Artigo de método

Análise de Sistemas da Resposta Neuroinflammatória e Hemodinâmica à Lesão Cerebral Traumática

DOI:

10.3791/61504

⸱

27 de maio de 2022

 ,  ,  ,  , 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology, 4Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 5Children's Research Scholar, Children's Healthcare of Atlanta

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo apresenta métodos para caracterizar a resposta neuroinflammatória e hemodinâmica à lesão cerebral traumática leve e integrar esses dados como parte de uma análise de sistemas multivariados utilizando regressão parcial de quadrados.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lesões cerebrais traumáticas leves (mTBIs) são um problema significativo de saúde pública. A exposição repetida ao mTBI pode levar a déficits funcionais cumulativos e duradouros. Inúmeros estudos do nosso grupo e outros mostraram que o mTBI estimula a expressão da citocina e ativa a microglia, diminui o fluxo sanguíneo cerebral e o metabolismo, e prejudica a reatividade cerebrovascular. Além disso, vários trabalhos têm relatado associação entre desarranjos nesses marcadores neuroinflammatórios e hemodinâmicos e prejuízos cognitivos. Aqui detalhamos métodos para caracterizar a resposta neuroinflammatória e hemodinâmica ao mTBI em camundongos. Especificamente, descrevemos como executar um modelo de queda de peso de mTBI, como medir longitudinalmente o fluxo sanguíneo cerebral usando uma técnica óptica não invasiva chamada espectroscopia de correlação difusa, e como realizar um imunoensaio multiplexado Luminex em amostras de tecido cerebral para quantificar citocinas e proteínas mifosias imunomodulatórias (por exemplo, dentro das vias MAPK e NFκB) que respondem e regulam a atividade de microglia e outras células imunes neurais. Por fim, detalhamos como integrar esses dados utilizando uma abordagem de análise de sistemas multivariados para entender as relações entre todas essas variáveis. Compreender as relações entre essas variáveis fisiológicas e moleculares nos permitirá, em última análise, identificar mecanismos responsáveis pelo MTBI.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Visão geral
Lesões cerebrais traumáticas leves (mTBIs) impactam ~1,6-3,8 milhões de atletas anualmente1. Essas lesões, incluindo lesões sub-concussivas e concussivas, podem deixar os pacientes com sintomas físicos, emocionais, psicológicos e cognitivos transitórios2. Além disso, o mTBI repetitivo (rmTBI) sustentado dentro de uma "janela de vulnerabilidade" pode levar à gravidade cumulativa e duração de consequências cognitivas que duram mais do que os efeitos de um único mTBIsozinho 3, e, em última instância, até mesmo para perda permanente da função 4,5,6. Embora muitos pacientes se recuperem em um período relativamente curto (<1 semana), 10-40% dos pacientes sofrem efeitos mais duradouros do MTBI por > 1 mês, com alguns durando até 1 ano 3,7,8,9. Apesar da alta prevalência e das consequências duradouras dessas lesões, os mecanismos de lesão são mal compreendidos e não existem estratégias eficazes de tratamento.

Dada a alta variabilidade nos resultados após o mTBI/rmTBI, um desafio na identificação de gatilhos moleculares em estágio inicial a partir de tecidos obtidos em estudos terminais de mTBI/rmTBI é a falta de dados longitudinais demonstrando "ligações moleculares agudas" definitivas desses gatilhos moleculares para desfechos de longo prazo. Para superar esse desafio, nosso grupo descobriu que o fluxo sanguíneo cerebral reduzido agudamente medido agudamente usando uma ferramenta óptica chamada espectroscopia de correlação difusa (DCS), correlaciona fortemente com o desfecho cognitivo de longo prazo em um modelo de camundongo de rmTBI10. Usando este biomarcador hemodinâmico, mostramos que camundongos com fluxo sanguíneo cerebral agudamente baixo (e, por extensão, pior resultado previsto a longo prazo) têm aumentos agudos concomitantes na sinalização de fosfo neuronal dentro das vias MAPK e NFκB, aumentos na expressão neuronal de citocinas pró-inflamatórias e aumentos na expressão do marcador de fagocite/microglialIba111 . Esses dados sugerem um possível papel para a sinalização neuronal, expressão citocina e ativação microglial tanto na regulação aguda do fluxo sanguíneo cerebral pós lesão como no desencadeamento de uma cascata de sinalização que leva a disfunção neuronal e pior desfecho cognitivo. Aqui, detalhamos nossa abordagem para sondar simultaneamente o ambiente hemodinâmico e neuroinflamatório após o RMTBI e como integrar esses complexos conjuntos de dados. Especificamente, delineamos procedimentos para quatro passos-chave para esta abordagem abrangente: (1) um modelo de queda de peso de lesão cerebral traumática leve, (2) avaliação do fluxo sanguíneo cerebral com espectroscopia de correlação difusa, (3) quantificação do ambiente neuroinflamatório e (4) integração de dados (Figura 1). Abaixo, fornecemos uma breve introdução a cada um desses passos-chave para ajudar a orientar os leitores através da lógica por trás de nossos métodos. O restante do manuscrito fornece um protocolo detalhado para cada uma dessas etapas-chave.

Modelo de queda de peso de lesão cerebral traumática leve
Embora muitos excelentes modelos pré-clínicos de TCE leve repetitivo existam 12,13,14,15,16,17,18, empregamos um modelo de lesão de cabeça fechada bem estabelecido e clinicamente relevante. As principais características deste modelo incluem (1) impacto contundente do crânio/couro cabeludo intacto seguido de rotação irrestrita da cabeça sobre o pescoço, (2) nenhuma lesão cerebral estrutural aberta, edema, dano de barreira hematoencefálica, morte celular aguda ou perda crônica do tecido cerebral, e (3) déficits cognitivos persistentes (até 1 ano) que surgem somente após múltiplos acertos19 (Figura 2).

