Prever amputação usando células progenitoras mononucleares circulantes locais em pacientes tratados com angioplastia com isquemia de membros críticos

Resumo

A amputação de membros inferiores pode ocorrer mesmo após a angioplastia de vasos obstruídos em Isquemia de Membros Críticos (CLI). Células Progenitoras Mononucleares (MPCs) refletem o reparo vascular. O presente protocolo descreve a quantificação de CMS de circulação próxima à angioplastia, e sua relação com disfunção endotelial e previsão de amputação de membros inferiores.

Resumo

Isquemia de membros críticos (CLI) representa um estágio avançado da doença arterial periférica. A angioplastia melhora o fluxo sanguíneo para o membro inferior; no entanto, alguns pacientes irreversivelmente progredir para amputação de membros. A extensão dos danos vasculares e os mecanismos de reparação vascular são fatores que afetam o desfecho pós-angioplastia. As Células Progenitoras Mononucleares (MPCs) são reativas a danos vasculares e reparos, com a capacidade de refletir doenças vasculares. O presente protocolo descreve a quantificação de CMS obtidos a partir da circulação sanguínea de um vaso próximo ao local da angioplastia, bem como sua relação com a disfunção endotelial e sua capacidade preditiva para amputação de membros nos próximos 30 dias após a angioplastia em pacientes com CLI.

Introdução

A Doença Arterial Periférica (PAD) é caracterizada por obstrução vascular crônica e progressiva com limitação do fornecimento de sangue¹. Em escala global, o PAD dos membros inferiores afeta cerca de 10% da população idosa, enquanto até 7% desses casos são submetidos à amputação de membros^2,3.

Isquemia de Membros Críticos (CLI) representa a apresentação mais séria do PAD¹. Os pacientes geralmente sentem dor em repouso, úlceras ou gangrena atribuíveis a artérias ocluídas; enquanto o prognóstico clínico é desfavorável e marcado por um risco de 30% de amputação e mortalidade dos membros durante 1 ano^3,4,5.

A angioplastia é um procedimento endovascular minimamente invasivo que pode restaurar o fluxo sanguíneo para o membro inferior em pacientes com CLI; no entanto, alguns pacientes inevitavelmente exigirão amputação de membros principais, mesmo após a terapia de angioplastia^1,5. A identificação precoce de desfechos desfavoráveis após a angioplastia é bastante valiosa, devido à possibilidade de aplicação da terapia.

Fatores de risco tradicionais podem fornecer uma capacidade preditiva limitada para amputação de membros principais em pacientes com CLI submetido à angioplastia⁶. Biomarcadores orientados à fisiopatologia representam novos métodos com aplicações clínicas potenciais, o que pode resultar especificamente útil em doenças relacionadas à lesão vascular⁷. Atualmente, a participação de populações celulares proprietárias de propriedades de reparo endotelial, no local da placa aterosclerótica, tem sido cada vez mais reconhecida^8,9.

As Células Progenitoras Mononucleares (MPCs) são derivadas da medula óssea e possuem características estruturais e funcionais de células-tronco com habilidades regenerativas vasculares. Devido à capacidade do MPC de proliferar, migrar e mostrar adesão vascular; essas células tornaram-se bons candidatos para refletir o reparo endotelial em resposta à isquemia^10,11,12. Além disso, o interesse contínuo por mecanismos subjacentes à lesão vascular tem motivado a exploração do papel prognóstico dos biomarcadores locais, uma vez que são considerados para refletir danos vasculares e reparar^7,13,14.

O objetivo do presente estudo é descrever como determinar a quantidade de MPCs que circulam perto da obstrução vascular em pacientes com CLI submetidos à angioplastia; e como avaliar a relação entre ASCs com indicadores de disfunção endotelial e amputação de membros.

Em comparação com o prognóstico baseado em comorbidades e características vasculares intrínsecas, a quantidade de MPCs locais mostram capacidade específica de prever o desfecho clínico em relação à disfunção endotelial e amputação de membros. Consistentemente, alguns estudos descreveram o papel prognóstico de biomarcadores semelhantes durante a avaliação de pacientes com PAD^15,16.

Com base em resultados anteriores⁷, o método descrito aqui pode ser útil para uma identificação precoce da população em risco de desfechos vasculares adversos em diversos ambientes clínicos, como isquemia de membros inferiores e coronárias, acidente vascular cerebral, vasculite, trombose venosa e outros envolvendo lesão vascular e reparação.

