Mostramos a automação das culturas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSC) e diferenciações neuronais compatíveis com imagens e análises automatizadas.
Artigo de método
Produção automatizada de neurônios cortical e dopaminérgico derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos com monitoramento integrado de células vivas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A cultura manual e os protocolos de diferenciação para células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC) são difíceis de padronizar, mostram alta variabilidade e são propensos à diferenciação espontânea em tipos de células indesejadas. Os métodos são intensivos em mão-de-obra e não são facilmente favoráveis a experimentos em larga escala. Para superar essas limitações, desenvolvemos um sistema automatizado de cultura celular acoplado a um sistema de imagem de alto rendimento e implementamos protocolos para manter múltiplas linhas hiPSC em diferenciação paralela e neuronal. Descrevemos a automação de um protocolo de diferenciação de curto prazo usando a superexpressão neurogenin-2 (NGN2) para produzir neurônios corticais derivados do hiPSC dentro de 6\u20128 dias, e a implementação de um protocolo de diferenciação de longo prazo para gerar neurônios dopaminérgicos do cérebro médio derivados do cérebro (mDA) derivados de hiPSC dentro de 65 dias. Além disso, aplicamos a abordagem NGN2 a uma pequena célula precursora neural derivada de moléculas (smNPC) transduzidas com lentivírus GFP e estabelecemos um ensaio de crescimento de neurite automatizado de células vivas. Apresentamos um sistema automatizado com protocolos adequados para a cultura hiPSC de rotina e diferenciação em neurônios corticais e dopaminérgicos. Nossa plataforma é adequada para cultura viva-voz de longo prazo e alto teor/alta taxa de hiPSC com base em hiPSC, exibições RNAi e CRISPR/Cas9 para identificar novos mecanismos de doença e alvos de drogas.
Introdução
As células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSC) são auto-renovadas e podem se diferenciar em quase qualquer tipo de célula adulta. Essas características fazem do hiPSC uma ferramenta útil para modelagem de doenças em pesquisa básica e descoberta de medicamentos1. O iPSC humano mantém o fundo genético do doador que permite a deriva de tipos celulares relevantes para doenças que são mais afetados/envolvidos no curso da doença, por exemplo, diferentes subtipos neuronais para doenças neurodegenerativas2,3. Além disso, o hiPSC supera algumas das limitações dos modelos de superexpressão animal e celular, modelando doenças em um contexto humano e níveis de expressão fisiológica de proteína, e provou ser um ativo valioso na modelagem de doenças que vão desde distúrbios monogênicos, complexos e epigenéticos, bem como doenças de início tardio4.
Apesar desses benefícios e oportunidades, várias limitações do hiPSC ainda precisam ser abordadas. Os atuais protocolos de cultura e diferenciação hiPSC não são econômicos, difíceis de padronizar e são intensivos em mão-de-obra. As etapas manuais de cultura podem resultar em alta variabilidade nos rendimentos e fenótipos devido a diferenças de crescimento e diferenciação espontânea do hiPSC. Portanto, a variação dependente de experimentadores precisa ser reduzida através da implementação de técnicas de manuseio mais padronizadas e da simplificação de protocolos que podem ser alcançados usando a automação5. O estabelecimento de protocolos automatizados de cultura e diferenciação hiPSC estabelecerá padrões comuns para projetos de pesquisa acadêmica e industrial, além de permitir a geração de modelos de doenças biologicamente relevantes e resultados mais reprodutíveis.
Trabalhos anteriores tentaram automação das culturas hiPSC6,7,8, mas seus protocolos foram restritos a formatos específicos de placas de cultura celular dependentes do sistema e sem adaptabilidade a diferentes formatos de ensaio. Tais sistemas são úteis na maior parte das células, mas podem não ser adequados para diferenciação automatizada em tipos de células desejadas, fenotipagem de doenças e fins de triagem. Além disso, uma plataforma automatizada em larga escala para derivação de fibroblasto, geração de hiPSC e diferenciação foi descrita9, mas em uma escala que só pode ser alcançada por laboratórios de alto rendimento dedicados à produção de linhas que parecem atraentes, mas podem ser inacessíveis para muitos laboratórios acadêmicos.
Desenvolvemos um sistema de cultura celular totalmente automatizado baseado em uma estação de manuseio líquido em um ambiente filtrado de Particulado de Alta Eficiência (HEPA) em conjunto com uma incubadora co2 de grande capacidade, um citómetro de imagem de campo brilhante e um braço robótico para transporte de placas. Esses componentes fornecem a base para a cultura e diferenciação hiPSC estáveis e reprodutíveis. Complementamos o sistema com um sistema automatizado de armazenamento de -20 °C para armazenamento composto ou vírus e um imager de células ao vivo confocal de disco de alta velocidade. Protocolos personalizados foram gerados permitindo semeadura automatizada de células, alterações de mídia, verificações de confluência, expansão celular e geração de placas de ensaio com tratamento amostral e imagem de placa, tornando o sistema compatível com triagens de alto conteúdo/alto rendimento. O sistema automatizado de cultura celular e imagem é operado usando o software de controle e a interface gráfica de usuário (GUI) feita sob medida. A GUI permite que os usuários importem arquivos CSV contendo parâmetros específicos da linha celular necessários para a execução do método. Além disso, a GUI permite agendar inúmeros experimentos em qualquer sequência usando a visão de calendário incorporado, permitindo assim o controle total do tempo quando cada método é iniciado.
Nosso sistema automatizado de cultura celular utiliza velocidades padronizadas de pipetação, tempos de passagem, limiares de confluência, densidades de semeadura e volumes médios com a flexibilidade para cultivar células em uma variedade de formatos de placas (formato de placa de 96, 48, 24, 12, 6 ou 1-bem). Adaptamos um protocolo de diferenciação de curto prazo recentemente publicado para converter hiPSC em neurônios que podem produzir neurônios positivos TUBB3 em 6 dias10,11. Também estabelecemos a diferenciação automatizada e a imagem de células precursoras neurais de pequenas moléculas (smNPC) em neurônios que expressam constitutivamente o GFP sob o EF1a promoter12 e o iPSC em neurônios dopaminérgicos de cérebro médio (mDA), adaptando um protocolo de inibição dual-SMAD publicado anteriormenteque produz neurônios mDA dentro de 65 dias.
Protocolo
1. Procedimentos básicos para automatizar culturas celulares e imagens
- Carregar novas placas de cultura e dicas
- Abra a GUI e clique no botão de exibição do processo Recurso/Instrumento. Para executar qualquer processo de recurso/instrumento, selecione o processo recurso/instrumento e clique no botão processo Executar instrumento.
- Execute o processo de recurso RunHepaHood e Reloading (ver etapa 1.1.1). Abra a porta, carregue as placas de cultura celular e as pontas descartáveis na posição correspondente, conforme indicado na imagem pop-up no PC controlador.
- Limpe a porta com 70% de etanol para descontaminação e feche-a. Executar o processo de instrumentos Descontaminação a partir da GUI (ver etapa 1.1.1). O sistema é esterilizado por radiação UV por 30 minutos.
- Refil mídia de cultura e/ou reagente de dissociação
- Execute a etapa de instrumento RunHepahood (ver passo 1.1.1). Abra a porta da frente da estação de manuseio líquido. Descontaminar reservatórios (contendo media, PBS e/ou reagente dissociação) com 70% de etanol e colocá-los no convés para o positon atribuído (conforme definido no arquivo cfg.csv). Desindubra os reservatórios.
- Descontaminar a porta com 70% de etanol e fechá-la. Desça o capô hepa executando o processo de recurso/instrumento "InitHepaHood" da GUI.
- Crie uma nova "linha celular" e projeto na GUI
- Criar/modificar os arquivos "Linha celular" definidos pelo usuário, consistindo nos arquivos Config (*.cfg.csv), importação (*.imp.csv), recurso (*.rsv.csv) e os arquivos de fluxo de trabalho (*.wfl.csv).
- Abra a GUI e crie uma nova "linha celular" clicando no botão adicionar linha celular na exibição "Editor de linha celular". Um assistente abre onde o arquivo Config precisa ser selecionado e um nome de projeto com uma descrição curta precisa ser inserido.
- Navegue por este assistente usando a ponta do arqueiro verde e confirme as configurações clicando na marca de verificação verde. Crie um novo projeto para a "linha celular" gerada clicando no botão Adicionar projeto.
- Digite o nome e a descrição do projeto e defina uma cor do projeto que ficará visível na visualização do calendário da GUI. Navegue até a próxima página do assistente clicando na ponta de seta.
- Crie um novo lote clicando no botão Adicionar lote e dando um nome curto e descrição na janela pop-up. Selecione todas as etapas do processo e agende o horário de início para cada uma das etapas do processo. Feche a janela clicando em OK.
- Execute um método automatizado usando o GUI
- Vá para a exibição do calendário da GUI e clique no botão Adicionar etapa do processo.
- Selecione a linha Célula e depois de navegar para a próxima página do assistente escolha o projeto. Marque o lote a ser usado e clique na ponta da seta apontando para a direita. Dependendo do método utilizado, os lotes devem estar vazios (para receber novas placas), ou conter placas de cultura ou placas de ensaio (todos os outros processos).
- Navegue até a próxima página do assistente e selecione a etapa do processo que deve ser executada. Vá até a última página deste assistente e agende o experimento. Na seção "Detalhes do parâmetro" as variáveis necessárias para executar o método podem ser modificadas. Confirme clicando em OK.
