Este protocolo descreve a construção de um sistema de microinjeção de baixo custo, sua implantação estereotaxa em estruturas cerebrais profundas e o procedimento para microinjeções cronometradas de tetrodotoxina em ratos acordados e desenfreados. O objetivo é revelar a participação de estruturas hipotalâmicas na regulação da ovulação inibindo sua atividade neural.
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Artigo de método
Desvendando o papel das áreas discretas do cérebro de rato na regulação da ovulação através da inativação reversível por microinjeções de tetrodotoxinas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Muitas abordagens experimentais têm sido usadas para estudar o papel do cérebro na regulação da ovulação. Exemplos incluem a lesão e a desafeção de grupos neuronais, que são métodos invasivos que prejudicam permanentemente a integridade da área alvo. Esses métodos são acompanhados de efeitos colaterais que podem afetar a análise de mecanismos regulatórios agudos e temporais. A implantação estereotipada de cânulas-guia destinadas a regiões cerebrais específicas, seguidas de um período de recuperação, permite aos pesquisadores microinjetar diferentes drogas após o desaparecimento dos efeitos indesejados da cirurgia. A tetrodotoxina tem sido usada para determinar os papéis de várias áreas cerebrais em diversos processos fisiológicos, pois inibe transitoriamente os potenciais de ação dependentes de sódio, bloqueando assim toda a atividade neural na região alvo. Este protocolo combina este método com estratégias para a avaliação do ciclo estrous e da ovulação para revelar o papel de regiões cerebrais discretas na regulação da ovulação em determinados momentos de qualquer estágio do ciclo estrous. Ratos acordados e desenfreados(Rattus norvegicus) foram usados para evitar os efeitos de bloqueio que os anestésicos e os hormônios do estresse exercem sobre a ovulação. Este protocolo pode ser facilmente adaptado a outras espécies, alvos cerebrais e agentes farmacológicos para estudar diferentes processos fisiológicos. Melhorias futuras neste método incluem o projeto de um sistema de microinjeção usando capilares de vidro de pequeno diâmetro em vez de cânulas-guia. Isso reduzirá a quantidade de tecido danificado durante a implantação e diminuirá a disseminação das drogas infundidas fora da área alvo.
Introdução
A ovulação é o processo pelo qual um ou mais oócitos maduros são liberados dos ovários uma vez que cada ciclo estral/menstrual. Como todas as espécies de mamíferos dependem da produção de gametas para procriar, a compreensão dos mecanismos que regulam a ovulação tem um enorme impacto em áreas que vão da biomedicina, da pecuária e da manutenção de espécies ameaçadas de extinção. A ovulação é regulada pelo eixo hipotalâmico-pituitário-ovariano, que envolve várias áreas hipotalâmicas e extra-hipotalâmicas, os gonadotropes na hipófise anterior e as células trómia e granulosa que, juntamente com os oócitos, formam os folículos ovarianos dentro dos ovários....
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Protocolo
Os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Lei de Estudios Superiores Zaragoza, unam. Esta instituição opera em estrita conformidade com as regras mexicanas para o manejo de animais, Norma Oficial: NOM-062-ZOO-1999, que concorda com as diretrizes internacionais.
1. Construção de cânulas bilaterais
- Extrair o eixo de aço inoxidável do cubo de duas agulhas hipodérmicas de 23 G usando pinças de pressão e, em seguida, remover qualquer cola restante usando uma lâmina de bisturi.
- Desenhe uma linha de 15 mm além da extremidade cega dos eixos com um marcador permanente fino. Use pinças de corte pa....
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Resultados
O protocolo descrito acima foi testado avaliando os efeitos de um único TTX ou veículo (fluido cerebrospinal artificial; ACSF) microinjeção em um dos dois núcleos diferentes conhecidos por estarem envolvidos na regulação da ovulação no rato: o supraciasmático e o núcleo arcuato. O núcleo supraciasmático foi escolhido por conter o marca-passo circadiano central em mamíferos. Está envolvida na regulação de eventos cíclicos como secreção de gonadotropinas. O núcleo arcuato foi escolhido porque contém uma população de neurôn.......