Avaliação do fluxo sanguíneo cerebral com espectroscopia de correlação difusa
Espectroscopia de correlação difusa (DCS) é uma técnica óptica não invasiva que mede o fluxo sanguíneo 5,20,21. Em DCS, uma fonte de luz quase infravermelha é colocada na superfície do tecido. Um detector é colocado a uma distância fixa da fonte na superfície do tecido para detectar a luz que se multiplica espalhada pelo tecido (Figura 3). A dispersão dos glóbulos vermelhos em movimento faz com que a intensidade da luz detectada flutue com o tempo. Um modelo analítico simples conhecido como teoria da difusão de correlação é usado para relacionar essas flutuações de intensidade a um índice de fluxo sanguíneo (CBFi, Figura 4). Embora as unidades da CBFi (cm2/s) não sejam as unidades tradicionais de fluxo (mL/min/100 g), estudo prévio em camundongos mostrou quea CBF se correlaciona fortemente com o fluxo sanguíneo cerebral medido pela ressonância magnética arterial rotulada21.

Para referência, o instrumento DCS utilizado aqui foi construído internamente e é composto por um laser de coerência de 852 nm de comprimento de coerência, uma matriz de 4 fótons contando fotodiodos avalanche, e uma placa de autocorrelador de hardware (tau único, 8 canais, tempo mínimo de amostra de 100 ns)21,22. Os dados são adquiridos com software caseiro escrito no LabView. A interface animal para o dispositivo consiste em uma fibra de origem multimoda de 400 μm (400-2200 nm de comprimento de onda, núcleo de sílica pura, tecs hard cladding) e um detector de modo único de 780 nm (780-970 nm de comprimento de onda, núcleo de sílica pura, tecs hard cladding, 730 ± 30 nm segundo modo de corte) espaçado 6 mm de distância e embutido em um sensor preto impresso em 3D (4 mm x 8 mm, Figura 3).

Quantificação do ambiente neuroinflamatório
Embora a neuroinflamação seja regulada por diversos processos celulares, dois mecanismos relevantes principais são a sinalização extracelular por citocinas/quimiocinas e sinalização intracelular por fosfo-proteínas. Para investigar o ambiente neuroinflamatório do cérebro pós-lesão, os cérebros são extraídos de camundongos, microdissectados, e citocinas/quimiocinas e fosfo-proteínas são quantificadas usando Luminex (Figura 5, Figura 6, Figura 7). Os imunoassedos multiplexados Luminex permitem quantificação simultânea de uma coleção diversificada dessas proteínas, acoplando ensaios imunosorentes ligados a enzimas (ELISAs) a contas magnéticas marcadas fluorescentemente. Etiquetas fluorescentes distintas são usadas para cada proteína de interesse, e contas de cada tag são funcionalizadas com um anticorpo de captura contra essa proteína em particular. Centenas de contas para capturar cada proteína são misturadas, colocadas em uma placa de 96 poços, e incubadas com amostra. Após a incubação da amostra, um ímã é usado para prender as contas no poço enquanto a amostra é lavada. Em seguida, o anticorpo de detecção biotiningada liga-se ao analito de interesse para formar um sanduíche de anticorpo-antígeno semelhante a um ELISA tradicional, mas com o ELISA para cada proteína ocorrendo em uma conta fluorescente diferente marcada fluorescente. Adicionar streptavidina conjugado por ficoerythrin (SAPE) completa cada reação. O instrumento Luminex então lê as contas e separa o sinal de acordo com cada tag/proteína fluorescente.

Integração de dados
Devido ao grande número de analitos (por exemplo, citocinas) medidos no ensaio luminex, a análise de dados pode ser difícil de interpretar se cada proteína quantificada for analisada individualmente. Para simplificar a análise e capturar tendências observadas entre os analitos, utilizamos um método de análise multivariada chamado regressão parcial de quadrados (PLSR, Figura 8)23. A PLSR funciona identificando um eixo de pesos correspondente a cada proteína medida (ou seja, citocinas ou fosforas, referidas como "variáveis preditoras") que, juntas, explicam a covariância das proteínas medidas com uma variável de resposta (por exemplo, fluxo sanguíneo cerebral). Os pesos são chamados de "carregamentos" e são montados em um vetor conhecido como uma variável latente (LV). Ao projetar (chamados de "pontuação") os dados de proteína medidos em cada um dos dois LVs, os dados podem ser re-plotados em termos desses LVs. Após a computação do PLSR, usamos uma rotação varimax para identificar um novo LV que maximiza a covariância entre as projeções amostrais na LV e a variávelpreditor 24. Essa abordagem nos permite definir o LV1 como o eixo para o qual a variância da variável de resposta é melhor explicada. O LV2 maximiza a covariância entre a variável de resposta e os dados residuais LV1, que podem estar associados à variabilidade biológica ou técnica entre as amostras. Por fim, realizamos uma Validação De Uma Saída fora de Ristração (LOOCV) para garantir que o modelo PLSR não dependa fortemente de nenhuma amostra23.