Protocolo

O comitê de ética em pesquisa institucional do Centro Médico Nacional "20 de Noviembre" issste aprovou este protocolo prospectivo, todos os pacientes inscritos forneceram consentimento por escrito informado.

1. Avaliação de bloco vascular de membro inferior, amostragem de sangue e angioplastia de balão

NOTA: A amostra utilizada para este experimento foi composta por 20 pacientes diabéticos, com idade entre 68 anos e 10 em 20 homens. Metade da amostra era de fumantes e as co-morbidades mais prevalentes eram diabetes mellitus tipo 2, hipertensão arterial sistêmica e/ou dislipidemia. A amostra destinava-se a ser padronizada para idade, sexo e co-morbidades. O possível viés devido à influência clínico-demográfica na relação entre OSCs e CLI não pôde ser descartado.

1. Avaliar a gravidade clínica da isquemia dos membros de acordo com a classificação de Rutherford¹³ (ver Tabela Suplementar 1).
2. Realizar angiografia de membros inferiores, amostragem de sangue e angioplastia de balão.
   1. Use anticoagulantes e medicamentos anestésicos antes da cirurgia.
   2. Coloque uma agulha de 18 G no vaso sanguíneo no local da virilha selecionado.
   3. Coloque um introdutor e avance um fio guia flexível. Em seguida, o guia inicial é ainda mais alterado para um introdutor de 6 Fr.
   4. Use injeção periódica de mídia de contraste ou CO₂ sob guia fluoroscópica para identificar trajetória arterial e locais bloqueados vasculares(Figura 1).
      NOTA: Use mídia de contraste de 40 cc, diluída 1:1 em 0,9% salina, ou CO₂ a 10 a 20 mL por tiro a uma pressão de 12 psi.
   5. Introduza dois fios guia de navegação 0,014 Fr e dois fios de guia de suporte de 0,014 Fr na embarcação e avance-os até o local bloqueado.
      NOTA: Dois fios-guia de 0,014 Fr (260 cm de comprimento) são utilizados para navegação e dois fios-guia de 0,014 Fr (260 cm de comprimento) são utilizados para suporte, durante um único procedimento.
   6. Introduza 5 cateteres Fr e 3 Fr sequencialmente e colete 10 mL de sangue do local mais próximo à obstrução vascular. Mantenha amostras de sangue no gelo.
      NOTA: Os tamanhos dos cateteres podem ser de 5 Fr e 3 Fr, e são alterados durante o procedimento.
   7. Avance um fio guia novamente. Em seguida, introduza um cateter de balão de angioplastia, que contém um balão inflável localizado no final do cateter. Avance o cateter do balão da angioplastia e coloque o balão bem no local da lesão. Realize a angioplastia inflando o balão contra a placa de bloqueio localizada na parede vascular. Verifique a restauração do fluxo sanguíneo.
      NOTA: Um stent pode ser colocado na área bloqueada para ajudar a manter a artéria aberta após o procedimento.
   8. Introduza um cateter e avance até o local mais próximo do bloco vascular. Coletar 10 mL de sangue a 30 minutos de intervalo após angioplastia. Mantenha amostras de sangue no gelo.
      NOTA: Recomenda-se a coleta de amostras de sangue antes e depois da angioplastia para avaliar melhor a influência da angioplastia no número de MPCs.
   9. Remova todos os fios sob orientação fluoroscópica.
   10. Fornecer procedimentos de assistência pós-operatória, incluindo terapia anticoagulação usando enoxaparina a 1 mg/kg subcutâneo a cada 12 h, aspirina 100 mgs, estatina e analgesia. Compresse no local da punção vascular durante 24 h.

