Artigo de método

Análise funcional de células mieloides infiltrantes de tumor por citometria de fluxo e transferência adotiva

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DOI:

10.3791/61511

⸱

5 de março de 2021

 ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, McMaster University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo fornece métodos confiáveis de dissociação de tumores sólidos e isolamento de células mieloides em modelos de tumores intradérmicos ou subcutâneos murinos. A citometria de fluxo permite a caracterização fenotípica de populações mieloides heterogêneas dentro do microambiente tumoral e a classificação demonstrará sua funcionalidade no contexto da transferência adotiva.

Resumo

O compartimento de células mielóides infiltrantes do tumor representa uma população heterogênea de células amplamente imunossupressoras que foram exploradas pelo tumor para apoiar seu crescimento. Seu acúmulo no tumor e no tecido linfóide secundário leva à supressão das respostas imunes antitumorais e, portanto, é alvo de intervenção terapêutica. Como se sabe que o meio local de citocinas pode ditar a programação funcional das células mieloides infiltrantes de tumores, estratégias foram elaboradas para manipular o microambiente tumoral (TME) para expressar um cenário de citocinas mais propício à atividade das células mieloides antitumorais. Para avaliar as alterações induzidas pela terapia em células mieloides infiltrantes de tumor, este artigo descreverá o procedimento para dissociar o tecido tumoral intradérmico/subcutâneo de camundongos portadores de tumor sólido em preparação para a recuperação de leucócitos. Estratégias para análise de citometria de fluxo serão fornecidas para permitir a identificação de populações mieloides heterogêneas dentro de leucócitos isolados e a caracterização de fenótipos mieloides únicos. Por fim, este artigo descreverá um meio de purificar células mieloides viáveis para ensaios funcionais e determinar seu valor terapêutico no contexto da transferência adotiva.

Introdução

O microambiente tumoral (TME) é composto por células neoplásicas de rápida proliferação e um compartimento de células estromais heterogêneas circundantes. Como os tumores em crescimento são frequentemente pouco vascularizados, o TME é um local periférico caracterizado exclusivamente por hipóxia, privação de nutrientes e acidose1. Para sobreviver nesse cenário, as respostas ao estresse tumoral e a reprogramação metabólica resultam na secreção de fatores solúveis que promovem a remodelação tecidual e a angiogênese, bem como o recrutamento seletivo de células imunes2. Como as células mieloides são um dos tipos mais abundantes de células hematopoiéticas no TME, há um interesse crescente em examinar o papel das células mieloides infiltrantes de tumor no TME.

As células mieloides são um grupo heterogêneo e plástico de células imunes inatas, incluindo monócitos, macrófagos, células dendríticas e granulócitos. Embora tenham papéis críticos na homeostase tecidual e na regulação da resposta imune adaptativa, sua função pode ser polarizadora dependendo da composição dos sinais de ativação dentro do microambiente local3. Os tumores aproveitam as características das células mieloides por meio da secreção de fatores solúveis dentro do TME. Esses sinais alternativos podem desviar a mielopoiese para a diferenciação imatura e distorcer a função das células mieloides infiltrantes de tumor existentes3. De fato, as células mieloides dentro do TME geralmente promovem a progressão do câncer e podem suprimir as respostas imunes antitumorais, levando a efeitos adversos na terapia do câncer.

Embora as estratégias terapêuticas que promovem a depleção de células mieloides imunossupressoras tenham demonstrado retardar o crescimento tumoral4, a falta de especificidade do alvo corre o risco de remoção de células mieloides imunoestimuladoras, que, por outro lado, auxiliam na resolução do câncer. Essas células mieloides inflamatórias podem exercer efeitos antitumorais profundos, incluindo morte direta de células tumorais e ativação de células T CD8+ citotóxicas5. Alternativamente, estratégias que normalizam a composição e a função das células mieloides no TME têm mostrado sucesso terapêutico6; no entanto, os mecanismos biológicos subjacentes à sua reeducação em direção a um fenótipo antitumoral ainda não foram totalmente compreendidos. Em última análise, uma caracterização abrangente das células mieloides tumorais é necessária para melhorar ainda mais a terapia do câncer.