Neste protocolo, detalhamos métodos para caracterizar a resposta neuroinflammatória e hemodinâmica ao mTBI. O fluxo de trabalho geral está descrito na Figura 1. Neste protocolo, os camundongos estão sujeitos a um ou mais mTBIs usando um modelo de lesão na cabeça fechada com queda de peso. O fluxo sanguíneo cerebral é medido longitudinalmente antes e em vários pontos de tempo após a lesão. No momento de interesse para interrogatório de alterações neuroinflamatórias, o animal é eutanizado, e o cérebro é extraído. As regiões de interesse cerebrais são isoladas por microdisseção e, em seguida, lístidas para extrair proteína. Os lysatos são então usados tanto para imunoensatos multiplexados Luminex de citocina e expressão fosfo-proteína, bem como para a mancha ocidental. Finalmente, este conjunto de dados holístico é integrado usando uma análise parcial de regressão de quadrados.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os procedimentos animais são aprovados pelo Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais da Universidade Emory (IACUC) e seguiram as Diretrizes do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Modelo de queda de peso de lesão cerebral traumática leve

  1. Prepare a configuração de queda de peso. Monte uma víse sobre uma superfície plana com um tubo-guia de 1 m (2,54 cm de diâmetro interno) alinhado verticalmente (verifique usando um nível). Use um parafuso de 54 g (0,95 cm de diâmetro básico do corpo, 2 cm de diâmetro da cabeça, 10,2 cm de comprimento) para o impacto.
  2. Anesthetize brevemente o rato. Induzir o rato com 4,5% de isoflurane em 100% de oxigênio por 45 segundos. Confirme a profundidade suficiente da anestesia pela falta de uma resposta de beliscão do dedo do dedo do dedo.
  3. Induzir lesão.
    1. Remova rapidamente o rato da anestesia e coloque o rato propenso no centro de uma membrana fina (tecido de 11,2 cm x 21,3 cm).
    2. Use ambas as mãos para segurar o tecido esticado com o mouse propenso no centro. Segure a cauda do rato sob um polegar. Posicione a cabeça do mouse sob o tubo-guia (Figura 2).
    3. Solte o parafuso do topo do tubo-guia sobre o aspecto dorsal da cabeça do mouse, visando o impacto entre a parte de trás dos olhos e a frente das orelhas. Com o impacto, o camundongo penetrará no tecido, permitindo uma aceleração rápida da cabeça sobre o pescoço (Figura 2).
  4. Recuperação
    1. Após o impacto, coloque o supino do mouse em uma almofada de aquecimento de 37 °C no ar da sala. Monitore a recuperação por 1h após a lesão. Dentro de 1h, os ratos devem ser capazes de ambular normalmente, encontrar alimentos e água, e não apresentar déficits motores brutos.
      NOTA: A analgesia não é utilizada por aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais, o que se justifica devido à influência confusa da analgesia sobre os parâmetros de interesse (ou seja, fluxo sanguíneo cerebral, marcadores de inflamação). A perda de consciência, definida como o tempo da remoção da anestesia para o tempo de recuperação do reflexo direito, é esperada e normalmente dura de 20 a 3 minutos (Tabela Suplementar 1). Podem ser observados episódios breves (<30) de apneia e/ou atividade semelhante a convulsões, particularmente após lesões repetitivas na cabeça espaçadas uma vez por dia.
  5. Repita conforme necessário. Essa lesão pode ser repetida uma vez por dia, semanal ou mensal. O número e o espaçamento das lesões dependem da gravidade da lesão desejada. Normalmente, empregamos cinco hits espaçados uma vez por dia para induzir déficits robustos na aprendizagem espacial e na memória.
    NOTA: Estudos anteriores mostraram que cinco acessos espaçados uma vez por dia são suficientes para induzir déficits na aprendizagem espacial e na memória que duram mais de 1 ano após a lesão sem edema, hemorragia ou lesão estrutural excessiva no cérebro19. Os camundongos são pesados diariamente e acompanhados de perto por sinais de desidratação, déficits motores e perda de apetite. Se desidratados, os camundongos recebem uma chow úmida e uma injeção subcutânea de 1 mL de soro fisiológico uma vez por dia. A fim de prevenir o sofrimento desnecessário e garantir um ponto final humano, os camundongos são eutanizados se: a desidratação persiste ou piora > tratamento salino pós-subcutâneo de 24 horas, o peso corporal diminui em mais de 20% da linha de base pré-lesão, déficits motores como circulação ou arrasto de patas aparecem e persistem >1 h após a lesão.