- Carregamento de placas de cultura e ensaio na incubadora de CO2
NOTA: Placas de 1 poço são definidas como placas de cultura, uma vez que são comumente usadas para células a granel. Todas as placas multi-poços são definidas como placas de ensaio.- Execute o processo de instrumento "RunHepaHood" da GUI conforme descrito na etapa 1.1.1. e abrir a porta na frente do braço robótico.
- Limpe a parte inferior das placas de ensaio com 70% de etanol e um tecido livre de fiapos se as placas forem carregadas para imagens automatizadas. Coloque a cultura ou as placas de ensaio na prateleira esquerda. Certifique-se de que a orientação da placa está correta. Para placas de ensaio, bem A1 tem que apontar para o braço robótico, enquanto as bordas das placas de cultura têm que apontar para a direita.
- Limpe a porta com 70% de etanol para descontaminação e feche-a.
- Execute o método "Carregamento de placas de cultura" para importação de placas de 1 poço ou "Carregamento de placas de ensaio" para importação de placas multi-poços conforme descrito na etapa 1.4. Use um lote vazio para executar ambos os métodos. Se os códigos de barras da placa já estiverem presentes neste lote, desmarque-os clicando nas caixas de seleção.
- Transporte placas individuais da prateleira para a plataforma da incubadora de CO2 usando o braço robótico. A estação de transporte de placas embutida recupera a placa e armazena-as em um dos racks da incubadora de CO2. As células são mantidas a 37 °C e 5% de CO2.
- Descarga de placas da incubadora de CO2
- Execute o método "Descarregar placas" (ver passo 1.4). Selecione o lote contendo as placas que precisam ser exportadas. Placas individuais podem ser selecionadas por seus códigos de barras.
- Transporte as placas da incubadora de CO2 para a prateleira esquerda usando o braço robótico.
- Inicie o capô HEPA usando o processo de instrumento "RunHepaHood" conforme descrito na etapa 1.1.1. e abrir a porta na frente do braço robótico. Retire as placas, descontamine a porta com 70% de etanol antes de fechá-la e desça o capô do HEPA.
2. Protocolos de automação
- Semeadura de placas de tubos
- Inicie o capô HEPA executando o processo de instrumentos RunHepaHood (ver etapa 1.1.1). Abra a porta em frente à estação de manuseio líquido. Insira o tubo de 50 mL contendo a suspensão celular e descobrile o tubo.
- Abra a porta em frente ao braço robótico e carregue placas de cultura revestidas para receber células na prateleira. Descontaminar e fechar as duas portas. Execute o método "Semeadura de placas a partir de tubos" (ver passo 1.4).
- Conte células no citômetro de imagem de campo brilhante usando função de contagem direta de células. Para a contagem de células, use 16 poços como réplicas em um formato de placa de 384 poços.
- Transporte a placa de contagem de 384 poços do convés para o citômetro de imagem brightfield através do toca-discos usando o braço robótico e inicie o processo de imagem. O citómetro determina automaticamente o número do celular por mililitro. Leve a placa de contagem de volta à sua posição original usando o braço robótico.
- Transporte uma cultura revestida ou placa de ensaio da prateleira para o convés de pipetting usando o braço robótico. Remova células de revestimento e sementes no número definido pelo usuário e volume adequado para o formato da placa (ver Tabela 1). Mova a placa para o agitador no convés por 10 s a 500 rpm para distribuição celular e transfira para a incubadora de CO2.
- Avaliação automatizada de confluência
- Execute o método "Verificar a Confluência" conforme descrito na etapa 1.4. Selecione um lote que contenha pelo menos uma placa de cultura e nenhuma placa de ensaio. Na seção "Detalhes do parâmetro" entrada "iPSCf_2020" para configurações de aquisição de imagens e análise de imagens.
- Transporte a primeira placa da incubadora de CO2 para o citômetro de imagem brightfield através do toca-discos usando o braço robótico.
- Realize imagens de células no cítmetro de imagem de campo brilhante para verificação de confluência de colônias hiPSC. Use aplicação de "confluência" e imagem 13 campos do patê de 1 poço e calcule automaticamente a área média ocupada pelas células.
- Transporte a placa de volta para a incubadora de CO2 usando o braço robótico. Repita as etapas 2.2.2. para 2.2.4. para as placas restantes.
- Mudança de mídia de placas de cultura ou placas de ensaio
- Execute o método "Media Change Of Culture Plates" conforme descrito na etapa 1.4. e selecione um lote contendo apenas placas de cultura. Defina a variável indicando se as pontas ou agulhas são usadas para as etapas de pipetação na seção "Detalhes do parâmetro". Para a alteração de mídia de qualquer placa de vários poços, execute o método "Media Change Of Assay Plates" e selecione um lote contendo placas de ensaio.
- Transporte as placas individuais da incubadora de CO2 para o convés usando o braço robótico e descobriga as placas. Incline automaticamente as placas e aspire a mídia antiga e descarte-as no módulo de coleta de lixo. Adicione 12 mL de mídia fresca. Tampar a placa e transportar as placas de volta para a incubadora de CO2 usando o braço robótico.
- Subcultivação
NOTA: Execute o processo de instrumento "RunHepaHood" da GUI conforme descrito no 1.1.1. e abrir a porta da frente da estação de manuseio de líquidos. Carregar mídia e reagente de dissociação nas posições exigidas (ver etapa 1.2). Se as dicas precisarem ser recarregadas, use o "Recarregamento" conforme descrito na etapa 1.1. Insira um tubo de 50 mL para receber a suspensão celular e descobrile o tubo.- Execute o método "Subcultivação de Células Aderentes" (ver passo 1.4). Selecione o lote contendo placas de cultura que precisam de subcultivação.
- Transporte as placas da incubadora de CO2 para o convés usando o braço robótico e descobriga as placas. Incline automaticamente as placas e remova a mídia antiga e descarte-as no módulo de coleta de lixo. Lave as células uma vez com 8 mL de PBS. Adicione 8 mL de 0,5 mM EDTA para a passagem baseada em aglomerados. Incubar no convés por 8 minutos.
- Remova a solução EDTA das placas e descarte-a no módulo de coleta de resíduos. Adicione 12 mL de meio fresco e transporte as placas para o agitador. Agite a 2000 rpm por 1 minuto para desalojar as colônias.
- Triturar a suspensão celular por cinco ciclos de pipetação para quebrar as colônias iPSC em um tamanho menor (~50\u201280 μm). Transfira a suspensão da célula para um tubo de 50 mL no convés. Células de sementes automaticamente conforme descrito na etapa 2.1.5 usando uma razão dividida de 1 em 7.
NOTA: Opcionais, passagem de célula única. Gerar uma suspensão de célula única usando reagente de dissociação de célula única (ver Tabela de Materiais). Em vez de 0,5 mM EDTA na etapa 2.4.2., use 8 mL de reagente de dissociação de célula única e incubar por 20 min a 37 °C. Colete a suspensão da célula em um tubo de 50 mL e adicione o mesmo volume de mídia. A dissociação usando o reagente de dissociação de célula única requer um passo manual para pelotização das células. Células centrífugas a 300 x g por 3 min. Remova o supernasce e resuspense a pelota de célula em 12 mL da mídia necessária e prossiga com "Semeadura de placas de tubos" (ver passo 2.1). Suplemente a mídia com 2 μM thiazovivin no dia da semeadura ao usar suspensão celular única de hiPSCs.
- Imagens automatizadas de alto conteúdo e alto rendimento
NOTA: A configuração de medição deve estar disponível (ver Arquivo Suplementar 1: etapa 1.1). As placas de ensaio a serem imagens estão disponíveis na incubadora.- Execute o método "Imagem" (ver passo 1.4). Selecione um lote que contenha pelo menos uma placa de ensaio e nenhuma placa de cultura. Na seção "Detalhes do parâmetro", digite o tipo de placa, as definições da placa (para placas de imagem padrão de 96 poços: "Placa-96-20170918113842") e o nome da configuração de medição.
- Transporte a placa de ensaio através do toca-discos para o microscópio confocal automatizado usando o braço robótico para iniciar o processo de imagem. Recupere a placa no final da imagem do microscópio e transporte-a de volta para a incubadora de CO2. Repita o processo das placas restantes no lote.
3. Manutenção automatizada e expansão do hiPSC
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A sequência de verificações automatizadas de confluência, alterações de mídia e subcultivação
- Células de sementes em placas de 1 poço usando o método "Semeadura de placas de tubos" (ver passo 2.1). Alternativamente, importe manualmente placas de 1 poço semeadas manualmente usando o método "Carregamento da placa de cultura" (ver passo 1.5).
- Agende verificações automatizadas de confluência diariamente para monitorar o crescimento das colônias do dia 1 ao 6º dia da cultura para iPSC (ver etapa 2.2).
- Atualizar a mídia a cada dois dias usando o método "Mudança de mídia das placas de cultura" (ver passo 2.3). 12 mL de meio é usado por placa.
- No dia 6, inicie o processo de "Subcultivação" (ver etapa 2.4.).
