepare a solução AP misturando as soluções de substrato A, B e C na proporção 1:1:1. Misture primeiro as soluções A e B e incubar a mistura à temperatura ambiente por 2 minutos antes de adicionar a solução C.
    6. Remova o PBS 1x e adicione a solução AP preparada anteriormente.
    7. Incubar os ESCs por cerca de 15 minutos no escuro, embrulhando a placa de cultura com papel alumínio ou realizando o passo 3.5 em uma sala escura.
    8. Monitore a reação e remova a solução de reação quando a solução ficar brilhante para evitar manchas não específicas.
    9. Lave os ESCs duas vezes com 1x PBS.
    10. Evite que a amostra seque, cobrindo os ESCs com 1x PBS ou meio de montagem.
      NOTA: Uma mancha vermelha ou roxa aparecerá para a expressão AP. A placa pode ser armazenada em uma geladeira de 4 °C.
  2. RT-qPCR
    1. Coletar células em vários estágios seguindo as etapas 1.6-1.7 e 2.4 para ESCs e EBs e NPCs, respectivamente.
    2. Isolar o RNA usando solução de RNA, DNA e extração de proteínas (ver Tabela de Materiais).
    3. Gerar cDNA com um kit de transcriptase reversa (ver a Tabela de Materiais) e seguir o manual do fabricante.
  3. Fixação e incorporação
    1. Colher EBs e NPCs conforme descrito acima (passo 2.6) e corrigi-los com solução de paraformaldeído (PFA) de 4% em 1x PBS por 30 minutos à temperatura ambiente.
    2. Retire o PFA e lave a amostra com 1x PBS por 5 minutos.
    3. Coloque a amostra em uma diluição serial de 1x PBS, 10%-, 20%-, e 30% de soluções de sacarose a 25\u201228 °C onde a amostra é transferida para a próxima solução após 30 minutos de incubação.
      NOTA: A amostra pode ser armazenada na solução de sacarose de 30% a 4 °C antes de continuar com a etapa de incorporação.
    4. Molhe a ponta da pipeta com solução de sacarose antes de colocar a amostra (sem empilhá-las) no centro do molde crio-mold e pipeta para fora do excesso de líquido.
      NOTA: O papel do filtro também pode ser usado para remover a solução em excesso. Molhar a ponta da pipeta com solução de sacarose é importante para evitar que os EBs e NPCs grudem nas paredes da ponta.
    5. Adicione cuidadosamente a solução de temperatura de corte (OCT) ideal ao molde sem reutilizar as amostras e remova bolhas em excesso com uma pipeta.
    6. Coloque o molde com a amostra em uma batedeira de laboratório em baixa velocidade para agitar levemente a amostra por 15 minutos. Isso ajuda a resolver os EBs e NPCs até o fundo se eles forem resuspensados na solução OCT.
    7. Congele rapidamente a amostra colocando o molde em nitrogênio líquido ou em gelo seco.
      NOTA: As amostras podem ser armazenadas em um congelador de -70 °C antes de continuar para o próximo passo.
  4. Criocendo
    1. Defina o criostat para esfriar para -20 a -18 °C antes de transferir a amostra para o instrumento.
    2. Retire o bloco OCT congelado do molde e fixe-o no suporte com uma pequena solução oct colocada na superfície do suporte.
    3. Alinhe o bloco OCT para que os EBs e NPCs estejam mais próximos da lâmina para garantir que a amostra não seja perdida durante a secção.
    4. Seção cuidadosa 10 μm do bloco e preste muita atenção às fatias que contêm a amostra.
    5. Coloque rapidamente a fatia OCT contendo a amostra no slide de vidro de incorporação de tecido e permita que as fatias de OCT sequem ao ar por 1 h à temperatura ambiente.
      NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -70 °C para uso posterior.
  5. Imunofluorescência (IF)
    1. Bloco de seções OCT ou câmaras de cultura contendo neurônios em soro de burro 10% normal/0,1% Triton X-100 em 1x PBS por 1 h à temperatura ambiente.
    2. Incubar as amostras em anticorpo primário diluído em 5% de soro de burro normal/0,05% Triton X-100 em 1x PBS durante a noite a 4 °C.
    3. Lave amostras em 1x PBS/0,1% Triton X-100 três vezes por 5 min cada lavagem.
    4. Incubar as amostras com anticorpo secundário diluído em 5% de soro de burro normal/0,05% Triton X-100 em 1x PBS por 1h à temperatura ambiente.
    5. Lave amostras em 1x PBS/0,1% Triton X-100 três vezes por 5 min cada lavagem e incubar as amostras em 1 μg/mL DAPI.
    6. Monte as amostras com um deslizamento de tampa e algum meio de montagem e deixe secar.
    7. Observe as amostras sob um microscópio de fluorescência.
  6. Análise de RNA-seq
    1. Recolher as células em vários estágios e realizar a extração de RNA (ver passo 3.2).
    2. Preparar as bibliotecas cDNA, realizar sequenciamento profundo e análise de dados de acordo com o protocolo descrito em Wang et al.8.