2. Avaliação do fluxo sanguíneo cerebral com espectroscopia de correlação difusa

  1. Aquisição de dados dcs
    1. Remova o cabelo no couro cabeludo. Como o DCS funciona melhor na ausência de cabelo, é necessário remover peles na cabeça antes do início dos experimentos. Normalmente, a depilação é feita 1-3 dias antes do início do estudo.
      1. Induzir camundongos com 4,5% de isoflurane em 100% oxigênio por 45 segundos e manter com 1-2% de isoflurane em 100% oxigênio.
      2. Raspe a cabeça entre os olhos e as orelhas. Em seguida, use creme depilatório para remover a pele na cabeça como na Figura 3.
      3. Permita que o animal se recupere da anestesia em uma almofada de aquecimento e depois retorne à gaiola.
    2. Meça o fluxo sanguíneo cerebral com DCS. Para minimizar artefatos de movimento durante a medição, estude camundongos sob breve anestesia isoflurane.
      NOTA: Monitore visualmente a respiração e a resposta do dedo do dedo do dedo durante as medições e ajuste a concentração de isoflurane conforme necessário para garantir uma profundidade consistente da anestesia. Variações significativas na profundidade da anestesia podem alterar o fluxo sanguíneo dado os conhecidos efeitos vasomodulatórios do isoflurane25.
      1. Induzir com 4,5% de isoflurane em 100% oxigênio por 45 segundos, e depois manter com 1,0-1,75% de isoflurano em 100% oxigênio. Confirme a profundidade suficiente da anestesia pela ausência de uma resposta de beliscão do dedo do pé e respiração normal (entre ~60-80 respirações por minuto).
      2. Após um período de estabilização de 2 minutos, descanse suavemente o sensor DCS sobre o hemisfério direito de tal forma que a borda superior do sensor óptico se alinha com a parte de trás do olho e o lado do sensor se alinha ao longo da linha média (Figura 3). Entregue uma mão sobre o sensor para proteger da luz da sala. Adquirir 5 segundos de dados (aquisição de 1 Hz).
      3. Reposicione o sensor sobre o hemisfério esquerdo, e adquira 5 segundos de dados.
      4. Repita 3 vezes/hemisfério para explicar as heterogeneidades locais sob a superfície do tecido.
    3. Recuperação
      1. Remova o rato da anestesia e coloque em uma almofada de aquecimento.
      2. Depois que o rato recuperar seu reflexo de direito, devolva-o para a gaiola.
  2. Análise de dados do DCS
    1. Realize o controle inicial de qualidade. Cada quadro de dados do DCS consiste em uma função de autocorrelação de intensidade normalizada medida, figure-protocol-1 (Figura 4A) e taxa de contagem de fótons (kHz).
      1. Para remover quadros de dados com artefato de movimento significativo, descarte quadros de dados para os quais o valor médio da cauda da figure-protocol-2 curva (ou seja, figure-protocol-3) é > 1.005.
      2. Para remover os quadros de dados com baixa relação sinal-ruído, descarte os quadros de dados se a taxa de contagem de fótons detectada for < de 20 kHz.
    2. Extrair índice de fluxo sanguíneo cerebral. Usando fminsearch no Matlab, encaixe cada quadro figure-protocol-4de dados medido para CBFi(i). Restringir ajustes e figure-protocol-5encontrar o valor da CBFi que minimize a seguinte função de custo:
      figure-protocol-6
      Onde a soma é sobre todos os temposfigure-protocol-7 de atraso medidos, e figure-protocol-8 é a solução homogênea semi-infinita da equação de difusão de correlação (Figura 4B):
      figure-protocol-9
      Aqui β é um fator de coerência determinado pela configuração experimental, figure-protocol-10, figure-protocol-11, figure-protocol-12figure-protocol-13, figure-protocol-14, , Reff =0,493 para um suposto índice tecidual de refração de 1,4, ρ é de 6 mm, e μa e μ são a absorção e redução do coeficiente de dispersão do tecido (presumido ser 0,25 e 9,4/cm, respectivamente 10,26,27).
      NOTA: Como β pode variar ~10% ao longo do tempo, encaixe cada quadro de dados para β e CBFi simultaneamente.
    3. Realize o controle de qualidade secundário. Dentro de cada repetição (que consiste em 5 quadros de dados), descarte outliers. Os outliers são definidos como os valoresda CBF i que ficam fora de 1,5 desvios padrão da média CBFi para essa repetição. Se mais de 1 ponto de dados for identificado como um outlier, descarte toda a repetição.
    4. Estimativa do índice médio de fluxo sanguíneo cerebral: Estime uma média de CBFi por hemisfério, tomando a média em todos os quadros de dados para todas as repetições (Figura 4C). Se não forem observadas diferenças hemisféricas significativas, a média entre os hemisférios obterá uma estimativa da média global da CBFi.