4. Diferenciação automatizada
- IPSC humano para neurônios cortical NGN2
NOTA: Preparação manual do hiPSC. O protocolo envolve a superexpressão do NGN2 usando vetores lentiviral para entrega. Transduce hiPSC com NGN2 para rTTA3 lentivirus em uma proporção de 1:2 (> ~107 TU/mL). As células são então selecionadas para uma passagem com 0,5 μg/mL puramicina. Um protocolo detalhado para a geração de linhas estáveis hiPSC-NGN2 está no Arquivo Suplementar 1: passo 2.- Proceda com o processo de "Subcultivação", conforme descrito utilizando o reagente de dissociação de célula única descrito em nota da etapa 2.4.4. quando hiPSC atingir 70\u201280% confluência
- Remova o supernascimento e resuspenque a pelota celular em 12 mL de mídia NGN2(Tabela de Materiais) contendo doxycycline de 2,5 μg/mL (dox) e 2 μM thiazovivin.
- Comece a diferenciar usando o método "Semeadura de placas detubos" (ver passo 2.1). Defina a densidade de semeadura desejada do iPSC para 30.000/cm2 (ver tabela 1). O iPSC é banhado em placas pré-revestidas com 0,1 mg/mL de poli-L-ornithine (PLO) e 5 μg/mL laminina.
NOTA: Placas de 1 poço são preferidas para estudos baseados em RNA e proteômica, enquanto o formato de placa de 96 poços é preferido para experimentos de imagem. Outros formatos de placa de ensaio, como placas de 48, 24, 12 ou 6 poços, também podem ser usados. - No primeiro dia de diferenciação, Atualizar mídia usando a "Mudança de mídia das placas de ensaio (ver passo 2.3) usando o meio NGN2, complementado com 2,5 μg/mL dox e 10 μM N-[2S-(3,5-difluorofenil)acetil]-L-alanyl-2-fenil-glicina, 1,1-dimetil ester (DAPT). Continue com as mudanças de mídia a cada 2\u20123 dias até o dia desejado de diferenciação (ver passo 2.3).
- No dia 4 de diferenciação, realize outra mudança de mídia (ver passo 2.3.) utilizando o meio NGN2 suplementado com fator neurotrófico derivado do cérebro de 10 ng/mL (BDNF), 10 ng/mL gligático derivado de células (GDNF) e 10 fator neurotrópico ng/mLtrop 3 (NT-3) para melhorar o fator de maturação. No final do experimento, exporte as placas de cultura do sistema para experimentos a jusante (ver passo 1.6).
- Células precursoras neurais de pequenas moléculas (smNPC) para neurônios NGN2
NOTA: Derivar o SMNPC seguindo a versão adaptada do protocolopublicado 12 (ver Arquivo Suplementar 1: etapa 5). Modifique o smNPC com o vírus NGN2 e rTTA3 (ver Arquivo Suplementar 1: etapa 2). Uma rodada de transdução NGN2 e rTTA é suficiente para gerar uma população estável. Modifique ainda mais o smNPC com o lentivírus pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 permitindo realizar o monitoramento de células vivas. Uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 é utilizada para transdução lentiviral GFP.- Passagem smNPC sobre a confluência de alcance usando reagente de dissociação de célula única como descrito na etapa 2.4. Romance
- Células de sementes usando o sistema automatizado de cultura celular a uma densidade celular de 50.000/cm2 usando o método "Semeadura de placas de tubos" (ver passo 2.1.) em placas pré-revestidas com 0,1 mg/mL PLO, e 5 μg/mL laminin em NGN2 médio suplementado com 2,5 μg/mL dox.
- No dia 3, realize uma alteração de mídia (ver passo 1.3.) usando um meio NGN2 fresco contendo 2,5 μg/mL dox e 10 μM DAPT. Após o 3º dia, realize alterações de mídia a cada três dias com um novo meio NGN2 contendo 2,5 μg/mL dox, BDNF, GDNF e NT-3 a 10 ng/mL cada.
- Células de imagem diariamente usando o método "Imagem automatizada de alto conteúdo e alto rendimento" (ver passo 2.5) para monitorar o status de diferenciação usando GFP como leitura para crescimento de neurite. Ajuste a potência laser para 80% e use um tempo de exposição de 30 ms. Adquira um grande número de campos (por exemplo, 25 campos) usando 20x objetivo.
- Análise de imagens em lote
- Realize a análise de imagens com o software de análise de imagem 1, usando o modelo de crescimento de neurite.
- Abra o software. Selecione a opção "Dados" e navegue até a pasta de dados de imagem, clique em ok para carregar dados a serem analisados. Clique em abrir e na barra superior do menu, selecione o protocolo e no menu do aplicativo selecione o crescimento do neurite. Vá para "algoritmos" e use o canal "488" para definir o núcleo, corpo celular e neurite. Ajuste os parâmetros de limiar para cada um.
- Selecione os poços a serem usados para análise de imagens. No link de clique direito inferior e selecione recursos a serem analisados, como contagem de células média, total de comprimento do esqueleto. Prossiga com "pré-análise" seguida de "pré-visualização".
- Verifique se as configurações de visualização são aceitáveis e inicie a análise no modo de lote. Os resultados estão disponíveis na pasta pai em "relatórios" em .csv formato de arquivo que pode ser aberto no excel.
NOTA: O script de análise de imagem está disponível mediante solicitação. - Comprimento médio de neurite obtido pelo comprimento total de neurite normalizado para número de célula.
5. Diferenciação automatizada do hiPSC em neurônios dopaminérgicos de cérebro médio (mDA)
- Preparação manual do hiPSC
- Dissociar 70\u201280% confluente hiPSC em células únicas usando o reagente de dissociação de célula única. Brevemente, incubar células com reagente de dissociação de célula única (100 μL/cm2) por 30 min a 37 °C, coletar suspensão celular em um tubo cônico, centrífuga a 200 x g por 5 min e pelota de célula resuspendada no meio da cultura iPSC.
- Semente 200.000 células/cm2 em placas de 1 poço revestidas de matriz extracelular e meio de cultura iPSC complementado com 10 μM Y-27632. Células de cultura durante a noite a 37 °C e 5% DE CO2.
- Diferenciação automatizada: Fase 1
- Prepare o sistema de cultura automatizado conforme descrito na etapa 1.1\u20121.2.
- Carregar placas de cultura contendo células na incubadora de CO2 do sistema de cultura automatizada (ver passo 1.5).
- Prepare o meio KSR (ver Tabela de Materiais) e suplementa com pequenas moléculas (ver Tabela 2) necessárias para iniciar o dia 0 de diferenciação. Use apenas mídia recém-preparada com pequenas moléculas e fatores de crescimento.
- Realizar mudanças de mídia das placas de cultura como descrito na etapa 2.3 nos dias 0 e 1 de diferenciação e, em seguida, a cada segundo dia até o dia 25.
- A partir do dia 5, a formulação de mídia de mudança gradualmente, conforme descrito em detalhes na Tabela 3.
- No dia 11, adicione o meio de diferenciação de neurônio mDA complementado com CHIR (até o dia 13), BDNF, AA1, GDNF, db-cAMP, TGFß3 e DAPT (ver a Tabela de Materiais).
- No dia 25, descarregue as placas (ver passo 1.6.)
- Replação manual 1
- Dissociar precursores do dia 25 mDA em células únicas usando o reagente de dissociação de célula única. Brevemente, incubar células com reagente de dissociação celular única (100 μL/cm2) por 40 min a 37 °C, coletar suspensão celular em um tubo cônico, centrífuga a 200 x g por 5 min e pelota de célula resuspendada no meio de diferenciação de neurônio mDA.
- Semente 400.000 células/cm2 em placas de cultura de 1 poço pré-revestidas com 0,1 mg/mL OLP, 10 μg/mL laminina e 2 μg/mL fibronectina no meio de diferenciação de neurônio mDA suplementada com 10 μM Y-27632 (até o dia 26) e pequenas moléculas e fatores de crescimento descritos na Tabela 2. Células de cultura durante a noite a 37 °C e 5% DE CO2.
- Diferenciação automatizada: Fase 2
- Carregar placas de cultura contendo neurônios mDA na incubadora de CO2 do sistema de cultura automatizada, conforme descrito na etapa 1.5
- Prepare o meio de diferenciação de neurônios mDA (ver Tabela de Materiais) e suplemente com pequenas moléculas e fatores de crescimento necessários para a diferenciação final a partir do dia 26 (ver Tabela 2).
- Realizar mudanças de mídia de placas de cultura como descrito na etapa 2.3 no dia 26 de diferenciação e, em seguida, a cada 3\u20124 dias até o dia 65.
NOTA: Para fins de imagem de alto rendimento, recomenda-se retotar os neurônios mDA em placas de 96 poços em baixa densidade no dia 32 de diferenciação, conforme descrito na etapa 5.5.
- Replação manual 2
- Descarregue placas de cultura conforme descrito na etapa 1.6. Dissociar os neurônios 32 mDA em células únicas, conforme descrito na etapa 5.3.1.
- Semente 100.000 células/cm2 em placas de 96 poços pré-revestidas com 0,1 mg/mL OLP, 10 μg/mL laminina e 2 μg/mL fibronectina no meio de diferenciação de neurônio mDA suplementada com 10 μM Y-27632 (até o dia 33) e pequenas moléculas e fatores de crescimento (ver Tabela 2). Células de cultura durante a noite a 37 °C e 5% DE CO2.
- No dia 33, substitua o meio por meio de diferenciação de neurônios da recém-preparado suplementado com pequenas moléculas e fatores de crescimento (sem Y-27632). Troque o meio manualmente a cada 3\u20124 dias até o dia 65.
6. Imunostaining, aquisição e análise automatizada de imagens de alto rendimento
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Coloração de fluorescência
- Realizar imunostaining fluorescente conforme descrito no Arquivo Suplementar 1: passo 4.