2. Quantificação das células progenitoras mononucleares circulantes (MPCs) (Figura 2)

1. Para um tubo cônico fresco de 15 mL, transfira 6 mL do sangue coletado e diluir 1:1 (v/v) com PBS.
   NOTA: Processe o sangue dentro de 1h da coleta.
2. Prepare-se para a separação do gradiente de densidade, adicionando 2 mL do gradiente de densidade médio a 3 tubos de ensaio cada. Em seguida, adicione 3 alíquotas de volume iguais do sangue diluído em cada tubo de ensaio.
   NOTA: Não exceda três quartos da capacidade máxima do tubo de ensaio.
3. Centrifugar a 1.800 x g por 30 min a 4 °C. Colete a camada de interface presente como um anel usando uma pipeta e transfira para um novo tubo. Adicione 2 mL de PBS e gire a 1.800 x g por 6 min a 4 °C. Guarde a pelota, pois isso conterá MPCs.
4. Lave a pelota contendo MPCs com PBS por centrifugação conforme descrito na etapa 2.3. Use PBS fresco para cada lavagem e gire a 1.800 x g por 2 min a 4 °C. Repita o processo por 6 vezes.
5. Após a última lavagem, use 1 mL de PBS para resuspensar a pelota da célula. Diluir 20 μL da suspensão celular com 20 μL de 0,4% de tripano azul, 1:1 (v/v). Use 10 μL desta suspensão celular para contagem de células usando hemótmetro e um microscópio leve.
6. Aliquot 1 x 10⁶ MPCs em tubos de citometria de fluxo de 5 mL previamente rotulados.
   NOTA: Prepare os anticorpos de controle correspondentes ao isótipo correspondentes.
7. Centrifugar os tubos a 1.800 x g por 6 min a 4 °C. Aspire e descarte o supernaspe.
8. Diluir o anticorpo primário em 100 μL de solução de incubação de anticorpos [1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM, BSA 0,05%] e adicionar ao tubo. Resuspend para 10 s e incubar por 20 min a 4 °C, no escuro.
   NOTA: As concentrações finais dos anticorpos primários utilizados no presente protocolo foram CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50. O protocolo pode ser interrompido nesta etapa, fixando linfócitos em 4% de paraformaldeído na PBS e armazenando amostras até 24h a 4 °C.
9. Centrifugar a 1.800 x g por 2 min a 4 °C e descartar o supernaspe. Resuspend em 500 μL de 1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM.
10. Realize a análise da citometria de fluxo.
    1. Configure o fundo com anticorpos de controle compatível com isótipo. Em seguida, no gráfico FSC/SSC, os linfócitos selecionados se espalham, tentando excluir detritos celulares, granulócitos residuais e outras partículas. Essa distribuição é considerada 100%.
       NOTA: Os linfócitos geralmente se espalham na região inferior esquerda do enredo.
    2. Use um portão com imunofenótipo comum contendo alto número de células CD45⁺ e CD34⁺. Em seguida, selecione para imunofenótipos duplos positivos usando o portão que anteriormente identificou CD45⁺, CD34⁺, e adicionando KDR (VEGFR-2)⁺, CD133⁺ ou CD184⁺. Identifique as subpopulações dos MPCs por seus marcadores de superfície celular específicos. Informe-se como a porcentagem de eventos fechados.
11. Identificar as principais subpopulações de MPCs. No presente estudo, os imunofenótipos analisados foram CD45⁺CD34⁺CD133⁺; CD45⁺CD34⁺CD184⁺; CD45⁺CD34⁺CD133⁺CD184⁺; CD45⁺CD34⁺KDR⁺; CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD133⁺ e CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD184^7,17.
    NOTA: Estes marcadores de superfície celular foram utilizados para o estudo: CD45 (linfócitos), CD34 (células endoteliais e/ou vasculares), KDR (VEGFR-2) (marcador de membrana de células endoteliais), CD133 (células progenitoras endoteliais) e CD184 (células-tronco hematopoiéticas e células endoteliais).

3. Relação dos MPCs com modificação da função endotelial e teste hemodinâmico (FMD)

1. Determine a dilatação mediada por fluxo (FMD), pré e pós-angioplastia.
   1. Use um transdutor linear vascular para medir o diâmetro da artéria braquial.
   2. Coloque a braçadeira do esfigmomanômetro acima do local de medição no antebraço e insuflê a 50 mmHg acima da pressão arterial sistólica por 5 min e desintoque.
   3. Determine novamente o diâmetro da artéria braquial nos próximos 60 s. Use a equação abaixo para estimar a Febre Aftosa.
      NOTA: Calcular o grau de dilatação utilizando a equação (%) = (diâmetro máximo após isquemia transitória - diâmetro basal) × 100 / diâmetro basal.
2. Correlacionar o número de MPCs com o valor de FMD de linha de base e delta pós-angioplastia de FMD.