Infelizmente, a desagregação reprodutível de tumores para isolamento de células mieloides é um desafio. As células mieloides derivadas de tumores são sensíveis à manipulação ex vivo em comparação com outros subconjuntos de leucócitos, e a agressividade do processamento do tumor pode levar à clivagem enzimática do epítopo e à redução da viabilidade das células recuperadas7. O objetivo deste método é fornecer um meio confiável de dissociação tumoral para preservar a integridade do marcador de superfície para análise e a vitalidade celular para estudo funcional. Em comparação com os protocolos de isolamento de leucócitos infiltrantes de tumor (TIL) que favorecem misturas enzimáticas mais severas para aumentar a liberação reprodutível de vários subconjuntos celulares, esse método favorece uma digestão enzimática mais conservadora para maximizar a recuperação das células mieloides. Estratégias de gating de fluxo multicolorido de alto nível também são fornecidas para identificar subconjuntos de células mieloides de tumores murinos para posterior caracterização e/ou classificação.

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Protocolo

NOTA: Todos os estudos em animais cumpriram as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais e foram aprovados pelo Conselho de Ética em Pesquisa Animal da Universidade McMaster.

1. Colheita e dissociação do tumor

  1. Inocular camundongos C57BL/6 fêmeas de 6 a 8 semanas de idade por via intradérmica/subcutânea com 2 × 105 células de melanoma B16, conforme descrito por Nguyen et al.8 Permitir que os tumores cresçam por 7 dias antes da colheita.
  2. Eutanasiar o camundongo por luxação cervical, certificando-se de não interromper o tumor ao fazê-lo. Pulverize o camundongo com etanol a 70% antes da colheita.
  3. Usando um bisturi e uma tesoura, remova cirurgicamente o tumor intradérmico/subcutâneo do tecido circundante (incluindo os linfonodos de drenagem do tumor anexados) e coloque os tumores em um tubo de microcentrífuga pré-pesado. Mantenha no gelo.
    NOTA: Realize a colheita do tumor em um gabinete de biossegurança para uso animal. Use um tubo cônico de 15 mL para tumores maiores.
  4. Pese os tumores e adicione 500 μL de meio RPMI-1640 com 10% de soro fetal bovino (FBS) a cada tubo, usando uma tesoura para cortar os tumores em pequenos pedaços dentro do tubo ou em uma placa de 6 poços.
    NOTA: Os pedaços do tumor devem ser pequenos o suficiente para serem misturados por um pipetador elétrico uma vez que o meio de digestão tenha sido adicionado.
  5. Prepare a mistura de dissociação dissolvendo colagenase tipo IV a 0,5 mg / mL e DNase a 0,2 mg / mL em meio RPMI-1640 com 10% de FBS e 5 mM de cloreto de cálcio.
    NOTA: A mistura de dissociação deve ser preparada fresca para maximizar a atividade da colagenase.
  6. Transfira a suspensão do tumor picado para um tubo cônico de 15 mL e adicione 10 mL de mistura de dissociação por 0,25 mg de tumor. Coloque o tubo em um agitador orbital com temperatura controlada por 30 min a 37 °C com agitação de 200 rpm. Neutralize a atividade da colagenase adicionando dois volumes de meio RPMI-1640 frio com 10% de FBS e 2 mM de ácido etilenodiamina tetracético (EDTA) e leve à geladeira por 10 min a 4 ° C.
  7. Um breve vórtice e pipeta a suspensão em um filtro de 40 μm em um tubo cônico de 50 mL. Use um êmbolo de seringa e um meio neutralizante para desagregar o tecido tumoral residual e lave-o através do filtro. Centrifugue a suspensão por 5 min (500 × g, 4 ° C), descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 2% de FBS e 1 mM de EDTA.