- Células de imagem descritas no Arquivo Suplementar 1: passo 1.2.
- Upload de arquivos de imagem gerados pelo sistema de imagem para o software de análise de imagem 2 (ver Tabela de Materiais) para análise posterior de imagem, conforme descrito na etapa 6.2.
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Análise de imagem usando o software de análise de imagem 2
- Uma vez que os arquivos de imagem são carregados no software de análise de imagem 2, vá para a função "análise de imagem" e construa o algoritmo de análise usando o menu suspenso.
- Selecione núcleos usando a tarefa "encontrar núcleos", que detecta regiões na imagem pertencentes a núcleos celulares (aqui manchados com Hoechst). Exclua núcleos de células mortas (núcleos pitnóticos) estabelecendo um limiar para área nuclear ou diâmetro.
- Selecione o citoplasma celular usando a tarefa "encontrar citoplasma". Esta tarefa detecta regiões ao redor de núcleos pertencentes ao citoplasma celular. Inclua apenas células bem segmentadas. Exclua células mitóticas, apoptóticas e mal segmentadas. Remova as células que tocam na borda da imagem.
- Adicione as tarefas "calcular propriedades de morfologia" e "calcular propriedades de intensidade". Os parâmetros de morfologia incluem o cálculo de propriedades de morfologia, como área para uma região de interesse. Os parâmetros de intensidade incluem o cálculo de propriedades de intensidade, como intensidade média para uma região de interesse (por exemplo, citoplasma de neurônios).
- Selecione uma subpopulação (por exemplo, neurônios th positivos) da população de entrada (todos os citoplasmas selecionados) usando uma ou mais condições, morfologia e/ou intensidade.
NOTA: Normalmente, a intensidade é escolhida para os neurônios. Com base em controles negativos, é possível definir acima qual limiar de intensidade os neurônios são considerados positivos para TH. - Defina os resultados de saída. Este é o último bloco de construção de cada análise. Ele define os valores de leitura do ensaio para cada poço de uma placa de cultura (resultados por bem).
- Execute a análise do lote e exporte os resultados. Normalizar o número de células positivas para o número total de núcleos e representar dados como a porcentagem de células positivas.
7. Reação quantitativa da cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR)
- Execute o protocolo qRT-PCR conforme descrito no Arquivo Suplementar 1: etapa 3.
Resultados
Nosso sistema automatizado de cultura celular e imagem foi projetado para minimizar a intervenção humana, permitindo-nos padronizar o cultivo de hiPSC e diferenciação em diferentes tipos de células, como neurônios dopaminérgicos cortical ou midbrain (mDA). Uma visão geral esquemática do nosso sistema automatizado de cultura celular com dispositivos de imagem integrados é retratada na Figura 1. A introdução inicial de culturas celulares a este sistema automatizado de cultura celular pode ser feita através da semeadura automática de células a partir de um tubo de 50 mL ou usando o método "Carregamento de Placas de Cultura" ou "Carregamento de Placas de Ensaio" para importação de placas de cultura ou ensaio. Um componente central do nosso sistema é a estação de manuseio de líquidos onde todas as etapas de transferência líquida, como alterações de mídia ou subcultivações são realizadas. O layout do deck personalizado do manipulador líquido está representado na Figura 2. A estação de manuseio líquido é equipada com quatro posições. Até quatro placas podem ser transferidas da incubadora para o deck, permitindo alterações de mídia paralelas. Uma vez que no método de subcultivação, tanto as placas de cultura pai quanto filha devem ser acomodadas no convés, o número máximo de placas de cultura processadas em paralelo é limitado a dois. Uma característica importante da estação de manuseio de líquidos é a possibilidade de inclinar as placas durante a mudança de mídia para a remoção completa da cultura celular supernascida. Além disso, a estação de manuseio líquido é equipada com shakers para favorecer a dissociação enzimática das células durante a execução do protocolo de subcultivação. Nosso sistema de cultura automatizado também é equipado com dois sistemas de imagem: um citômetro de imagem de campo brilhante para a realização de verificações de contagem de células e confluência e, portanto, monitorar o crescimento celular ao longo do tempo, e um microscópio confocal de disco giratório duplo para imagens rápidas, de alto conteúdo e de alta resolução das células.
As culturas hiPSC são monitoradas diariamente para crescimento no citômetro de imagem de campo brilhante e analisadas para porcentagem de confluência. A imagem de campo brilhante no painel esquerdo e no painel direito uma máscara verde a partir da análise da imagem de campo brilhante obtida com o citômetro(Figura 3A). Observa-se um crescimento hiPSC homogêneo ao longo do tempo, como mostrado pelos percentuais de confluência de duas linhas hiPSC (n = 4 placas) cultivadas em paralelo e sujeitas a verificações de confluência do dia 1 ao dia 6(Figura 3B). Ao atingir o limite definido, o hiPSC é aprovado. As linhas celulares foram cultivadas manualmente (m) ou pelo sistema de automação (a) e observadas para manutenção da morfologia típica de células-tronco por pelo menos duas passagens, imagens representativas de brightfield(Figura 4A). O hiPSC cultivado manualmente (não mostrado) ou no sistema automatizado exibiu o típico marcador de células-tronco OCT4 (vermelho) e SSEA4 (verde), como mostrado no ensaio de imunofluorescência(Figura 4B). A expressão dos marcadores de pluripotência OCT4, NANOG e REX1 também foram avaliadas no nível mRNA por qRT-PCR(Figura 4C). As quantificações relativas foram realizadas com amostras coletadas de uma linha celular cultivada manualmente (m) e no sistema de cultura automatizada (a) em duplicatas (réplicas 1 e 2). Os níveis de expressão dos três marcadores de pluripotência nas réplicas cultivadas no sistema de cultura automatizada são semelhantes à expressão de marcador após a cultura manual. No dia 8 (D8), a expressão de marcadores pluripotências estava ausente em neurônios corticais diferenciados (Diff) do hiPSC.
Uma aplicação importante do sistema de cultura automatizada é a diferenciação do hiPSC em diferentes tipos de células, incluindo neurônios. Aqui mostramos a diferenciação do hiPSC em neurônios usando a estratégia NGN2, que produz uma cultura pura de neurônio cortical em um tempo muito curto (aproximadamente 6 dias). Os neurônios diferenciados no sistema de cultura automatizada (a) apresentaram morfologia semelhante e organização da rede neuronal como os neurônios cultivados manualmente (m) (Figura 5A). Os neurônios cortical diferenciados automatizados foram positivos para TUBB3 (classe III específica do neurônio β-tubulina, vermelho) e BRN2 (marcador de camada cortical superior, verde) (Figura 5B),comparável aos neurônios manualmente diferenciados (dados não mostrados). A expressão de marcadores neuronais, incluindo a proteína associada ao microtubule 2 (MAP2),a molécula de adesão celular neural(NCAM1) e Synapsin-1(SYN1),bem como os marcadores de neurônio cortical BRN2 e CUX1 (camada cortical superior) foram enriquecidos em neurônios no dia 8 (D8) de diferenciação(Figura 5C). Muito baixo ou nenhuma expressão desses marcadores foi observada em hiPSC. As quantificações relativas foram realizadas com amostras coletadas de uma linha celular cultivada manualmente (m) e no sistema de cultura automatizada (a) em duplicatas (réplicas 1 e 2). Os níveis de expressão em réplicas mostram variações semelhantes entre diferenciações manuais e automatizadas.
A capacidade integrada de imagem do sistema de cultura automatizada permite a coleta de dados mãos-livres para a saúde das culturas, permitindo assim a aquisição automatizada de leituras fenotípicas a longo prazo. Usando a abordagem NGN2 para uma linha de precursor neural derivado de uma pequena molécula (smNPC) transduzida com lentivírus GFP, estabelecemos um ensaio de crescimento de neurite automatizado de células vivas no qual o comprimento de neurita foi medido ao longo de 11 dias de diferenciação sem qualquer intervenção manual. A complexidade da neurita aumentou ao longo do tempo, como demonstrado pela área ocupada com neurites nos dias 1, 3 e 11, expressão GFP e imagens mascaradas da análise(Figura 6A, B). O aumento do comprimento do neurite do dia 1 para o 11 de diferenciação foi quantificado e mostrou um desenvolvimento semelhante em diferentes poços. Por uma questão de simplicidade, dados de apenas 3 colunas com 6 poços cada uma de uma placa de 96 poços são retratados no gráfico representativo, embora todos os 60 poços internos tenham sido analisados(Figura 6C).
Outra aplicação do sistema de cultura automatizado mostrado aqui é a diferenciação do hiPSC em neurônios mDA. A diferenciação é baseada em mudanças de mídia após um protocolo pré-estabelecido e foi realizada no sistema de cultura automatizada dos dias 0 a 65. Alterações automatizadas de mídia não causaram desprendimento celular ou qualquer outra alteração visualmente detectável na diferenciação. Ao final da diferenciação, no dia 65, os neurônios mDA mostram organização celular e morfologia (soma esférica, dendritos longos e espinhosos) comparáveis à diferenciação manual(Figura 7A, B). No nível mRNA, os neurônios mDA diferenciados no sistema de cultura automatizada mostram a expressão de marcadores neuronais e mDA, MAP2 e TH (hidroxilase de tyrosina), respectivamente(Figura 7C). Ambas as diferenciações geraram quantidades substanciais de neurônios positivos TH e MAP2(Figura 7D).
Figura 1: Visão geral esquemática da cultura celular automatizada e plataforma de imagem.
