Administração Intratraqueal de Formulação de Pó Seco em Camundongos

Resumo

Formulações de pó seco para inalação têm grande potencial no tratamento de doenças respiratórias. Antes de entrar em estudos humanos, é necessário avaliar a eficácia da formulação de pó seco em estudos pré-clínicos. É apresentado um método simples e não invasivo de administração de pó seco em camundongos através da rota intratraqueal.

Resumo

No desenvolvimento de formulações inaláveis de pó seco, é essencial avaliar suas atividades biológicas em modelos animais pré-clínicos. Este artigo introduz um método não invasivo de entrega intratraqueal de formulação de pó seco em camundongos. Um dispositivo de carregamento de pó seco que consiste em uma ponta de pipeta de carregamento de gel de 200 μL conectada a uma seringa de 1 mL através de uma torneira de três vias é apresentado. Uma pequena quantidade de pó seco (1-2 mg) é carregada na ponta da pipeta e dispersada por 0,6 mL de ar na seringa. Como as pontas da pipeta são descartáveis e baratas, diferentes formulações de pó seco podem ser carregadas em diferentes pontas com antecedência. Várias formulações podem ser avaliadas no mesmo experimento animal sem limpeza de dispositivos e recarga de dose, economizando tempo e eliminando o risco de contaminação cruzada do pó residual. A extensão da dispersão do pó pode ser inspecionada pela quantidade de pó restante na ponta da pipeta. Um protocolo de entubação no mouse com uma fonte de luz personalizada e uma cânula orientadora está incluído. A intubação adequada é um dos fatores-chave que influencia a entrega intratraqueal da formulação de pó seco para a região pulmonar profunda do camundongo.

Introdução

A rota pulmonar da administração oferece diversos benefícios na entrega de terapêuticas para ações locais e sistêmicas. Para o tratamento de doenças pulmonares, a alta concentração de medicamentos locais pode ser alcançada por parto pulmonar, reduzindo assim a dose necessária e diminuindo a incidência de efeitos colaterais sistêmicos. Além disso, as atividades enzimáticas relativamente baixas no pulmão podem reduzir o metabolismo de drogas prematuras. Os pulmões também são eficientes para a absorção de medicamentos para ação sistêmica devido à grande e bem perfusada superfície, a camada de célula epitelial extremamente fina e o alto volume sanguíneo em capilares pulmonares¹.

Formulações em pó seco inaladas têm sido amplamente investigadas para a prevenção e tratamento de diversas doenças como asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, diabetes mellitus e^vacinaçãopulmonar 2^,3,4. As drogas no estado sólido são geralmente mais estáveis do que na forma líquida, e os inaladores de pó seco são mais portáteis e fáceis de usar do que os nebulizadores^5,6. No desenvolvimento de formulações de pó seco inalado, a segurança, o perfil farmacocinético e a eficácia terapêutica precisam ser avaliados em modelos animais pré-clínicos após a administração pulmonar⁷. Ao contrário dos humanos que podem inalar pó seco ativamente, a entrega pulmonar de pó seco para animais de pequeno porte é um desafio. É necessário estabelecer um protocolo eficiente de entrega de pó seco aos pulmões dos animais.