3. Quantificação multiplexada de citocinas e fosfo-proteínas usando ensaios luminex

  1. Extração de tecido
    NOTA: Quantificação de citocinas cerebrais e proteínas de fosfo-sinalização usando Luminex requer extração de tecido.
    1. Anestesize o rato usando 4,5% de isoflurane em 100% de oxigênio por 1-2 min. Verifique se há um plano profundo de anestesia através da falta de uma resposta de beliscão do dedo do dedo do dedo. Eutanize através da decapitação.
    2. Colhe o tecido.
      1. Remova o cérebro. Tipicamente, fixar o hemisfério esquerdo para histologia e microdissect várias regiões do hemisfério direito dentro do córtex e hipocampo (Figura 5).
      2. Coloque amostras dissecadas em tubos de microcentrifuus, congelamento de flash em nitrogênio líquido. Para análise de proteínas sensíveis ao congelamento, é ideal sub-dividir seções teciduais antes do congelamento de flash para evitar o congelamento posterior.
        NOTA: O protocolo pode ser pausado, e as amostras de tecido podem ser armazenadas a -80 °C até que estejam prontas para lise amostras. Alternativamente, as amostras podem ser colhidas e armazenadas a -80 °C.
    3. Lyse amostras.
      1. Prepare o tampão de lise adicionando inibidor de protease e fluoreto de fenilmetilsulfonil de 2 mM ao tampão de lise.
      2. Adicione 150 μL do tampão de lise mista por aproximadamente 3 μg de tecido animal. Para referência, as amostras de tecido do córtex visual do rato são de aproximadamente 3 μg.
      3. Para homogeneizar o tecido, triturar mecanicamente o tecido por tubulação para cima e para baixo ~15-20 vezes usando uma pipeta de 1000 μL. Para a trituração amostral ideal, pode-se usar um pilão homogeneizador.
      4. Coloque os tubos de amostra em um rotador por 30 min a 4°C.
      5. Centrifugar as amostras a 4°C por 10 min a aproximadamente 15.000 x g, e coletar o sobrenante. As amostras podem ser processadas imediatamente ou armazenadas a -80°C para análise posterior.
        NOTA: Os lysates de amostra preparados usando este protocolo são compatíveis com a mancha ocidental, a partir da qual o marcador fagocite/microglial Iba1 e/ou o marcador de ativação de astrócito GFAP podem ser analisados para complementar a análise de citocina e fosfo-proteína para estudos de neuroinflamação11.
  2. Protocolo de ensaio de imunossusão multiplex para citocinas e proteínas fosfo
    NOTA: Embora semelhantes no geral, existem algumas pequenas diferenças nos protocolos para kits de citocina e proteína fosfo. As diferenças são notadas em cada etapa. Os passos para preparar amostras para o ensaio Luminex estão descritos abaixo.
    1. Preparação de reagentes (dia 1, mesmo para citocinas e fosfo-proteínas)
      1. Deixe os reagentes aquecerem até a temperatura ambiente (~30 min).
      2. Garrafas de contas magnéticas multiplex sonicato por 30 segundos seguidos por 1 min de vórtice. Certifique-se de que as contas magnéticas multiplex sejam protegidas da luz com papel alumínio ou use garrafas de proteção à luz fornecidas.
      3. Prepare o tampão de lavagem misturando 0,1% Tween20 em 1xPBS ou, alternativamente, use o tampão de lavagem fornecido no kit.
    2. Preparação de amostras de tecido lysed (dia 1, mesmo para citocinas e fosfo-proteínas)
      1. Se previamente congelado, remova amostras de tecidos lysed do congelador e deixe descongelar no gelo (~20 min). Amostras centrífugas por 10 min a 9.167 x g para remover precipitado.
      2. Prepare 25 μL de amostra na concentração proteica ideal determinada pela análise de alcance linear (ver seção 3.3). Para normalizar o volume total de todas as amostras, diluir amostras no tampão de ensaio fornecido no kit.
    3. Preparação de 96 placas de poço (dia 1, mesmo para citocinas e fosfo-proteínas)
      1. Use a placa 96 bem incluída no kit ou uma com um fundo fino (por exemplo, Brand Tech).
      2. Adicione 200 μL de tampão de lavagem (ou 1x PBS, 0,1% Tween) em cada poço e misture no shaker de placa por 10 min a 750 rpm.
      3. Tampão de lavagem decanteco e bata a placa em uma toalha de papel para remover o resíduo.
    4. Procedimento de imunoensaio para Citocinas (dia 1)
      1. Adicione o seguinte a cada poço em ordem.
        1. Adicione 25 μL de tampão de ensaio a todos os poços.
          1. Adicione 25 μL de tampão de ensaio adicional SOMENTE aos poços de fundo. Para cada corrida experimental, tenha pelo menos dois poços de fundo. Os poços de fundo não possuem amostra carregada e definem a intensidade fluorescente lida pelo instrumento sem amostra.
          2. Adicione 25 μL de cada amostra diluída aos poços de amostra correspondentes.
          3. Adicione 25 μL de contas magnéticas multiplex de 1x a todos os poços (Figura 6). Certifique-se de vórtice de contas por 1 min antes de adicionar a poços.
      2. Veda a placa com selador de placa e cubra a placa com papel alumínio. Incubar durante a noite (12-16 h) a 2-8 °C.
    5. Procedimento de imunoensaio para citocinas (dia 2)
      1. Coloque 96 placas bem no separador magnético, certificando-se de que os poços estejam alinhados com os ímãs. Deixe descansar por 2 minutos. Decantar o conteúdo do poço enquanto a placa ainda está presa ao separador magnético.
      2. Lave a placa 2 vezes usando as seguintes etapas.
        1. Adicione 200 μL de tampão de lavagem a cada poço e coloque no shaker por 2 minutos à temperatura ambiente.
        2. Coloque a placa do poço no separador magnético por 2 minutos à temperatura ambiente.
        3. Decantar o conteúdo do poço enquanto a placa do poço ainda está presa ao separador magnético.
      3. Adicione 25 μL de anticorpo de detecção por poço (Figura 6). Cubra com papel alumínio. Incubar por 1 hora em um agitador de pratos (750 rpm) em temperatura ambiente.
      4. Deixe o anticorpo de detecção e adicione 25 μL de streptavidin-phycoerythrin (SAPE) a cada poço (Figura 6). Cubra com papel alumínio. Incubar por 30 min no shaker de pratos (750 rpm) em temperatura ambiente.
      5. Coloque a placa do poço em um separador magnético e deixe descansar por 2 minutos. Decantar bem o conteúdo e desprender-se do separador magnético.
      6. Lave bem a placa duas vezes (ver passo 3.2.5.2).
      7. Adicione 75 μL de Fluido de Unidade Luminex (se usar instrumento MAGPIX) a cada bem ou tampão de ensaio (se usar o instrumento 3D 200 ou FlexMap). Suspenda as contas no agitador de pratos por 5 minutos em temperatura ambiente.
      8. Leia no Instrumento Luminex (MAGPIX, 200 ou FlexMap 3D), referindo-se ao manual do usuário para operação adequada (Figura 6).
    6. Procedimento de imunoensaio para proteínas fosfo (dia 1)
      1. Adicione o seguinte a cada poço em ordem.
        1. Adicione 25 μL de tampão de ensaio a todos os poços.
          1. Adicione 25 μL de tampão de ensaio adicional SOMENTE aos poços de fundo. Para cada corrida experimental, recomenda-se ter pelo menos dois poços de fundo. Os poços de fundo não possuem amostra carregada e definem a intensidade fluorescente lida pelo instrumento sem amostra.
          2. Adicione 25 μL de cada amostra diluída a cada amostra bem.
          3. Adicione 25 μL de contas magnéticas multiplex de 1x a todos os poços (Figura 6).
            NOTA: O kit de ensaio Luminex fornece contas magnéticas multiplex em solução de estoque de 20x. Certifique-se de obter uma solução de multiplexa magnética de 20x de estoque de vortex por 2 minutos e, em seguida, diluí-la no tampão de ensaio para a solução 1x. Vortex 1x multiplex suspensão de contas magnéticas por 1 minuto antes de adicionar a poços.
        2. Veda a placa com selador de placa e cubra a placa com papel alumínio. Incubar durante a noite (12-16 horas) a 2-8 °C.
    7. Procedimento de imunoensaio para proteínas fosfo (dia 2)
      1. Coloque a placa do poço em um separador magnético, certificando-se de que a placa do poço esteja totalmente alinhada com o separador magnético. Deixe descansar por 2 minutos. Decantar o conteúdo do poço enquanto a placa do poço ainda está presa ao separador magnético.
      2. Lave a placa 2 vezes (veja o passo b no procedimento de imunoensaio da citocina dia 2).
      3. Diluir o anticorpo de detecção de estoque de 20x para 1x solução no tampão de ensaio. Adicione 25 μL de anticorpo de detecção de 1x por poço (Figura 6). Cubra com papel alumínio. Incubar por 1h no shaker de placa (750 rpm) em temperatura ambiente.
      4. Coloque a placa 96 bem no separador magnético, e deixe sentar por 2 minutos. Decantar bem o conteúdo, desprender-se do separador magnético.
      5. Diluir 25x de estoque SAPE no tampão de ensaio para 1x tampão. Adicione 25 μL de 1x SAPE (Figura 6). Cubra com papel alumínio e incubar por 15 min no shaker de pratos (750 rpm) à temperatura ambiente.
      6. Deixe o SAPE em poços e adicione 25 μL de tampão de amplificação a cada poço. Cubra com papel alumínio.
      7. Incubar por 15 min no shaker de placa (750 rpm) em temperatura ambiente.
      8. Coloque a placa do poço no separador magnético por 2 minutos. Decantar o conteúdo do poço e desprender-se do separador magnético.
      9. Adicione 75 μL de Luminex Drive Fluid (se estiver usando instrumento MAGPIX) ou tampão de ensaio (se usar o instrumento 3D 200 ou FlexMap). Suspenda as contas em um agitador de pratos por 5 minutos em temperatura ambiente.
      10. Leia no instrumento Luminex (MAGPIX, 200 ou FlexMap 3D), referindo-se ao manual do usuário para operação adequada (Figura 6).
  3. Linearidade da curva de diluição amostral
    1. Preparação de amostras: Amostras de teste diluídos em série com diferente concentração de proteína total. Para tecidos cerebrais a granel, carregue diluições seriais de 0-25 μg para citocinas e 0-12 μg para proteínas fosfo. A concentração total de proteínas pode ser medida utilizando o ensaio de ácido bicinchonínico (BCA).
    2. Imunoensaio multiplex: Realize o ensaio Luminex (ver seção 3.2) em amostras selecionadas.
    3. Análise de dados
      1. Plota intensidade fluorescente para cada proteína versus quantidade de proteína carregada (Figura 7).
      2. Para cada analito, identifique a faixa de proteína total carregada para a qual a relação entre a proteína total e a leitura da intensidade fluorescente é linear (Figura 7).
      3. Para determinar a quantidade de proteína total que deve ser carregada para a corrida completa do ensaio, identifique a porção linear da curva para cada analito e selecione uma concentração proteica que se encai sobre a faixa linear para a maioria dos analitos.
        NOTA: Embora a maioria das proteínas compartilhem uma faixa linear semelhante, as faixas lineares podem não se sobrepor a todas as proteínas. Se este for o caso, pode ser necessário executar cada amostra várias vezes com diferentes quantidades de proteína total carregada. Alternativamente, amostras não lineares podem ser deixadas de fora da análise. Além disso, algumas proteínas podem não ter uma faixa linear.