O sistema foi projetado com uma carcaça de policarbonato e dois capuzes HEPA (A e B) equipados com quatro lâmpadas UV garantindo um ambiente estéril para aplicações de cultura celular. Placas de cultura celular são carregadas em prateleiras em frente ao braço robótico que pode ser acessado pela porta da frente (C). As placas são carregadas na incubadora de CO2 (D) com capacidade para 456 placas. Um citómetro celular de campo brilhante (E) é usado para verificação de confluência e contagem de células durante rotinas de subcultivação. A estação de manuseio de líquidos fica abaixo de um dos capuzes HEPA (B). O layout do deck do manipulador líquido está descrito na Figura 2. O braço de tubulação da estação de manuseio líquido carrega uma cabeça de tubulação de 96 canais, oito canais de tubulação de 1 mL e quatro canais de tubulação de 5 mL. No caso dos canais de tubulação de 1 mL, pontas ou agulhas podem ser usadas para transferências líquidas. Para fins de triagem, as células semeadas em placas de ensaio podem ser tratadas com amostras armazenadas a -20 °C no sistema de armazenamento automatizado -20 °C (F) após descongelar essas amostras em uma segunda incubadora (G). A imagem de alto rendimento é realizada no microscópio confocal automatizado (H) oferecendo a aquisição de imagens no modo confocal usando dois discos giratórios ou no modo de epifluorescência. Uma câmara de células vivas integrada ao microscópio permite realizar imagens de longo prazo de células cultivadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O layout do convés da estação de manuseio líquido.
As posições de ponta são indicadas por "50 μL" para 50 dicas de μL, por "padrão" para 300 μL dicas, por "alto" para 1 mL dicas e por "5 mL" para dicas de 5 mL. Componentes do convés: (A) Quatro posições de agitador aquecido (velocidade máxima: 2500 rpm) que podem ser usadas para qualquer placa de cultura ou formato de placa de ensaio. As posições do agitador são equipadas com pinças que também são usadas para alinhamento de placas após os transportes para o convés. Além disso, as posições do agitador funcionam como uma posição de estacionamento para placas durante as etapas de transferência de líquido. Para fins representativos, todas as posições de shaker são ocupadas por 96 placas de ensaio. (B) Quatro módulos de inclinação para processamento de quatro placas de qualquer formato simultaneamente estão posicionados na parte superior. A posição mais baixa marca a câmara de coleta de lixo para placas de cultura e ensaio e a cabeça de tubulação de 96 canais. Para fins representativos, todos os módulos de inclinação são ocupados por placas de ensaio de 96 poços. (C) Na posição superior, está localizada a placa de 384 poços para contagem de células. Abaixo estão duas posições para placas que são ocupadas por placas de 96 poços para fins representativos e um rack para quatro tubos de 50 mL e quatro tubos de 15 mL. A posição mais baixa é ocupada por pontas de 5 mL. (D) Três linhas de mídia com posições para reservatórios de mídia. As linhas de mídia possuem sensores de nível líquido que permitem encher automaticamente o reservatório de mídia com até 250 mL de mídia. (E) Dois módulos de resíduos líquidos com drenagem ativa são baseados na parte superior, abaixo de um módulo controlado pela temperatura com uma posição para um recipiente (branco) e um rack de ponta de 5 mL. (F) Cinco vagas para 1 mL de dicas. (G) Dois módulos controlados pela temperatura estão posicionados na parte inferior e uma posição para estacionar uma de suas tampas na parte superior. (H) Posições para dois racks de ponta aninhados de 50 μL (NTR) na parte superior seguido de duas posições para pick-up de canal único e 96 canais de 300 μL e um rack de ponta de 5 mL na parte inferior. (I) Um empilhador para placas de contagem de 384 poços na parte superior, seguido por três 300 μL NTR e um rack de ponta de 5 mL na parte inferior. (J) Estação de armazenamento e lavagem para três conjuntos de oito agulhas de metal reutilizável de 1 mL. (K) Posição de resíduo para canais de tubulação de 1 mL e 5 mL e NTR vazio (cinza), bem como um bloco de pinça para canais de 1 e 5 mL (branco) usados para etapas de transporte no convés. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Verificação automatizada de confluência de hiPSC.
(A) Imagens representativas de brightfield (BF) de hiPSC tiradas pelo citômetro celular (esquerda) e após análise automatizada de confluência (direita) indicando a área proporcional ocupada por células em verde; (B) Percentuais de confluência registrados a partir de duas linhas hiPSC (iPS #1 e #2) do dia 1 ao 6 da cultura, n = 4 placas de 1 poço por linha celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Passagem de hiPSC.
(A) Imagem BF de uma linha hiPSC cultivada manualmente (esquerda) e usando o sistema de cultura automatizado (à direita). As imagens foram tiradas 6 dias após a segunda passagem; (B) Imagens representativas do hiPSC manchadas para os marcadores de pluripotência OCT4 e SSEA4, e contra-manchadas com Hoechst 33342 (Núcleos); (C) Resultados de qRT-PCR para os marcadores de pluripotência OCT4, NANOG e REX1 em uma linha hiPSC cultivada em duplicatas (1 e 2) manualmente (m) e no sistema de cultura automatizada (a), e os respectivos neurônios corticais derivados de hiPSC (Diff) no dia 8 (D8) de diferenciação. Os dados são representados como a quantidade relativa (RQ) utilizando iPS_a_1 como amostra de referência. As barras de erro representam o desvio padrão (SD) a partir de 3 réplicas técnicas da reação qRT-PCR. GAPDH, RPL13A1 e RPLPO foram utilizados como genes de limpeza. Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Neurônios cortical derivados do iPSC humanos.
(A) Imagens brightfield do dia 6, manualmente (m) e neurônios corticais diferenciados que mostram redes neuronais semelhantes; (B) Imagens representativas de células manchadas para TUBB3 (pan neuronal), BRN2 (neurônios corticais) e Hoechst 33342 (núcleos) no 8º dia de diferenciação; (C) Os resultados do qRT-PCR para genes marcadores de neurônios corticais (MAP2, BRN2, CUX2, NCAM1 e SYN1) enriqueceram no dia 8 (D8) de diferenciação. Os dados são representados como a quantidade relativa (RQ) utilizando iPS_a_1 como amostra de referência. As barras de erro representam o SD a partir de 3 réplicas técnicas da reação qRT-PCR. GAPDH, RPL13A1 e RPLPO foram utilizados como genes de limpeza. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Um ensaio de alto rendimento para o crescimento de neurite.
(A) Imagens representativas de células expressas GFP nos dias 1, 3 e 11 de diferenciação; (B) Imagens binárias representativas de neurites nos dias 1, 3 e 11 de diferenciação. O crescimento do neurite foi quantificado utilizando o software de análise de imagem de alto conteúdo 1 e é representado como comprimento de neurite; (B) O gráfico exibe o aumento do comprimento de neurite nos neurônios NGN2 derivados do NPC e a formação de uma rede densa. Três placas de 96 poços com células no interior de 60 poços são imagens. Para simplificar, apenas três colunas de poços por placa de 96 poços são mostradas como exemplo com n = 6 poços por coluna. Uma média de 1308 células foram analisadas por poço. As barras de erro representam o erro padrão da média (S.E.M.). Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Neurônios mDA derivados do iPSC humano.