    3. Execute a análise de Ontologia genética (GO) usando o pacote R, clusterProfiler.
  7. Citometria de fluxo
    1. Colete ESCs seguindo as etapas 1.6-1.7 e resuspenque as células em médio. Colete os EBs e NPCs seguindo o passo 2.4 e resuspenque as células em médio.
    2. Filtre a suspensão celular usando o coador de células de nylon de 40 μm em um novo tubo cônico de 15 mL.
    3. Meça o sinal de GFP das amostras utilizando o citômetro de fluxo (realizado pela instalação central da instituição).

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Como representação do nosso método, realizamos um experimento de EB, NPC e diferenciação de neurônios em células E14. As células E14 foram cultivadas em MEFs irradiados γ(Figura 1A)até que a população de MEF irradiada γ diluída. Confirmamos a pluripotência das células E14 realizando coloração de Fosfattase Alcalina (AP)(Figura 1B)e posteriormente RT-qPCR (veja abaixo) para marcadores Nanog e Oct4. As células E14 sem MEF γ foram então induzidas ...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O método de diferenciação neural de células-tronco embrionárias do camundongo foi estabelecido há décadas e os pesquisadores continuaram a modificar os protocolos anteriores ou criar novos para vários propósitos7,10,11. Utilizamos uma série de ensaios para analisar de forma abrangente a eficiência e o progresso das etapas de diferenciação dos mESCs aos neurônios, que podem ser utilizados na análise de outras diferenciações de li...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que não há interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do NIH (1R35GM133496-01) para Z. Gao. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Ryan Hobbs pela ajuda na secção. Agradecemos as instalações principais da Penn State College of Medicine, incluindo as Ciências do Genoma e Bioinformática, a Imagem Avançada de Microscopia de Luz e a Citometria de Fluxo. Agradecemos também ao Dr. Yuka Imamura pela assistência na análise do RNA-seq.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,05% Tripsina + 0,53mM EDTA 1XCorning25-052-CV
0,1% GelatinaSigmaG1890-100GPreparado em água desionizada
16% ParaformaldeídoThermo Scientific28908Diluído em 1X PBS
40-μ filtro de células mFalcon352340
AlbumaxThermo Fisher Scientific11020021
AlexaFluor 488 cabra anti-camundongo IgG (H + L)InvitrogenA11001O anticorpo foi diluído a 1: 500 para IF
Kit de coloração de fosfatase alcalina IIStemgent00-0055
AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRoxAzura GenomicsAZ-2105
Suplemento B27Thermo Fisher Scientific17504044
BD FACSCantoBD657338
bFGFSigma11123149001
BioAnalyzer Kit de DNA de alta sensibilidadeAgilent5067-4626
Chir99021Cayman Chemicals13122
ClorofórmioC298-500Fisher Químico
DAPIInvitrogenR37606
DMEMCorning10-017-CM
DMEM/F12 médioThermo Fisher Scientific11320033
EB bufferQiagen19086
Etanol111000200PharmcoDiluído em água desionizada
Soro bovino fetalAtlanta Lâminas de microscópio BiologicalsS10250
Fisherbrand Superfrost PlusFisher Scientific12-550-15
HiSeq 2500IlluminaSY-401-2501
IsopropanolBDH1133-4LGBDH VWR AnalíticoDiluído em água desionizada
L-glutaminaThermo Fisher Scientific25030024
LIFN/AN/AColetado de primers m18srRNA sobrenadante
MEF IDTDNAN/A5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3'
5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'MEM
Aminoácidos não essenciaisCorning25-025-Cl
mNanog primersIDTDNAN/A5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3'
5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'
mNes primersIDTDNAN/A5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3'
5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3'mNeuroD1
primersIDTDNAN/A5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3'
5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'mOct4
primersIDTDNAN/A5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3'
5'- CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'mPax6
primersIDTDNAN/A5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3'
5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'N2
suplementoThermo Fisher Scientific17502048
Nestin anticorpo primárioMilliporeMAB5326O anticorpo foi diluído a 1:200 para IF
Neural basalThermo Fisher Scientific
Anticorpo primário de neurofilamentoDSHB2H3
NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep KitBioO ScientificNOVA-5138-07
PD0325901Cayman Chemicals13034
Penicilina / estreptomicinaCorning30-002-Cl
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)N / AN / APreparado em água desionizada
- Cloreto de potássioP217-500GVWR
- Fosfato de potássio monobásico anidro0781-500GVWR
- Cloreto de sódioBP358-10Fisher Bioreagents
- Fosfato de sódio, dibásico, heptahidratadoSX0715-1Milipore
Primer hexâmero aleatórioThermo ScientificSO142
Ácido retinóicoSigmaR2625Preparado em DMSO
Piruvato de sódioCorning25-000-Cl
SacaroseSigma84097Diluído em 1X PBS
SuperScript III Transcriptase reversaInvitrogen18064022
Tissue-Tek O.C.T. compostoSakura4583
Reagente de isolamentoTriPure Sigma-Aldrich11667165001
TruSeq RapidIllumina20020616
β-mercaptoetanolFisher BioReagentsBP176-100
Sistema de sequenciamento 21103049

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
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