4. Regressão parcial de quadrados mínimos

NOTA: O código da amostra R e uma planilha de dados de amostra são fornecidos para realizar a Análise Parcial de Quadrados Mínimos.

  1. Preparação de dados: Formatar os dados conforme mostrado na planilha de dados de amostra fornecida, "MyData". Incluem nomes de variáveis na linha 1, nomes de amostra na coluna A, a variável resposta na coluna B e todas as variáveis preditoras nas colunas C+. Preencha as duas últimas linhas com os dados de fundo e defina ambos os nomes de amostra para "Fundo".
  2. Regressão Parcial de Praças no RStudio
    1. Instale R a partir de www.r-project.org (livre, código aberto).
    2. Instale o RStudio Desktop a partir de www.rstudio.com (licença gratuita de código aberto).
    3. Baixe o código R da amostra fornecido com esta publicação, "PLSR_Sample_Code.R" e salve-o na mesma pasta que contém a planilha de dados. Abra o arquivo de código no RStudio.
    4. Na seção Entrada de usuário , altere "dataFileName" para o nome da planilha de dados.
    5. Execute as seguintes etapas, destacando a seção de código para execução e clique em Executar no canto superior direito do script.
      1. Carregar pacotes R necessários, funções, o endereço do diretório de trabalho e os valores de entrada do usuário no RStudio (subseção "Preliminares").
      2. Carregue os dados no RStudio e prepare dados brutos para processamento subtraindo sinal de fundo médio de todas as medições e z-scoreing cada analito (subseção "Leia dados e fundo de subtrair")(Figura 8A).
      3. Realize a regressão parcial de quadrados mínimos no RStudio usando o pacote plsRglm v1.2.528 disponível na Rede de Arquivo R Abrangente (CRAN). Realize uma rotação varimax (pacote de estatísticas v3.6.2)23 no plano LV1-LV2 para identificar um novo eixo horizontal que melhor separe amostras pela variável de resposta (subseção "PLS")(Figura 8B).
      4. Realize uma Validação Cruzada leave one out (LOOCV) na qual uma amostra é iterativamente deixada de fora dos dados e o modelo PLSR é re-computado. Compute o desvio padrão para carregamentos de analito em todas as corridas loocv (subseção "LOOCV").
  3. Crie plots representativos: Execute o código de amostra fornecido conforme detalhado acima para criar parcelas representativas que exportem automaticamente como arquivos pdf para o diretório de trabalho (a pasta que contém os dados e arquivos de código).
    1. Crie um mapa de calor dos dados processados conforme mostrado na Figura 8A (subseção "PLS"). Colora cada entrada ao longo de um espectro definido por pontuação z. Classificar analitos pela ordem calculada na variável latente de interesse.
    2. Crie um gráfico de pontuação com pontuações LV1 plotadas ao longo do eixo horizontal e escores LV2 plotados ao longo do eixo vertical, como mostrado na Figura 8B (subseção "PLS"). Colorir cada ponto de dados de acordo com sua medição variável de resposta para visualizar a relação entre cada variável latente e a variável resposta.
    3. Crie um gráfico de barras exibindo carregamentos para cada uma de suas variáveis preditoras para visualizar como cada analito contribui para as variáveis latentes, como mostrado na Figura 8C (subseção "LOOCV").
    4. Crie uma pontuação LV1 de regressão de gráficos contra sua variável de resposta para visualizar o quão bem o modelo PLSR separa as amostras, como mostrado na Figura 8D (subseção "PLS").