Os neurônios da DA midbrain diferenciados manualmente (m) e no sistema de cultura automatizado (a). (A, B) Imagens fluorescentes representativas de neurônios mDA manchados para hidroxilase de tyrosina (TH, marcador de neurônio mDA; verde), MAP2 (marcador neuronal; vermelho) e Hoechst 33342 (núcleos; azul); (C) Resultados representativos qRT-PCR para genes marcadores de neurônios mDA diferenciados manualmente e no sistema de cultura automatizado. Os níveis de expressão TH e MAP2 são representados como quantidade relativa (RQ) normalizada para genes de limpeza(OAZ1 e GAPDH); (D) Percentuais de neurônios positivos TH e MAP2 gerados pela diferenciação manual e automatizada. As barras de erro representam o SD de duas diferenciações independentes realizadas com duas linhas iPSC distintas (#1 e #2). Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tipo de célula | Propósito | Passo do protocolo | Densidade celular | Formato da placa | Número de celular/bem |
| Diferenciação NGN2 | |||||
| Ipsc | Geração de linha estável NGN2 | S.2.3. | 30.000 células/cm2 | 12-well | 1,17,000 |
| Ipsc | Diferenciação de neurônios NGN2 | 3.1.3. | 30.000 células/cm2 | 1-bem | 25,20,000 |
| Ipsc | Diferenciação de neurônios NGN2 | 3.1.3. | 30.000 células/cm2 | 96-well | 9,600 |
| geração smNPC | |||||
| smNPC | Replando dias 12 e 16 | S5.9. e S5.11. | 70.000 células/cm2 | 6-bem | 6,72,000 |
| smNPC | Replando da passagem 5 | 5.11. | 50.000 células/cm2 | 6-bem | 4,80,000 |
| smNPC | smNPC para neurônios NGN2 | 3.2.2 | 50.000 células/cm2 | 96-well | 16,000 |
| diferenciação mDA | |||||
| Ipsc | diferenciação de neurônios mDA | 4.1.2. | 200.000 células/cm2 | 1-bem | 1,68,00,000 |
| Neurônios da DA | Dia 25 | 4.3.2. | 400.000 células/cm2 | 1-bem | 3,36,00,000 |
| Neurônios da DA | Dia 25 | 4.5.2. | 100.000 células/cm2 | 96-well | 32,000 |
| Revestimento | Propósito | Passo do protocolo | Concentração/ Diluição | Formato da placa | Detalhes do revestimento |
| cultura iPS | |||||
| Matriz extracelular | iPSC, linha NGN2, neurônios mDA | 1.5.7. e S2.3. | 1 aliquot*; 25 mL DMEM/F-12 | 1-/12-bem | 8/0,5 mL/bem; 1 h no RT |
| Diferenciação NGN2 | |||||
| Poli-L-Ornithine | Diferenciação de neurônios NGN2 | 3.1.3. e 3.2.2. | 0,1 mg/mL; Pbs | 1-/96-bem | 8/0,1 mL/bem; 12 h a 37°C; Lavagem 3x PBS |
| Laminina | Diferenciação de neurônios NGN2 | 3.1.3. e 3.2.2. | 5 μg/mL; Pbs | 1-/96-bem | 8/0,1 mL/bem; 4h a 37°C |
| geração smNPC | |||||
| Matriz extracelular | geração e cultura smNPC | S5.6., S5.9., S5.11. | 1 aliquot*; 25 mL DMEM/F-12 | 6-bem | 1 mL; 2 h no RT |
| diferenciação mDA | |||||
| Matriz extracelular | diferenciação mDA | 4.1.2. | 1 aliquot*; 25 mL DMEM/F-12 | 1-bem | 12 mL; 12 h a 37°C |
| Poli-L-Ornithine | diferenciação mDA | 4.3.2. e 4.5.2. | 0,1 mg/mL; Pbs | 1-/96-bem | 12/0,1 mL/bem; 12 h a 37°C; Lavagem 3x PBS |
| Laminina | diferenciação mDA | 4.3.2. e 4.5.2. | 10 μg/mL; Pbs | 1-/96-bem | 12/0,1 mL/bem; 12 h a 37°C |
| Fibronectina | diferenciação mDA | 4.3.2. e 4.5.2. | 2 μg/mL; Pbs | 1-/96-bem | 12/0,1 mL/bem; 12 h a 37°C |
| *Uma alíquota de matriz extracelular é definida como o fator de diluição (em μL) presente no Certificado de Análise deste produto. | |||||
Tabela 1: Densidade celular de semeadura e revestimento respectivamente ao formato da placa.
| Dia | Reagente | ||
| Dia 0 - 1 | 100 nM LDN193189, 10 μM SB431542 | ||
| Dia 1 - 3 | 100 nM LDN193189, 10 μM SB431542, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamine, 100ng/mL FGF-8b | ||
| Dia 3 - 5 | 100 nM LDN193189, 10 μM SB431542, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamine, 100ng/mL FGF-8b, 3 μM CHIR99021 | ||
| Dia 5 - 7 | 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamine, 100ng/mLFGF-8b, 3 μM CHIR99021 | ||
| Dia 7 - 9 | 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 3 μM CHIR99021 | ||
| Dia 9 - 11 | 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 3 μM CHIR99021 | ||
| Dia 11 - 13 | 3 μM CHIR99021, 20 ng/mL BDNF, 0,2 mM L-ascórbico (AA1), 20 ng/mL GDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 μM DAPT | ||
| Dia 13 - 65 | 20 ng/mL BDNF, ácido L-ascórbico de 0,2 mM (AA1), 20 ng/mL GDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 μM DAPT | ||
Tabela 2: Adição de moléculas pequenas para diferenciação de neurônios dopaminérgicos.
| Dia | Meio KSR | Meio N2 | Meio de diferenciação |
| Dia 0 - 1 | 100% | 0 | 0 |
| Dia 1 - 3 | 100% | 0 | 0 |
| Dia 3 - 5 | 100% | 0 | 0 |
| Dia 5 - 7 | 75% | 25% | 0 |
| Dia 7 - 9 | 50% | 50% | 0 |
| Dia 9 - 11 | 25% | 75% | 0 |
| Dia 11 - 13 | 0 | 0 | 100% |
| Dia 13 - 65 | 0 | 0 | 100% |
Tabela 3: Gradiente de mídia para diferenciação de neurônios dopaminérgicos.
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Discussão
Introduzimos um sistema automatizado de cultura celular com recursos integrados de imagem para a padronização da cultura hiPSC e diferenciação neuronal. Devido à mínima intervenção do usuário, a variação experimental é baixa garantindo a reprodutibilidade dos fenótipos celulares durante a diferenciação. O agendador baseado em calendário apoia a organização e a paraleloização dos experimentos e permite um alto grau de flexibilidade no momento em que os experimentos são realizados. Os métodos existentes podem ser facilmente adaptados e o espectro dos métodos disponíveis pode ser aumentado. Além disso, um grande número de formatos de placas de ensaio pode ser usado adicionando à flexibilidade deste sistema. O sistema mínimo composto por uma incubadora de CO2, um braço robótico, um citômetro celular de campo brilhante e uma estação de manuseio líquido forma a unidade básica necessária para a cultura e diferenciação hiPSC, com custos acessíveis para laboratórios de pesquisa acadêmica. A combinação do sistema automatizado de cultura celular com um sistema automatizado de armazenamento de -20 °C para armazenamento de compostos, bibliotecas RNAi ou bibliotecas CRISPR/Cas9, e a integração de um microscópio de alto teor/alto rendimento permitem a execução de triagens fenotípicas.
No presente estudo, o sistema automatizado de cultura celular utilizou pontas descartáveis e a mídia cultural foi reabastecida manualmente no reservatório, limitando assim o uso da estação de manuseio líquido para mudanças de mídia e outros processos culturais especialmente da noite para o dia. Para contornar essa limitação, os métodos podem ser ajustados ao uso de agulhas em vez de pontas descartáveis e, após a instalação de conexões de tubo entre linhas de mídia e sacos de mídia armazenados em uma geladeira, os reservatórios de mídia podem ser automaticamente recarregados com mídia fresca pré-aquecida por elementos aquecedores. Isso reduziria as interferências dos usuários causadas pelo reabastetamento manual de dicas, mídia de cultura e trocas de reservatórios.
Nosso sistema automatizado de cultura celular oferece várias vantagens. Um deles é o sistema de rastreamento de código de barras. As placas carregadas no sistema são identificadas por um código de barras único que é lido e salvo pelo sistema que permite o rastreamento de amostras durante e após a execução do método. Outra vantagem é a possibilidade de criar projetos específicos para usuários. Aqui, placas de cultura carregadas no sistema podem ser atribuídas a um projeto específico e agrupadas em lotes. A estruturação em lotes simplifica a execução do mesmo procedimento em todas as placas de um determinado lote, uma vez que nenhuma placa individual precisa ser selecionada. Além disso, um editor de classe líquida permite ajustar a velocidade e altura da tubulação, bem como a aspiração e os parâmetros de distribuição para cada etapa de transferência líquida. Cada processo é documentado em arquivos de log permitindo refazer quais tarefas foram executadas para uma determinada cultura ou placa de ensaio.
Neurônios e outros tipos de células derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSC) são ferramentas in vitro úteis para estudar os mecanismos de doenças neurodegenerativas em populações específicas de pacientes (por exemplo, neurônios dopaminérgicos para doença de Parkinson) oferecendo a possibilidade de exames medicamentosos personalizados. A culturing hiPSC é muito intensiva e exige pessoas treinadas para executar protocolos complexos de diferenciação, geralmente limitados à produção em baixa escala. Adaptamos a cultura livre de alimentadores do hiPSC a uma cultura automatizada e implementamos dois protocolos de diferenciação neuronal, um protocolo rápido de diferenciação de neurônios corticais baseado na superexpressão NGN2 sob um promotor tet-on10,11, e um protocolo de longo prazo baseado em pequenas moléculas para geração de neurônios dopaminérgicos de cérebro médio (mDA)13. A transferência direta e a reprodutibilidade dos protocolos manuais de cultura e diferenciação torna o sistema de cultura automatizado muito útil. O iPSC humano cultivado no sistema de cultura celular automatizada mostrou morfologia consistente de células-tronco e expressou importantes marcadores de pluripotência, reprodutíveis entre experimentos independentes. Além disso, a automação do protocolo de cultura hiPSC favoreceu a cultura e a expansão de um número maior de linhas celulares em paralelo. Verificações automatizadas de confluência programadas para serem realizadas durante a noite economizam tempo deixando o sistema livre durante o dia para etapas de processo a jusante realizadas quando o usuário estava em laboratório (por exemplo, colheita de células ou replação manual para diferenciações). Ao atingir o limiar de confluência definido pelo usuário, as células são passaged e replated em placas extracelulares revestidas de matriz disponíveis no empilhador do sistema automatizado de cultura celular. Cada rodada de passagem leva cerca de 70 minutos e gera quatro placas de 1 poço a partir de uma placa-mãe, o que se traduz em uma capacidade de 20 passagens em um dia.