Os camundongos são amplamente utilizados como modelos animais de pesquisa porque são econômicos e se reproduzem bem. Eles também são fáceis de manusear e muitos modelos de doenças são bem estabelecidos. Existem duas abordagens principais para administrar pó seco no pulmão do camundongo: inalação e administração intratraqueal. Para inalação, o camundongo é colocado em uma câmara de corpo inteiro ou nariz, onde o pó seco é aerossolizado e os animais respiram no aerossol sem sedação^8,9. Equipamentos caros são necessários e a eficiência de entrega de medicamentos é baixa. Embora a câmara do corpo inteiro possa ser tecnicamente menos desafiadora, a câmara de exposição apenas para nariz poderia minimizar a exposição de drogas à superfície do corpo. Independentemente disso, ainda é difícil controlar com precisão e determinar a dose entregue aos pulmões. O pó seco é depositado principalmente na região da nasofaringe, onde o despejo mucociliar é proeminente¹⁰. Além disso, os camundongos dentro da câmara estão sob estresse significativo durante o processo de administração porque são constrangidos e privados de alimentos e abastecimento de água¹¹. Para a administração intratraqueal, geralmente refere-se à introdução da substância diretamente na traqueia. Existem duas técnicas diferentes para conseguir isso: traqueotomia e intubação orotraqueal. O primeiro requer um procedimento cirúrgico que faça uma incisão na traqueia, que é invasiva e raramente utilizada para administração de pó. Apenas a segunda técnica é descrita aqui. Em comparação com o método de inalação, a administração intratracheal é o método mais utilizado para a entrega pulmonar no camundongo devido à sua alta eficiência de entrega com perda mínima de medicamentos^12,13. É um método simples e rápido para entregar precisamente uma pequena quantidade de pó dentro de alguns miligramas para o mouse. Embora o camundongo seja anatomicamente e fisiologicamente distinto dos seres humanos e a anestesia seja necessária durante o processo de intubação, a administração intratraqueal contorna o trato respiratório superior e oferece uma maneira mais eficaz de avaliar as atividades biológicas da formulação de pó seco, como a absorção pulmonar, a biodisponibilidade e os efeitos terapêuticos^14,15.

Para administrar pó seco intratracheicamente, o rato tem que ser entubado, o que pode ser desafiador. Neste artigo, descreve-se a fabricação de um insuflê de pó seco feito sob medida e um dispositivo de intubação. Os procedimentos de intubação e insuficiência de pó seco no pulmão do camundongo são demonstrados.

Protocolo

Os experimentos realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Uso de Animais Vivos para Ensino e Pesquisa (CULATR), da Universidade de Hong Kong. Formulações de pó seco preparadas pela secagem de congelamento de spray (SFD) contendo 0,5% do RNA mensageiro da luciferase (mRNA), 5% de peptídeo sintético PEG₁₂KL4 e 94,5% de mannitol (w/w) são utilizadas neste estudo para demonstrar a expressão mRNA no pulmão¹⁶. O diâmetro aerodinâmico médio de massa (MMAD) do pó SFD é de 2,4 μm. Pó de manitol seco (SD) são usados para investigar o efeito do volume de ar usado na dispersão de pó¹⁶. O pó de SD de SD é de 1,5 μm.

1. Fabricação de insufrante de pó seco e carregamento de pó seco

1. (Opcional) Neutralizar as cargas estáticas de pó seco (em um frasco) e a ponta de pipeta de carregamento de gel redondo de 200 μL. Use uma arma antiestática ou um equilíbrio com função desionizante de acordo com a instrução do fabricante.
2. Prepare um papel de pesagem com um tamanho de cerca de 4 cm x 4 cm. Dobre o papel ao meio diagonalmente e, em seguida, desdobre-o.
3. Pesar 1-2 mg de pó seco no papel de pesagem.
4. Encha uma ponta de pipeta de carregamento de gel com pó através da abertura mais ampla da ponta. Bata suavemente para embalar o pó até que o pó se forme agglomerados soltos perto da extremidade estreita da ponta(Figura 1A). Evite embalar o pó muito fortemente, pois pode dificultar a dispersão do pó.
5. Conecte a ponta carregada em pó a uma seringa de 1 mL através de uma torneira de três vias(Figura 1B). O tamanho da seringa pode ser alterado de acordo com o volume de ar usado para dispersar o pó. Segure a ponta e a seringa verticalmente durante a conexão para evitar derramamento de pó. Se a administração não for realizada imediatamente, use o parafilm para selar as aberturas da ponta e armazená-la temporariamente em condições adequadas até a administração.