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os dados coletados anteriormente foram extraídos de trabalhos anteriores em que um grupo de oito camundongos C57BL/6 foram submetidos a três lesões na cabeça fechada (Figura 2) espaçadas uma vez por dia11. Neste trabalho, o fluxo sanguíneo cerebral foi medido com espectroscopia de correlação difusa 4h após a última lesão (Figura 3, Figura 4). Após avaliação pós-lesão da CBF, os animais foram eutanizados, e o ...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui detalhamos métodos para avaliação da resposta hemodinâmica e neuroinflamatória à lesão cerebral traumática leve repetitiva. Além disso, mostramos como integrar esses dados como parte de uma análise de sistemas multivariados usando regressão parcial de quadrados. No texto abaixo discutiremos algumas das principais etapas e limitações associadas ao protocolo, bem como as vantagens/desvantagens dos métodos sobre os métodos existentes.

Modelo de queda de peso de lesão cerebral traumát...

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Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este projeto foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde R21 NS104801 (EMB) e R01 NS115994 (LBW/EB) e Pelo Prêmio Focado na Saúde Infantil de Atlanta Junior Faculty Focused (EMB). Este trabalho também foi apoiado pelo Departamento de Defesa dos EUA através dos Programas de Pesquisa Médica Dirigidos pelo Congresso sob o Prêmio Nº. W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB). Opiniões, interpretações, conclusões e recomendações são do autor e não são necessariamente endossadas pelo Departamento de Defesa. Este material é baseado em trabalho apoiado pelo Programa de Bolsas de Pós-Graduação em Pesquisa da Fundação Nacional de Ciência sob o grant no. 1937971. Quaisquer opiniões, achados e conclusões ou recomendações expressas neste material são dos autores e não refletem necessariamente as opiniões da Fundação Nacional de Ciência.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pipetasqualquer pipeta ajustável
Folha de alumínioVWR89107-726
Kit de lise celular Bio-PlexC Bio-Rad171304012
MARCA MARCAplacas de grau puro Microplacas, não estéreisBrandTech781602 96
Comprimido completo de inibidor de mini proteaseSigma-Aldrich11836153001
Creme depilatórioAmazonNair
DiH2OVWRVWRL0200-1000
Bloco separador magnético portátil para placas de fundo plano de 96 poçosCatálogo Millipore Sigma40-285
Placa Autocorrelacionadora de Hardwarewww.correlator.comFlex05-8ch
Isoflurano 250 mLMED-VET INTERNATIONALRXISO-250
Kimwipe (11,2 x 21,3 cm)VWR21905-026
Misturador de vórtice de laboratórioVWR10153-838
LabViewNational InstrumentsLabVIEW
Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D ou MAGPIX com software xPONENTLuminex Corporation
Luminex Drive FluidLuminexMPXDF-4PK
Fluido de bainha LuminexEMD MilliporeSHEATHFLUID
MILLIPLEX MAP Painel de esferas magnéticas de citocina/quimepina de camundongo - Pré-misturado 32 Plex - Imunologia Ensaio MultiplexMillipore SigmaMCYTMAG-70K-PX32
MILLIPLEX MAPK/SAPK Sinalização 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex AssayMillipore Sigma48-660MAG
Mini LabRoller rotatorVWR10136-084
Fluoreto de fenilmetilsulfoniloSigma-AldrichP7626-1G
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)VWR97064-158
Seladora de placasVWR82050-992
Tubos de microfífugas de polipropilenoVWR20901-547
Mini LabRollerMillipore SigmaZ674591
Reservatórios de reagentesVWR89094-668
R Linguagem
RStudiowww.rstudio.com
Sonicator
Agitador de placas de titulaçãoVWR12620-926
Tween20Sigma-AldrichP9416-50ML
Tubo guia acrílico de 1 mMcMaster-Carr49035K85
4 fotões contando avalanche fotodiodoPerkin-ElmerSPCM-AQ4C-IO
400 um fibra de fonte multimodoThorlabs Inc.FT-400-EMT
parafuso de 54 gAce Hardware0,95 cm de diâmetro básico do corpo, 2 cm de diâmetro da cabeça, 10,2 cm de comprimento
780 nm de fibra detectora de modo únicoThorlabs Inc.780HP
852 nm laser de comprimento de longa coerênciaTOPTICA PhotonicsiBeam smart
ajustáveis de programação