2. Enriquecimento TIL e coloração por citometria de fluxo (FACS)

  1. Para enriquecer os TILs para caracterização de células mieloides, use um kit de separação de células magnéticas projetado para seleção positiva de biotina com anticorpos CD45.2 biotinilados de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Ressuspenda as células em 200 μL de tampão FACS (PBS com albumina de soro bovino (BSA) a 0,5% p/v) e transfira-as para uma placa de fundo em U de 96 poços.
    NOTA: Não exceda uma concentração de coloração de 1 × 108 células/mL. Ajuste o volume e divida as amostras em vários poços para compensar o alto número de células.
  3. Centrifugar a placa durante 5 min (500 × g, 4 °C) e rejeitar o sobrenadante. Adicione 50 μL de solução em bloco Fc (diluição 1:200 de CD16 / CD32 purificado de rato anti-camundongo [consulte a Tabela de Materiais) em tampão FACS, concentração final de 2,5 μg / mL) e ressuspenda as células por pipetagem. Incubar durante 10 min a 4 °C.
  4. Adicione 50 μL de tampão FACS contendo concentração 2x de anticorpo de coloração superficial (diluição 1:50 de CD45.2, NK1.1, CD11c, F4/80, CD8a, Ly6C, CD11b, CD4, Ly6G) e coloração de viabilidade fixável (FVS, diluição 1:500) e misture as células por pipetagem. Incubar durante 20 min a 4 °C.
    NOTA: Cubra a placa com papel alumínio para minimizar a exposição à luz. Os anticorpos devem ser titulados antes do experimento para determinar empiricamente a diluição ideal.
  5. Lave as células duas vezes adicionando 200 μL de tampão FACS a cada poço, centrifugando a suspensão (5 min, 500 × g, 4 ° C) e descartando o sobrenadante.
  6. Adicione 100 μL de solução de fixação/permeabilização (consulte a Tabela de Materiais) a cada poço, misture as células pipetagem e incube por 20 min a 4 °C.
  7. Adicione 100 μL de tampão de permeabilização 1x (consulte a Tabela de Materiais) a cada poço, centrifugue a placa por 5 min (500 × g, 4 ° C) e descarte o sobrenadante.
  8. Lave as células adicionando 200 μL de tampão de permeabilização 1x a cada poço, centrifugando a suspensão (5 min, 500 × g, 4 ° C) e descartando o sobrenadante.
    NOTA: O experimento pode ser pausado durante a noite após ressuspender as células no tampão de permeabilização. Armazenar a amostra a 4 °C e protegida da luz. Retomar após misturar brevemente as células antes de centrifugar.
  9. Adicione 100 μL de tampão de permeabilização contendo 1x concentração de anticorpo de coloração intracelular (diluição 1:100 de óxido nítrico sintase 2 (NOS2), arginase 1 (Arg1)) e misture as células por pipetagem. Incubar durante 20 min a 4 °C.
    NOTA: Cubra a placa com papel alumínio para minimizar a exposição à luz. Os anticorpos devem ser titulados antes do experimento para determinar empiricamente a diluição ideal.
  10. Adicione 100 μL de tampão de permeabilização 1x a cada poço, centrifugue a placa por 5 min (500 × g, 4 ° C) e descarte o sobrenadante.
  11. Lave as células adicionando 200 μL de tampão de permeabilização 1x a cada poço, centrifugando a suspensão (5 min, 500 × g, 4 ° C) e descartando o sobrenadante.
  12. Ressuspenda as células em 300 μL de tampão FACS. Filtre a amostra através de um tubo de poliestireno de fundo redondo de 5 mL com tampa de filtro de 40 μm antes de realizar a análise de citometria de fluxo.

3. Classificação de células mielóides tumorais para estudos funcionais

  1. Depois de identificar as populações de células mieloides desejadas por análise de citometria de fluxo, pré-enriqueça as células mieloides em massa para classificação com um kit de separação de células magnéticas projetado para seleção positiva para CD11b ou CD11c de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Usando anticorpos de coloração de superfície específicos para os subconjuntos de células mielóides desejados (diluição 1:100 de CD11b, Ly6C, Ly6G), core as células pré-enriquecidas conforme descrito nas etapas 2.2-2.5.
    NOTA: Inclua corante de viabilidade corrigível para garantir a classificação de células mieloides vivas. Não exceda uma concentração de coloração de 1 × 108 células / mL. Ajuste o volume e divida as amostras em vários poços para compensar o alto número de células.
  3. Ressuspenda as células em tampão de triagem a frio (PBS com 1% p / v BSA, ácido 4-(2-hidroxietil) -1-piperazineetanossulfônico 25 mM (HEPES) e EDTA 1 mM). Filtre a amostra através de um tubo de polipropileno de fundo redondo de 5 mL com uma tampa de filtro de 40 μm. Mantenha as células no gelo e cubra o tubo com papel alumínio.
    NOTA: Ajuste a concentração de células/volume para a especificação do instrumento desejada para classificação.
  4. Prepare um tubo de coleta de amostra com meio de captura (tubo de polipropileno de fundo redondo de 5 mL contendo PBS com 50% de FBS).
    NOTA: Revestir os tubos com 5 mL de meio de captura durante a noite antes da classificação. Descarte todos, exceto 1-2 mL do meio de captura no dia seguinte antes de executar a amostra.
  5. Modifique as configurações do instrumento classificador para diminuir a pressão da amostra e evitar perturbações na formação de gotículas. Equipe a ponta do bico de 130 μm e utilize a configuração de 10 psi. Execute a amostra em uma baixa taxa de fluxo com agitação periódica da amostra a 100 rpm, garantindo que a deposição de gotículas esteja no centro do tubo. Após a classificação, mantenha a amostra no gelo.
  6. Incubar a amostra durante 10 minutos a 4 °C. Centrifugue o tubo por 5 min (500 × g, 4 ° C), descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet no meio desejado para ensaios funcionais ou transferência adotiva.