2. Fabricação de dispositivo de intubação

1. Fonte de luz(Figura 2)
   1. Prepare uma fonte de luz personalizada com uma tocha de diodo emissor de luz (LED) e uma fibra óptica flexível com diâmetro de 0,8-1 mm.
   2. Faça um orifício centrado na lente clara da tocha LED com uma broca de mão ou uma broca para que a fibra óptica mal possa passar.
   3. Insira a fibra óptica através do orifício. Ligue a tocha LED para ajustar a posição e a profundidade de inserção para o brilho máximo na outra extremidade da fibra óptica.
   4. Fixar a fibra óptica em posição com cola epóxi clara.
2. Cânula orientadora (Figura 3)
   1. Pegue uma pipeta Pasteur de plástico de 1 mL(Figura 3A)e segure a pipeta em ambas as extremidades.
   2. Use uma lâmpada de álcool (ou outras fontes de calor no laboratório, como um queimador de Bunsen) para aquecer o meio da pipeta colocando-a a 5-10 cm acima da chama(Figura 3B). Gire a pipeta para ter certeza de que está aquecida uniformemente.
   3. Quando o plástico ficar macio e deformado, mova a pipeta para longe da chama e estique a pipeta suavemente.
   4. Corte a pipeta esticada no meio com um par de tesouras na Parte A e Parte B(Figura 3C-E). Use a peça A como uma pipeta de ponta fina e parte B como uma cânula guia. Para aumentar a chance de intubação bem sucedida com a cânula guia, faça um bisbigo (não muito afiado que pode aumentar o risco de ferir o animal) no final da Parte B (Figura 3F). Quando uma ponta de pipeta de carregamento de gel de 200 μL (para carregamento em pó) é inserida na cânula guia, ela deve projetar a cânula por 1-2 mm.
      NOTA: Uma cânula guia (Parte B) com a dimensão apropriada (diâmetro interno e externo) para intubação poderia ter uma agulha de calibre 21 dentro dela, enquanto também pode caber dentro de uma agulha de calibre 17. Podem ser necessárias múltiplas tentativas no alongamento das pipetas para alcançar a dimensão apropriada.
   5. (Opcional): Corte uma pequena abertura na extremidade mais larga da cânula guia para torná-la mais flexível para que seja mais fácil segurar a fibra óptica(Figura 3F). Esta abertura também permite a montagem de um microsprayer para a administração de aerossol líquido.

3. Intubação

1. Anestesiar o rato (BALB/c, 7-9 semanas) com cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) por injeção intraperitoneal.
2. Prepare uma plataforma feita de Plexiglass e monte-a em um suporte com um grampo(Figura 4A). Coloque o mouse anestesiado na plataforma (em torno de 60° de inclinação) em uma posição supina. A altura e o ângulo de inclinação da plataforma poderiam ser ajustados pela posição do grampo no suporte.
3. Suspenda o mouse enganchando seus incisivos em um fio dental de nylon(Figura 4B). Fixar a posição do mouse por um pedaço de fita ou um elástico.
4. Insira a fibra óptica na cânula guia antes da intubação com a ponta do nível de fibra com a abertura da cânula guia. Ligue a tocha led para iluminar.
5. Saliente suavemente a língua do rato com um par de fórceps para expor sua traqueia.
6. Use a outra mão para segurar a cânula guia com fibra óptica dentro. Insira-os através da cavidade oral. Com a iluminação da fibra óptica, a abertura da traqueia pode ser visualizada como um orifício entre as cordas vocais.
7. Alinhe o chanfrado da cânula guia para a linha média da abertura (Figura 5A). Entuba suavemente a cânula guia com fibra óptica na traqueia, apontando a melhor ponta da cânula na abertura traqueal.
8. Após a intubação, remova rapidamente a fibra óptica e deixe a cânula guia dentro da traqueia (Figura 5B). Uma respiração normal deve ser observada.
9. Segure a pipeta de ponta fina (Parte A) na abertura da cânula guia e insufre um pequeno sopro de ar (cerca de 0,2 mL) no pulmão do camundongo. Uma ligeira inflação no peito do mouse indica intubação adequada. Remova a pipeta de ponta fina antes da administração do pó.