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Langlois, J. A., Rutland-Brown, W., Wald, M. M. The epidemiology and impact of traumatic brain injury: a brief overview. Journal of Head Trauma Rehabilitation. 21 (5), 375-378 (2006).
  2. Iraji, A., et al. Resting State Functional Connectivity in Mild Traumatic Brain Injury at the Acute Stage: Independent Component and Seed-Based Analyses. Journal of Neurotrauma. 32 (14), 1031-1045 (2015).
  3. Guskiewicz, K. M., et al. Cumulative effects associated with recurrent concussion in collegiate football players: the NCAA Concussion Study. Journal of the American Medical Association. 290 (19), 2549-2555 (2003).
  4. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).
  5. Committee on Sports-Related Concussions in Youth, Board on Children, Youth, and Families, Institute of Medicine, National Research Council. Sports-Related Concussions in Youth: Improving the Science, Changing the Culture. , National Academies Press (US). Washington (DC). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK169016/ (2014).
  6. Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. The Molecular Pathophysiology of Concussive Brain Injury - an Update. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 27 (2), 373-393 (2016).
  7. McCrory, P., et al. Consensus statement on concussion in sport--the 4th International Conference on Concussion in Sport held in Zurich, November 2012. Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (2), 89-117 (2012).
  8. Belanger, H. G., Vanderploeg, R. D., Curtiss, G., Warden, D. L. Recent neuroimaging techniques in mild traumatic brain injury. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neurosciences. 19 (1), 5-20 (2007).
  9. Sours, C., Zhuo, J., Roys, S., Shanmuganathan, K., Gullapalli, R. P. Disruptions in Resting State Functional Connectivity and Cerebral Blood Flow in Mild Traumatic Brain Injury Patients. PLoS ONE. 10 (8), 0134019(2015).
  10. Buckley, E. M., et al. Decreased Microvascular Cerebral Blood Flow Assessed by Diffuse Correlation Spectroscopy after Repetitive Concussions in Mice. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (12), 1995-2000 (2015).
  11. Sankar, S. B., et al. Low cerebral blood flow is a non-invasive biomarker of neuroinflammation after repetitive mild traumatic brain injury. Neurobiology of Disease. 124, 544-554 (2019).
  12. Vagnozzi, R., et al. Temporal window of metabolic brain vulnerability to concussions: mitochondrial-related impairment--part I. Neurosurgery. 61, 379-388 (2007).
  13. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56, 364-374 (2005).
  14. Fujita, M., Wei, E. P., Povlishock, J. T. Intensity- and interval-specific repetitive traumatic brain injury can evoke both axonal and microvascular damage. Journal of Neurotrauma. 29, 2172-2180 (2012).
  15. Angoa-Perez, M., et al. Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between preclinical research and clinical reality. Journal of Neurochemistry. 129, 916-931 (2014).
  16. Prins, M. L., Hales, A., Reger, M., Giza, C. C., Hovda, D. A. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Developmental Neuroscience. 32, 510-518 (2010).
  17. Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Saljo, A. Concussion in professional football: animal model of brain injury--part 15. Neurosurgery. 64, 1162-1173 (2009).
  18. Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Methods. 203, 41-49 (2012).
  19. Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing Recovery Time Between Injuries Improves Cognitive Outcome After Repetitive Mild Concussive Brain Injuries in Mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-892 (2012).
  20. Durduran, T., Yodh, A. G. Diffuse correlation spectroscopy for non-invasive, micro-vascular cerebral blood flow measurement. NeuroImage. 85, 51-63 (2014).
  21. Sathialingam, E., et al. Small separation diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow in rodents. Biomedical Optics Express. 9 (11), 5719(2018).
  22. Lee, S. Y., et al. Noninvasive optical assessment of resting-state cerebral blood flow in children with sickle cell disease. Neurophotonics. 6 (03), 1(2019).
  23. Wang, H., Liu, Q., Tu, Y. Interpretation of partial least-squares regression models with VARIMAX rotation. Partial Least Squares. 48 (1), 207-219 (2005).
  24. Eriksson, L., Byrne, T., Johansson, E., Trygg, J., Vikström, C. Multi- and Megavariate Data Analysis Basic Principles and Applications. Umetrics Academy. , (2013).
  25. Conzen, P. F., et al. Systemic and regional hemodynamics of isoflurane and sevoflurane in rats. Anesthesia and Analgesia. 74 (1), 79-88 (1992).
  26. Durduran, T., Choe, R., Baker, W. B., Yodh, A. G. Diffuse optics for tissue monitoring and tomography. Reports on Progress in Physics. 73 (7), 076701(2010).
  27. Lee, S. Y., et al. Small separation frequency-domain near-infrared spectroscopy for the recovery of tissue optical properties at millimeter depths. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5362-5377 (2019).
  28. Bertrand, F., Maumy-Bertrand, M. plsRglm: Partial Least Squares Regression for Generalized Linear Models. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=pplsRglm (2019).
  29. White, B. R., Bauer, A. Q., Snyder, A. Z., Schlaggar, B. L., Lee, J. M., Culver, J. P. Imaging of functional connectivity in the mouse brain. PLoS One. 6, 16322(2011).
  30. Buckley, E. M., Parthasarathy, A. B., Grant, P. E., Yodh, A. G., Franceschini, M. A. Diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow: future prospects. Neurophotonics. 1 (1), 011009(2014).
  31. Rowan, O., et al. Cerebrovascular reactivity measured in awake mice using diffuse correlation spectroscopy. Neurophotonics. 8 (1), (2021).
  32. Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist. Reviews. 25 (2), 105-120 (2004).
  33. Staples, E., Ingram, R. J. M., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
  34. Gierut, J. J., et al. Network-level effects of kinase inhibitors modulate TNF-α-induced apoptosis in the intestinal epithelium. Science Signaling. 8 (407), 129(2015).

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