4. Transferência adotiva de células mielóides tumorais purificadas

  1. Inocule camundongos C57BL / 6 fêmeas de 6-8 semanas de idade por via intradérmica com 1 ×10 6 células tumorais de melanoma B16 ressuspensas em 30 μL de PBS.
    NOTA: Inocule os camundongos com antecedência, de modo que o crescimento do tumor não exceda 100 mm3 no momento da transferência adotiva.
  2. Ressuspenda as células mielóides tumorais classificadas em PBS com 25 mM HEPES e 1 mM EDTA a uma concentração de 2 × 106 células / mL. Filtrar a amostra através de um tubo de poliestireno de fundo redondo de 5 ml com uma tampa de filtro de 40 μm. Mantenha no gelo.
  3. Induza e mantenha camundongos sob anestesia com isoflurano a 3%. Aplique pomada oftálmica para prevenir secura/lesão ocular.
  4. Coloque uma seringa de 31 G com 50 μL de suspensão celular. Desaloje as bolhas de ar sacudindo suavemente a seringa. Limpe o local da injeção com um toalhete embebido em álcool.
  5. Usando uma pinça estéril, levante a pele na base do tumor. Insira a agulha no espaço subcutâneo em um ligeiro ângulo para cima para entrar no tumor por baixo da pele. Use a pinça para apertar a pele ao redor da agulha e dispense lentamente o volume da seringa. Continue a beliscar a pele com a pinça enquanto remove a agulha lentamente e use um cotonete para limpar possíveis vazamentos.
    NOTA: Prossiga com quaisquer tratamentos terapêuticos adicionais, se desejar.
  6. Permita que os ratos se recuperem da anestesia.

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Resultados

Os resultados demonstram que este método produz um alto rendimento de células mieloides de tumores murinos sólidos. A preservação da integridade do receptor e da viabilidade celular facilita a análise funcional confiável dos subconjuntos mieloides desejados. Essas melhorias no isolamento de células mieloides permitiram o discernimento da mudança de função das células mieloides intratumorais após a normalização do TME com o inibidor de histona desacetilase classe I (HDACi), MS-275, durante a terapia adotiva com células T....

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Discussão

Embora as células mieloides infiltrantes de tumor existam em estados variados de ativação e diferenciação dentro do tumor, vários subconjuntos foram identificados, incluindo DCs associadas a tumores (TADCs), neutrófilos associados a tumores (TANs), células supressoras derivadas de mielóides (MDSCs) e macrófagos associados a tumores (TAMs) 12 . Infelizmente, a expressão sobreposta de marcadores de superfície celular usados para identificar esses subconjuntos de cél...