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Discussão
Este artigo descreve um método para inativar transitoriamente, a qualquer momento, uma região discreta no cérebro de ratos acordados e sem restrições. Um método simples para rastrear seu ciclo estrous e avaliar a ovulação também é fornecido. Este protocolo permite uma análise direta da contribuição de regiões cerebrais específicas aos mecanismos que impulsionam a ovulação, comparando o desfecho ovulatório de animais tratados com TTX com os tratados com veículos. Com exceção do instrumento estereotaxista e da bomba de mic.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar em relação a este artigo.
Agradecimentos
Somos gratos a Raymond Sanchez na Universidade de Washington por sua valiosa ajuda na edição de manuscritos e à M.Sc. Georgina Cortés e M.Sc. Cintia Javier por seu apoio técnico na padronização desta técnica. Também somos gratos aos membros dos serviços veterinários da Facultad de Estudios Superiores Zaragoza: MVZ. Adriana Altamirano, MVZ. Roman Hernández e MVZ. Dolores-Elizabeth Guzmán pela excelente manutenção e cuidado de animais experimentais. Os experimentos descritos neste protocolo foram apoiados pelo número de subvenção DGAPA-PAPIIT: IN216015 e pelo número de subvenção do CONACyT: 236908 a Roberto Domínguez. Carlos-Camilo Silva é doutorando pelo Programa de Do....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 10 μ L Seringas Hamilton | 80314 | ||
| 21 G x 1" agulha hipdérmica em aço inoxidável | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" agulha hipdérmica em aço inoxidável | BD | 305145 | |
| agulha hipdérmica em aço inoxidável 30 G x 1/2" | BD | 305106 | |
| Líquido cefalorraquidiano artificial | BASi | MD-2400 | |
| Trímero ósseo | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Burr para micro broca | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Clipper | Wahl | ||
| Disco de corte | Dremel | SM5010 | |
| Pinças de corte | Truper | 17367 | |
| Cola de cianocrilato | Kola loka | K-1 | |
| Cimento dental | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin Sigma | E4009 | ||
| Estereoscópio | Zeiss | ||
| Tesoura Bonn extra fina | Ferramentas de Ciências | Finas 14084-08 | |
| Máscara facial | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe Fórceps | Ferramentas de Ciências Finas | 11050-10 | |
| Hematoxilina | Sigma | H3136 | |
| Hemostáticos | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Esterilizador de esferas quentes | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Ácido clorídrico | Sigma | 320331 | |
| Hipromelose lágrimas artificiais | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurano | Pisa Agropecuária | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Bomba de microinjeção | KD Scientific | 788380 | |
| Monômero | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Luvas de nitrilo | Lanceta HG | 69028 | |
| Barras auriculares sem ruptura | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poli-L lisina | Sigma | P4707 | |
| Iodopovidona | Dermo Dine | ||
| Iodopovidona com sabão | de Germisin | ||
| Pinças de pressão | Truper | 17371 | |
| Máscara de anestesia de rato | David Kopf Instruments | Modelo 906 | |
| Solução salina | PISA | ||
| Bisturi | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Lâmina de bisturi | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Pentobarbital de sódio | Pisa Agropecuária | ||
| Suporte de eletrodo padrão | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Fio de aço inoxidável | American Orthodontic | 856-612 | |
| Aparelho | estereotáxicoDavid Kopf Instruments | Modelo 900LS | |
| Sissors Cirúrgicos | Ferramentas de Ciência Fina | 14001-12 | |
| Conectores de Teflon | Basi | MD-1510 | |
| Tubulação de Teflon | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoxina | Alomone labs | T-500 | |
| Vaporizador | Kent científico | VetFlo |
Referências
- Herbison, A. E. Control of puberty onset and fertility by gonadotropin-releasing hormone neurons. Nature Reviews Endocrinology. 12 (8), 452-466 (2016).
- Fink, G. Neuroendocrine Regulation of Pituitary Function. Neuroendocrinology in Physiology and Medicine. Conn, M., Freeman, E.....
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Reimpressões e permissões
