Visualização de Proteínas de Reparação de DNA Interação por Imunofluorescência

Resumo

Após danos no DNA, as células humanas ativam caminhos essenciais de reparação para restaurar a integridade de seu genoma. Aqui, descrevemos o método de imunofluorescência indireta como um meio de detectar proteínas de reparação de DNA, analisar seu recrutamento espacial e temporal e ajudar a interrogar a interação proteína-proteína nos locais de danos ao DNA.

Resumo

As células mamíferas são constantemente expostas a produtos químicos, radiações e subprodutos metabólicos que ocorrem naturalmente, que criam tipos específicos de insultos de DNA. Agentes genotóxicos podem danificar a espinha dorsal do DNA, quebrá-la ou modificar a natureza química das bases individuais. Após insulto de DNA, vias de resposta a danos de DNA (DDR) são ativadas e proteínas envolvidas no reparo são recrutadas. Uma infinidade de fatores estão envolvidos na detecção do tipo de dano e na ativação da resposta adequada ao reparo. A falha em ativar e recrutar corretamente fatores de DDR pode levar à instabilidade genômica, que está por trás de muitas patologias humanas, incluindo o câncer. Estudos de proteínas DDR podem fornecer insights sobre a resposta de medicamentos genotóxicos e mecanismos celulares de resistência a medicamentos.

Existem duas principais formas de visualizar proteínas in vivo: observação direta, marcando a proteína de interesse com uma proteína fluorescente e seguindo-a por imagem viva, ou imunofluorescência indireta em amostras fixas. Embora a visualização de proteínas fluorescentes marcadas permita um monitoramento preciso ao longo do tempo, a marcação direta em N ou C-terminus pode interferir na localização ou função da proteína. A observação de proteínas em sua versão endógena não modificada é preferida. Quando as proteínas de reparação de DNA são recrutadas para o insulto do DNA, sua concentração aumenta localmente e formam grupos, ou "focos", que podem ser visualizados por imunofluorescência indireta usando anticorpos específicos.

Embora a detecção de focos proteicos não forneça uma prova definitiva de interação direta, a co-localização de proteínas nas células indica que elas se reagrupam ao local do dano e podem informar sobre a sequência de eventos necessários para formação complexa. A análise cuidadosa da sobreposição espacial de focos em células expressas do tipo selvagem ou versões mutantes de uma proteína pode fornecer pistas preciosas sobre domínios funcionais importantes para a função de reparação de DNA. Por último, a co-localização de proteínas indica possíveis interações diretas que podem ser verificadas por co-imunoprecipitação nas células, ou retirada direta usando proteínas purificadas.

Introdução

Células humanas são constantemente expostas a uma variedade de DNA danificando agentes de várias origens. Fontes exógenas consistem principalmente em exposição a radiações, produtos químicos (incluindo agentes quimioterápicos e alguns antibióticos), e vírus, enquanto as principais fontes endógenas incluem erros na replicação do DNA e estresse oxidativo. Os efeitos diretos da exposição genotoxica podem variar de uma base modificada a uma quebra de duplo fio de DNA potencialmente letal (DSB), dependendo do estresse e da dose de exposição. Em última análise, danos de DNA não reparados ou mal reparados podem levar ao acúmulo de mutações, rearranjos genômicos, instabilidad....

Protocolo

1. Cultura celular HeLa

1. As tampas de vidro redondo pré-tratamento com 1 M HCl a 50 °C durante 16-18 horas. Enxágüe com ddH₂O e armazene 100% EtOH.
2. Prepare o meio de cultura celular: adicione 10% (v/v) FBS ao meio DMEM.
3. Cresça 4,0 x 10⁴ células/bem em placa estéril de 12 poços com uma tampa de vidro redonda de 18 mm a 37 °C e 5% de CO₂ em uma incubadora umidificada. Aumentar as células para 80% de confluência (aproximadamente 24 horas).

2. Tratamento celular com radiação (IR)

1. Para induzir a formação de quebras de dois fios, exponha as células a 4 Gy γ-irradiação (....

Resultados

No dia 2, ou 24 h postando células em tampas, as células sofreram uma divisão e são 80% confluentes. Derrubadas específicas ou mutações em proteínas de reparação de DNA podem aumentar o tempo de duplicação, ou sensibilizar as células para o tratamento genotoxico, e a densidade de semeadura, bem como as doses de tratamento devem ser ajustadas em conformidade. Para determinar as melhores condições de trabalho, o tempo da resposta aos danos no DNA pode ser estabelecido pela mancha ocidental de γH2AX ao longo do tempo, e a s.......

Discussão

A análise do tempo e eficiência do reparo de danos no DNA por microscopia tem se mostrado essencial para entender como funciona o maquinário de reparação de DNA, em células normais e em patologias humanas como o câncer.

O desenvolvimento de anticorpos específicos que permitem a detecção de proteínas ativadas em sua versão fosfoilada (como γH2AX, pRPA, pRAD50 e outros^10,23,39,

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução aquosa de paraformaldeído (PFA) a 16% (v/v)	Ciências da Microscopia Eletrônica	15710	qualidade da microscopia do PFA garante as melhores imagens. Se estiver usando "PFA caseiro", filtre antes de usar.
Recomenda-se a contração de choque térmico da albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	para evitar precipitação/fundo.
Lamínula #1, redonda de 18 mm (lamínulas)	Neuvitro	NC0308920	As lamínulas precisam ser limpas e esterilizadas antes do uso, com HCl ou etanol.
DMEM, Glicose Alta [(+) 4,5 g/L D-Glicose, (+) L-Glutamina, (-) Piruvato de Sódio]	Gibco	11965118	Ajuste o meio de cultivo às necessidades da linhagem celular utilizada.
DPBS, sem cálcio, sem magnésio	Gibco	14190144	PBS para cultura de tecidos.
Ácido etilenoglicol-bis(β-aminoetilo)-N,N,N′,N′-ácido tetracético (EGTA)	Research Products International	E57060	Tampão de extração nuclear.
Soro fetal bovino (FBS)	Life Technologies	104370028	A qualidade do FBS pode ser avaliada testando a formação de focos de gH2AX. Se traços de endotoxina genotóxica estiverem presentes no lote, o gH2AX será positivo na ausência de estresse.
Cloreto de magnésio (MgCl2)	Produtos de pesquisa Internacional	M24000	Tampão de extração nuclear.
Piperazina-N,N′-bis(ácido 2-etanossulfônico) (PIPES)	Research Products International	P40150	Tampão de extração nuclear.
SlowFade Diamond Antifade Mountant com DAPI	Invitrogen	S36973	300 nM DAPI com VECTASHIELD Antifade Mounting Medium pode ser usado em seu lugar.
Cloreto de sódio (NaCl)	Research Products International	S23020	Tampão de extração nuclear.
Sucrose	Research Products International	S24060	Tampão de extração nuclear.
Lâminas de microscópio Superfrost Plus	Fisherbrand	1255015	de polissina podem ser usadas em seu lugar.
Placas de poços múltiplos tratadas com TC, tamanho 12 poços	Costar	3513	A semeadura em lamínulas é feita em placa de 12 poços.
Triton X-100	AmericanBio	AB02025	Tampão de extração nuclear.
Enzima TrypLE Express (1X), Sem Vermelho de Fenol	Gibco	12604021	Tripsina-EDTA podem ser usados em seu lugar.
Tripsina-EDTA (0,5%), sem Vermelho de Fenol	Gibco	15400054	TrypLE podem ser usados em seu lugar.

A , lâminas