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Instituto de Pesquisa do Câncer de Ontário por meio de financiamento fornecido pelo Governo de Ontário, bem como pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (FRN 123516 e FRN 152954), pela Sociedade Canadense do Câncer (concessão 705143) e pelo Instituto de Pesquisa Terry Fox (TFRI-1073).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Alexa Fluor 700 Mouse Anti-Mouse CD45.2BD Biosciences5606931:100
APC-Cy7 Mouse Anti-Mouse NK-1.1BD Biosciences5606181:100
Biotina Mouse Anti-Mouse CD45.2BD Biosciences553771
BV421 Hamster Anti-Mouse CD11cBD Biosciences5627821:100
BV650 Rato Anti-Mouse F4/80BD Biosciences7432821:100
BV711 Rat Anti-Mouse CD8aBD Biosciences5630461:100
Colagenase, Tipo IV, póGibco17104019
DNase IRoche10104159001
EasySep Mouse CD11b Kit de Seleção Positiva IIStemcell technologies18970
EasySep Mouse CD11c Kit de Seleção Positiva IIStemcell technologies18780
Kit de Seleção Positiva de Biotina de Camundongo de Liberação EasySepStemcell technologies17655
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6CBD Biosciences5531041:100
Mancha de Viabilidade Fixável 510BD Biosciences5644061:1000
Kit de Solução de Fixação/Permeabilização (BD Cytofix/Cytoperm)BD Biosciences
PE Rato Anti-CD11bBD Biosciences5573971:100
PE-Cy7 Rato Anti-Rato CD4BD Biosciences5527751:100
PerCP-Cy5.5 Rato Anti-Rato Ly-6GBD Biosciences5606021:100
Perm/Lavagem (BD Perm/Lavagem)BD Biosciences554723
Rato Purificado Anti-Rato CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Biosciences553141
Anticorpo Monoclonal iNOS (CXNFT), APCThermo Fisher17-5920-821:100
Arginase Humana/Camundongo  1/ARG1 Anticorpo conjugado com fluoresceínaR& D SystemsIC5868F1:100
554714

Referências

  1. Paardekooper, L. M., Vos, W., vanden Bogaart, G. Oxygen in the tumor microenvironment: effects on dendritic cell function. Oncotarget. 10 (8), 883-896 (2019).
  2. Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Sarukhan, A. Instruction of myeloid cells by the tumor microenvironment: Open questions on the dynamics and plasticity of different tumor-associated myeloid cell populations. Oncoimmunology. 1 (7), 1135-1145 (2012).
  3. Jahchan, N. S., et al. Tuning the tumor myeloid microenvironment to fight cancer. Frontiers in Immunology. 10, 1611(2019).
  4. Srivastava, M. K., et al. Myeloid suppressor cell depletion augments antitumor activity in lung cancer. PLoS One. 7 (7), 40677(2012).
  5. Awad, R. M., De Vlaeminck, Y., Maebe, J., Goyvaerts, C., Breckpot, K. Turn back the TIMe: targeting tumor infiltrating myeloid cells to revert cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 1977(2018).
  6. Strauss, L., et al. Targeted deletion of PD-1 in myeloid cells induces antitumor immunity. Science Immunology. 5 (43), 1863(2020).
  7. Cassetta, L., et al. Deciphering myeloid-derived suppressor cells: isolation and markers in humans, mice and non-human primates. Cancer Immunology, Immunotherapy. 68 (4), 687-697 (2019).
  8. Nguyen, A., et al. HDACi delivery reprograms tumor-infiltrating myeloid cells to eliminate antigen-loss variants. Cell Reports. 24 (3), 642-654 (2018).
  9. Newton, J. M., Hanoteau, A., Sikora, A. G. Enrichment and characterization of the tumor immune and non-immune microenvironments in established subcutaneous murine tumors. Journal of Visual Experiments: JoVE. (136), e57685(2018).
  10. Engfeldt, P., Arner, P., Ostman, J. Nature of the inhibitory effect of collagenase on phosphodiesterase activity. Journal of Lipid Research. 26 (8), 977-981 (1985).
  11. Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. Journal of Visual Experiments: JoVE. (44), e2259(2010).
  12. Schupp, J., et al. Targeting myeloid cells in the tumor sustaining microenvironment. Cellular Immunology. 343, 103713(2019).
  13. Gabrilovich, D. I., Ostrand-Rosenberg, S., Bronte, V. Coordinated regulation of myeloid cells by tumours. Nature Reviews Immunology. 12 (4), 253-268 (2012).
  14. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
  15. Roussel, M., et al. Mass cytometry deep phenotyping of human mononuclear phagocytes and myeloid-derived suppressor cells from human blood and bone marrow. Journal of Leukocyte Biology. 102 (2), 437-447 (2017).

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