A automação do protocolo de diferenciação NGN2 foi feita com sucesso e permitiu a geração de uma população homogênea de células neuronais em diferentes passagens e comparável a diferenciações manuais. Além disso, os custos experimentais para estudos de triagem em larga escala envolvendo múltiplas linhas celulares ou experimentos de triagem com milhares de condições/compostos de teste seriam reduzidos devido a rápidas diferenciações. Leituras econômicas e de alto rendimento, incluindo medidas de crescimento de neurite de células vivas, podem ser facilmente desenvolvidas, implementadas e usadas como leituras fenotípicas para modelagem de doenças, como mostrado anteriormente14,15,16. Assim, adaptamos ainda mais o protocolo NGN2 usando células precursoras neurais derivadas de pequenas moléculas (smNPC) que constitutivamente super-expressam GFP. As células smNPC oferecem outras vantagens, incluindo custos reduzidos com mídia de cultura (um terço do custo com cultura iPSC) e tempo necessário para ampliar os experimentos. Os rendimentos celulares do smNPC são 7 a 10 vezes maiores do que os obtidos com iPSC. Os neurônios diferenciados foram monitorados e imagens com sucesso por vários dias usando um processo de imagem totalmente automatizado sem a necessidade de manchas manuais de anticorpos ou rotulagem química, economizando custos e tempo necessários para procedimentos manuais, incluindo a imagem por si só. A imagem atual de 60 poços internos de uma placa de 96 poços leva cerca de 16 minutos por placa quando 25 campos por poço são imagens, o que significa que os dados para uma triagem baseada em imagem para 1000 compostos, poderiam ser adquiridos e analisados em um dia. No futuro, essa leitura poderia ser usada em estudos de triagem composta para o resgate de defeitos de crescimento de neurite.
Além disso, demonstramos também a transferência de um protocolo de diferenciação manual para geração de neurônios dopaminérgicos de cérebro médio (mDA) a partir do iPSC. Este pequeno protocolo de diferenciação baseado em moléculas leva 65 dias e é intensivo em mão-de-obra por causa das múltiplas etapas de replação e mudanças frequentes na mídia, principalmente a cada 2 dias, o que limita a produção de neurônios mDA a poucas linhas iPSC ao mesmo tempo. O protocolo automatizado de diferenciação mDA tem a grande vantagem de aumentar a diferenciação para dezenas de linhas iPSC. Até 30 linhas celulares poderiam ser diferenciadas em paralelo. Como a diferenciação é baseada principalmente em mudanças de mídia, quase todo o processo de diferenciação pode ser conduzido sem interferência humana. Usando o programador baseado em calendário do sistema automatizado, poderíamos planejar as mudanças de mídia de acordo com as etapas de diferenciação. Uma limitação de trabalhar com um número tão grande de linhas celulares e placas de cultura foi a impossibilidade de realizar alterações na mídia durante a noite. A principal razão é o fato de que nosso sistema está configurado para usar dicas descartáveis e recarga manual de mídias culturais que exigem que um usuário em laboratório execute esta etapa manual. Para facilitar o processo de troca de mídia, as placas carregadas no sistema foram atribuídas a um projeto e agrupadas em lotes. O tamanho do lote foi então adaptado ao número de dicas descartáveis e volume de mídia de cultura disponível. Como discutido acima, essa limitação pode ser facilmente superada pela implementação de agulhas reutilizáveis/laváveis e recarga automatizada de mídia. A troca/replação automatizada de células, como mostrado para iPSC, é uma das conveniências oferecidas pelo nosso sistema automatizado de cultura celular. Testamos a replação automatizada de neurônios mDA no dia 25 de diferenciação. No entanto, a dissociação dos neurônios mDA requer uma incubação mais longa (40 minutos) com a enzima dissociação do que o iPSC (8 min) estendendo o processo automatizado de replação para mais de 1 h por linhas celulares. Como consequência, a replação automatizada de 30 linhas celulares no mesmo dia tornou-se impossível. Acelerar outras etapas durante a replação automatizada (transporte de placas, pipetting) e adaptar o sistema ao uso de agulhas e linha de mídia que torna possível um trabalho noturno resolveria essa limitação. Apesar das desvantagens, poderíamos transferir com sucesso o protocolo manual para uma diferenciação automatizada de neurônios mDA produzindo culturas com quantidades substanciais de células positivas MAP2 (neurônio) e TH (neurônios mDA).
Diferenciar dezenas de linhas celulares iPSC em paralelo é de grande interesse em projetos que investiguem os mecanismos moleculares de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson. No entanto, concluir tarefas mais rapidamente com menos erros e a custos reduzidos é um grande desafio. Devido à automação dos protocolos aqui apresentados (iPSC, smNPC e neurônio mDA), poderíamos acelerar, reduzir os custos e aumentar a reprodutibilidade em nossos projetos. O desenvolvimento de projetos como o FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) envolvendo centenas de linhas celulares de pacientes mostra necessidade de protocolos automatizados de cultura e diferenciação. Nossas perspectivas futuras incluem a transferência de modelos manuais de cultura celular 3D (3D) para o sistema automatizado. Pequenas adaptações nas configurações de definição da placa e o uso de adaptadores permitirão o uso de placas comerciais ou personalizadas e câmaras microfluídicas necessárias para as culturas 3D. Além disso, a implementação de um modelo automatizado de imagem sem rótulos nos permitirá acompanhar o crescimento neuronal em tempo real e traduzir mudanças no crescimento do neurite, organização dos neurônios e morte celular em uma melhor compreensão dos mecanismos da doença.
Divulgações
Não temos nada para revelar.
Agradecimentos
Os autores reconhecem com gratidão os pacientes e seus familiares que contribuíram com o biomamaterial para este estudo. As linhas de células utilizadas no estudo foram da coleção NINDS com Rutgers (ND41865 como iPS#1) e do laboratório do Dr. Tilo Kunath (iPS#2). Este trabalho é apoiado em parte pela NoMIS Foundation (PH), RiMod-FTD, um Programa Conjunto da UE - Pesquisa de Doenças Neurodegenerativas (JPND) (PH); A iniciativa DZNE I2A (AD); PD-Strat, um projeto financiado pela ERA-Net ERACoSysMed (PH) e a Foundational Data Initiative for Parkinson's Disease (FOUNDIN-PD) (PH, EB). Foundin-PD faz parte do programa PATH to PD da Fundação Michael J. Fox. Os autores agradecem a Steven Finkbeiner e Melanie Cobb (Gladstone Institutes) por contribuírem para o estabelecimento do protocolo manual de diferenciação de neurônios mDA e Mahomi Suzuki (Yokogawa Electric Corporation) pela assistência na configuração de análise de crescimento de neurite.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anticorpos | Distribuidor | Número de catálogo | Diluição |
| marcador de pluripotência iPSC | |||
| Mouse anti-SSEA4 | Abcam | ab16287 | 1 a 33 |
| Coelho anti-Oct3/4 | Abcam | ab19857 | 1 a 200 |
| NGN2 marcadores de neurônios | |||
| Mouse anti- TUBB3 | R & D | MAB1195 | 1 a 500 |
| Coelho anti-BRN2 | NEB | 12137 | 1 a 1.000 |
| marcadores de neurônio mDA | |||
| Frango anti-TH | Pel-Freez Biologicals | 12137 | 1 a 750 |
| Camundongo anti-MAP2 | Santa Cruz | sc-74421 | 1 a 750 |
| Anticorpos secundários | |||
| IgY anti-frango de cabra, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11039 | 1 a 2.000 |
| IgG anti-rato de cabra, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | 1 a 2.000 |
| IgG anti-rato de cabra, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | 1 a 2.000 |
| IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 a 2.000 |
| anti-coelho de cabra IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 a 2.000 |
| IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | 1 a 2.000 |
| Contracoloração de núcleos | |||
| Hoechest 33342 | Invitrogen | H3570 | 1 a 8.000 |
| Instrumentos | Distribuidor | Número de catálogo | Descrição/Aplicação |
| Agilent Sistema TapeStation | Tecnologias Agilent | 4200 | Eletroforese automatizada para amostras de DNA e RNA |
| Automatizado -20 ° Sistema de armazenamento C | Hamilton Storage Technologies | Sample Access Manager (SAM -20C, série 3200) | Armazenamento de reagentes |
| Leitor de código de barras | Leitor | de código de barras Honeywell Orbit | Leitor de código de barras |
| Brightfield cell cytomat | Nexcelom | Celigo Verificação | de confluência e contagem de células |
| CellVoyager 7000 | Yokogawa | CellVoyager 7000 | Microscópio confocal automatizado |
| Cytomat para culturas de células | Thermo Fisher Scientific | Cytomat 24 C, | 12 empilhadores passo 28 mm, 12 empilhadores passo 23 mm (total de 456 placas) |