4. Capacidade prognóstica de MPCs para amputação de membros

1. Agende consultas médicas periódicas após angioplastia de balão e alta do paciente, para avaliar a qualidade do fluxo sanguíneo para o membro inferior.
2. Avalie a gravidade clínica da isquemia dos membros às 2 semanas após a angioplastia. Avaliar a resolução da dor de repouso, isquemia mais baixa e preservação de um pé funcional, de acordo com a classificação Rutherford¹³.
3. Compare a gravidade clínica da isquemia dos membros, na linha de base versus acompanhamento. Identificar esses casos que requerem amputação maior devido ao desfecho desfavorável.
4. Correlacionar o número de CMIs com a proporção de pacientes que necessitam de amputação maior do membro inferior.

Resultados

Amostras de sangue de artérias bloqueadas, no local abordado para angioplastia, foram coletadas de 20 pacientes diabéticos, com idade entre 68 anos e 10 em 20 homens. Metade da população amostral era fumante. As lesões vasculares foram pontuadas principalmente como Rutherford classe VI; enquanto os pacientes apresentaram maior prevalência de Diabetes Mellitus tipo 2 (100%), hipertensão (70%) e dislipidemia (55%).

Um acompanhamento clínico de 30 dias após a angioplastia dos membros inferiores f...

Discussão

A coleta de sangue no local exato do bloco vascular pode apresentar dificuldades técnicas; por isso, realizamos coleta de sangue nas proximidades do bloco vascular. Da mesma forma, a quantidade de MPCs próximos à placa vascular parece ser altamente dinâmica e pode originar variações antes e depois da angioplastia. De acordo com nossas observações, recomenda-se avaliar as alterações de linha de base e 30min pós-angioplastia no número de MPCs, uma vez que podem refletir diversos processos fisiofisiológicos que ocorrem dent...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
A BSA	Roche	10735086001	a albumina de soro bovino (BSA) como agente tampão, estabilizador, padrão e para mistura.
Grânulos de calibração	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-607	Os grânulos de calibração MACQuant são fornecidos em solução aquosa contendo 0,05% de azida sódica. 3,5 ml para até 100 testes
CD133/1 (AC133)-PE	Milteny Biotec / MACS	#130-080-801	Anticorpo conjugado à R-Ficoeritrina em tampão PBS/EDTA
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770	Miltenyi Biotec / MACS	#130-103-798	Monoclonal, IgG1 humano recombinante de isotipo, CD309 conjugado
(VEGFR-2/KDR)-APC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-601	Anticorpo conjugado a R-Ficoeritrina em tampão PBS/EDTA
CD34-FITC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-081-001	O clone de anticorpo monoclonal AC136 detecta um epítopo de classe III do CD34
CD45- VioBlue	Miltenyi Biotec / MACS	#130-092-880	Anticorpo CD45 monoclonal,
tubos cônicos	Thermo SCIENTIFIC	#339651	Tubos de centrífuga cônicos de 15ml
Tubos de citometria	FALCON Corning Marca	#352052	Tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL. Estilo 12x75. Estéril.
EDTA	BIO-RAD	#161-0729	Metais pesados, (como Pb) < 10ppm, Fe< 0,01%, As< 1ppm, Insolúveis< 0,005%
Neubauer melhorado	Sem marca	Sem número de catálogo	Hemocitômetro para contagem de células. (faixa 0,1000 mm, 0,0025 mm2)
Tubos de coleta de sangue K2 EDTA	BD Vacutainer	#367863	Tubo vacutainer de plástico lilás (K2E) 10,8mg, 6 mL.
Lymphoprep	Stemcell Technologies	01-63-12-002-A	Estéril e verificado quanto à presença de endotoxinas. Densidade: 1.077± 0,001g/mL
Paraformaldeído	SIGMA-ALDRICH		Fixação de amostras biológicas, (pó, 95%)Transferência de
pipeta 1,3mL	CRM Globe	PF1016, PF1015	A pipeta de transferência é uma ferramenta que facilita a transferência de líquidos com maior precisão.
Tubos de ensaio	KIMBLE CHASE	45060 13100	Tubos de ensaio resistentes ao calor. TAMANHO/TAMPA 13 x 100 mm

conjugados humanos #SZBF0920V