4. Administração de pó

1. Segure a ponta carregada em pó que está conectada à seringa conforme descrito na etapa 1.5. Certifique-se de que o fluxo de ar entre a seringa e a ponta esteja desconectado.
2. Puxe o êmbolo da seringa para trás para retirar 0,6 mL de ar.
   NOTA: O volume de ar utilizado para dispersar o pó depende das propriedades do pó e da quantidade de pó carregado. Isso é descrito ainda na seção de resultados.
3. Gire a válvula da torneira de três vias para conectar o fluxo de ar entre a seringa e a ponta carregada em pó.
4. Insira a ponta carregada em pó na cânula guia que já foi colocada na traqueia do mouse(Figura 5C). Segure a cânula guia e empurre o êmbolo da seringa com força em uma ação contínua para dispersar o pó enquanto aerossóis para dentro do pulmão.
   NOTA: Qualquer movimento dianteiro do dispositivo deve ser minimizado para evitar ferir o animal.
5. Retire a ponta e verifique se o pó dentro da ponta foi esvaziado. Se não, repita o passo 4.1 para 4.4.
   NOTA: Se o pó estiver muito apertado devido ao toque excessivo, pode não ser dispersado corretamente.
6. Uma vez que a administração esteja completa, remova a cânula guia da traqueia.
7. Deixe o mouse se recuperar posicionando-o horizontalmente em uma posição supina com a língua meio salientes para evitar o bloqueio das vias aéreas.

Resultados

Quando um insuflê de pó seco é usado para fornecer aerossol em pó para o pulmão de um animal, o volume de ar utilizado é crítico, pois afeta a segurança, bem como a eficiência de dispersão em pó. Para otimizar o método, foram utilizados diferentes volumes de ar (0,3 mL, 0,6 mL e 1,0 mL) para dispersar o pó seco (1 mg de mannil seco com spray) e o peso dos camundongos foi monitorado por 48 horas após a administração(Figura 6). O uso de 0,3 mL e 0,6 mL de ar não causou perda de peso dos camund...

Discussão

Neste artigo, são apresentados dispositivos personalizados para insuficiência de pó seco e intubação intratraqueal. Na etapa de carga em pó, o pó seco é carregado em uma ponta de pipeta de carregamento de gel de 200 μL. É importante tocar suavemente a ponta para permitir a embalagem solta de pó na extremidade estreita da ponta. No entanto, se o pó estiver muito apertado, eles ficarão presos na ponta e não poderão ser devidamente dispersos. Recomenda-se neutralizar as cargas estáticas do pó e da ponta da pipeta, a fim de ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
BALB/c camundongo			fêmea; 7-9 semanas de idade; Peso corporal 20-25 g
CleanCap Firefly Luciferase mRNA	TriLink Biotechnology	L-7602
Insuflador de pó seco	PennCentury	Modelo DP-4M
Cetamina 10%	Alfasan International B.V.	Tocha de
	Unilite Internation	PS-K1
Mannitol (Pearlitol 160C)	Roquette	450001
Ponta de pipeta de carregamento de gel redondo sem filtro (200 µ L)	Labcon	1034-800-000
Fio de nylon	Reach	30017050
Seringa de um mililitro sem agulha	Terumo	SS-01T
Fibra óptica	Fibra OMPF1000
Peptídeo PEG12KL4	EZ Biolab		(PEG12) -KLLLLKLLLLLLLLLLLLLLKLLK-NH2
Pipeta de ponta fina Pasteur de plástico	Alpha Labotatories	LW4061
Torneira de três vias	Braun	D201
Xylazine 2%	Alfasan International B.V.	Pistola
Zerostat 3	MILTY	5036694022153

diodo emissor de luz (LED) NA de dados antiestática NA