| Cytomat para descongelamento de amostras | Thermo Fisher Scientific | Cytomat 2-LIN, 60 DU (Unidade de Secagem) | 2 empilhadores passo 28 mm (total de 42 placas) |
| Filtros HEPA | Hamilton Robotics | Hood Flow Star | UV Modificado por Hamilton Robotics |
| Estação de manuseio de líquidos | Hamilton Robotics | Microlab | Star Canais: 8x 1-ml, 4x 5 ml e 96 Canais MPH |
| Reservatório de mídia | Hamilton Robotics | 188211APE | Reservatório de mídia/reagentes |
| Sistema de água pura | Veolia Water | ELGA PURELAB Classic | Fornece água pura para estação de lavagem de agulhas |
| Sistema de PCR em Tempo Real QuantStudio 12K Flex | Thermo Fisher Scientific | QSTUDIO12KOA | Máquina de PCR em Tempo Real |
| Braço robótico | Hamilton Robotics | Rackrunner | Transporte de placas |
| Mesa giratória | Hamilton Robotics | Mesa giratória | Ajustar a orientação |
| da placa Fonte de alimentação ininterrupta | APC | Smart UPS RT Unit, 10000 VA Power fonte | de alimentação de backup |
| VIAFLO-pipetas | Integra | 4500 | Pipeta eletrônica |
| ViiA 7 Sistema de PCR em tempo real | Applied Biosystems | 4453545 | Máquina |
| Materials | Distribuidor | Número de catálogo | < forte>Notas |
| Placa de cultura de 1 poço (84 cm2) | Thermo Fischer Scientific | 165218 | Nunc OmniTray |
| (9,6 cm2) | Greiner Bio-One | 657160 | TC tratado com tampa |
| Placa de cultura de 12 poços (3,9 cm2) | Greiner Bio-One | 665180 | TC tratado com tampa |
| Placa de cultura de 96 poços (0,32 cm2) | Perkin Elmer | 6005558 | CellCarrier-96 Pontas de placa preta |
| , 50-µ L | Hamilton Robotics | 235987 | pontas de 50 uL |
| Dicas, 300-µ L | Hamilton Robótica | 235985 | 300-µ L dicas |
| Dicas, 1000-µ L | Hamilton Robótica | 235939 | 1000-µ Pontas L |
| Hamilton Robotics | de 5 mL | 184022 | pontas de 5 mL |
| Tubos, | Tubos Greiner Bio-One | 188271 | 15 mL Tubos de 15 mL |
| , Tubos de 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | 50 mL |
| Frascos criogênicos de 2,0 mL Nalgene | Sigma Aldrich | V5007 | Cryovials |
| Plasmids | Distribuidor | Número de catálogo< | strong>Notas |
| pLV_hEF1a_rtTA3 | Addgene | 61472 | Gentil presente de Ron Weiss |
| pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro | Addgene | 61474 | Gentil presente de Ron Weiss |
| pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivírus | Takara Bio | 631983 | |
| Primers | Sequence (forward) | Sequence (reverse) | Source |
| iPSC pluripotency | |||
| OCT4 (ID 4505967a1) | CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG | GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC | PrimerBank |
| NANOG (ID 153945815c3) | CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA | CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC | PrimerBank |
| REX1 (ID 89179322c1) | AGAAACGGGCAAAGACAAGAC | GCTGACAGGTTCTATTTCCGC | PrimerBank |
| NGN2 neurônios | |||
| MAP2 (ID 87578393c1) | CTCAGCACCGCTAACAGAGG | CATTGGCGCTTCGGACAAG | PrimerBank |
| BRN2 (ID 380254475c1) | CGGCGGATCAAACTGGGATTT | TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT | PrimerBank |
| CUX2 (ID 291045458c2) | CGAGACCTCCACACTTCGTG | TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG | PrimerBank |
| NCAM1 (ID 336285437c3) | TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC | CTCACAGCGATAAAGTGCCCTC | PrimerBank |
| SYNAPSIN1 (ID 91984783c3) | TGCTCAGCAGTACAACGTACC | GACACTTGCGATGTCCTGGAA | PrimerBank |
| mDA neurônios | |||
| TH | CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTGTA | CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA | NCBI primer-BLAST |
| MAP2 | GGATCAACGGAGAGCTGAC | TCAGGACTGCTACAGCCA | NCBI primer-BLAST |
| strong>Genes de limpeza | |||
| GAPDH | GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG | GAGCCCCAGCCTTCTCCATG | NCBI primer-BLAST |
| OAZ1 | AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT | ATGAAGACATGGTCGGCTCG | NCBI primer-BLAST |
| RPLPO | CCTCATATCCGGGGGAATGTG | GCAGCAGCTGGCACCTTATTG | NCBI primer-BLAST |
| RPL13A | GCCTACAAGAAAAGTTTGCCTATC | TGGCTTTCTCTTTCCTCTCTCTCC | NCBI primer-BLAST |
| Media e Reagentes | Distribuidor | Número de Catálogo< | strong>Concentração de uso |
| Matriz de revestimento | |||
| Matriz extracelular (Matrigel) | Corning | 354277 | 10 μ g / mL |
| de fibronectina | Corning | 356008 | 2 μ g/mL |
| Laminin | Sigma | L2020 | 5 - 10 μ g/mL |
| de poli-L-ornitina (PLO) | Sigma | P3655 | 0,1 mg/mL |
| Meio de cultura | |||
| meio de cultura iPSC (meio Essential 8 Flex) | Neurônios Gibco | A2858501 | |
| NGN2 - meio NGN2 | |||
| 2-mercaptoetanol | Gibco | 21985023 | 0,909 mL (50 µ M) |
| Suplemento B27 | Gibco | 12587010 | 10 mL (1%) |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Gibco | 31331093 | 484,75 mL |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL (2 mM) |
| Insulina | Sigma | I9278 | 0,25 mL (2,5 µ g/mL) |
| MEM Aminoácidos Não Essenciais | Gibco | 11140050 | 5 mL (0,5%) |
| Suplemento de N2 | Gibco | 17502048 | 5 mL (0,5%) |
| Meio neurobasal | Gibco | 21103049 | 485 mL |
| mDA neurônios - | |||
| 2-mercaptoetanol | Gibco | 21985023 | 0,5 mL (55 µ M) |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL (2 mM) |
| Knockout DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | 409,5 mL |
| Reposição de soro knockout (reposição de soro) | Gibco | 10828028 | 75 mL (15%) |
| Aminoácidos não essenciais MEM | Gibco | 11140050 | 5 mL (1%) |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco | 15140122 | 5 mL (1%) |
| mDA neurônios - N2 médio | |||
| B27 suplemento | Gibco | 12587010 | 10 mL (2%) |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL (2 mM) |
| Suplemento de N2 | Gibco | 17502048 | 5 mL (1%) |
| Meio neurobasal | Gibco | 21103049 | 475 mL |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco | 15140122 | 5 mL(1%) |
| mDA neurônios - Meio de diferenciação | |||
| B27 suplemento | Gibco | 12587010 | 10 mL (2%) |
| Meio neurobasal | Gibco | 21103049 | 485 mL |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140122 | 5 mL (1%) |
| NGN2 neurônios - Suplementos | |||
| Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF) | Peprotech | 450-02 | 10 ng/mL |
| CHIR99021 (CHIR) | R& D | 4423/10 | 2 μ M |
| Doxicilina (dox) | Sigma | D9891 | 2.5 μ g/mL |
| de Fator Neurotrófico Derivado da Glial (GDNF) | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL |
| ácido L-ascórbico 2-fosfato magnésio (AA2) | Sigma | A8960 | 64 mg/L |
| Fator neurotrófico-3 (NT-3) | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL |
| Purmorlamina (PMA) | Cayman | 10009634 | 0,5 μ M |
| Puromicina | Sigma | P8833-10MG | 0.5 μ g/mL |
| de Tiazovivin | Merk Millipore | 420220-10MG | 2 μ |
| Neurônios MmDA - Suplementos | |||
| Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF) | Peprotech | 450-02 | 20 ng/mL |
| CHIR99021 (CHIR) | R& D | 4423/10 | 3 μ M |
| DAPT | Cayman | 13197 | 10 µ M |
| Dibutiril-cAMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | 1 mM |
| Fator de Crescimento de Fibroblastos 8B (FGF-8b) | Peprotech | 100-25 | 100 ng/mL |
| Fator Neurotrófico Derivado de Glial (GDNF) | Peprotech | 450-10 | 20 ng/mL |
| Ácido L-ascórbico (AA1) | Sigma | A4403 | 0,2 mM |
| LDN193189 (LDN) | Cayman | 11802 | 100 nM |
| Purmorlamina (Purm) | Cayman | 10009634 | 2 μ M |
| Sonic Hedgehog/SHH (C24II) N-Terminus (SHH) | R& D | 1845-SH | 100 ng/mL |
| SB431542 (SB) | Cayman | 13031 | 10 μ M |
| Fator de Crescimento Transformador tipo ß 3 (TGFß 3) | R & D | 243-B3 | 1 ng/mL |
| Y-27632 | Cayman | 10005583 | 10 µ M |
| Reagentes de dissociação | |||
| Reagente de dissociação de célula única (StemPro Accutase) | Gibco | A1110501 | 1x |
| UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0 | Gibco | 11575020 | 0,5 mM |
| RNA isolamento e kit de cDNAkit de isolamento Qiagen | |||
| 74106 | Tampão de lise de RNA Rneasy MiniKit | ||
| Tampão | de 15596018 | Thermo Fisher Scientific | (tampão de lise de RNA ) |
| Transcriptase reversa (kit) | Thermo Fisher Scientific | 18080-085 | SuperScript III Transcriptase |
| Software | Empresa | Número de catálogo | Descrição/Aplicação |
| Cell Culture Framework (CCF) (interface gráfica do usuário, GUI) | Hamilton Robotics | Interface | de usuário personalizada para o sistema automatizado |
| Software CellPathFinder (software de análise de imagem 1) | Software Yokogawa | CellPathfinder HCS | Ferramenta de análise de imagem |
| Sistema de Medição CellVoyager | Yokogawa | Incluído com CellVoyager 7000 | Software de controle de microscópio |
| Software Columbus (software de análise de imagem 2) | Perkin Elmer | Columbus | Ferramenta de análise de imagem |
| Aplicativo qPCR baseado em nuvem | Thermo Fisher Scientific | Themo Fisher nuvem | Software de análise para dados qRT-PCR |
| Venus software | Hamilton Robotics | VENUS Two Dynamic Schedular 5.1 Software | Software de controle para o sistema automatizado |
Referências
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