Artigo de método

Isolamento e Cultivo de Células-Tronco Mesenquimais de Medula Óssea Mandibular em Ratos

DOI:

10.3791/61532

⸱

25 de agosto de 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Science, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology, 2The 2nd Dental Center, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este artigo apresenta um método que combina a adesão total da medula óssea e a classificação da citometria de fluxo para isolar, cultivar, classificar e identificar células-tronco mesenquimais de medula óssea a partir de mandíbulas de ratos.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui apresentamos um método eficiente para isolar e culminar células-tronco mesenquimais de medula óssea mandibular (mBMSCs) in vitro para obter rapidamente numerosas células de alta qualidade para requisitos experimentais. os mBMSCs poderiam ser amplamente utilizados em aplicações terapêuticas como células de engenharia tecidual no caso de doenças craniofaciais e regeneração cranio-maxilofacial no futuro devido à excelente capacidade de autoconexão e potencial de diferenciação de multi-linhagem. Por isso, é importante obter mBMSCs em grande número.

Neste estudo, a medula óssea foi liberada da mandíbula e os MBMSCs primários foram isolados através de todo o cultivo adepto da medula óssea. Além disso, CD29+CD90+CD45− mBMSCs foram purificados através da classificação celular fluorescente. A segunda geração de mBMSCs purificados foi utilizada para estudos mais aprofundados e apresentou potencial na diferenciação de osteoblastos, adipócitos e condrócitos. Utilizando esse modelo in vitro, pode-se obter um alto número de mBMSCs proliferativos, o que pode facilitar o estudo das características biológicas, a reação subsequente ao microambiente e outras aplicações de mBMSCs.

Introdução

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As células-tronco mesenquimais de medula óssea (BMSCs) são células-tronco não hematopoiéticas derivadas da medula óssea que manifestam forte capacidade de proliferação e potencial de diferenciação de multi-linhagem1,2,3,4. De fato, os BMSCs têm sido considerados como um candidato ideal para engenharia e regeneração de tecidos ósseos desde que foram descobertos. Durante anos, a crista ilíaca ou ossos longos, como a tíbia e o fêmur, têm sido a fonte mais comum de BMSCs para regeneração craniofacial. No entanto, os BMSCs orofacial, como os BMSCs mandibulares (mBMSCs), apresentam algumas diferenças em relação aos BMSCs longos, como diferentes padrões de origem embrionária e de desenvolvimento. As mandíbulas surgem de células de crista neural da camada germe neuroectoderm e sofrem ossificação intramembana, enquanto esqueletos axial e appendicular são do mesoderme e sofrem ossificação endocondral. Além disso, observações clínicas e estudos experimentais em animais têm consistentemente indicado que há diferenças funcionais entre os BMSCs orofacial e ilíaca5,6,7,8. Relatos mostraram que os BMSCs derivados de ossos craniofaciais como mandíbula, osso maxilar e osso alveolar apresentaram proliferação superior, tempo de vida e capacidade de diferenciação do que os dos ossos axiais e appendiculares9. os mBMSCs, portanto, são considerados os recursos preferidos para futuras aplicações terapêuticas de doenças craniofaciais como querubismo, tumor de mandíbula, osteoporose do osso da mandíbula e defeito do tecido periodontal10,11,12. Para entender o potencial de tratamento em experimentos pré-clínicos, é essencial estabelecer um método para isolar e culminar rapidamente os MBMSCs in vitro.

Neste estudo, o objetivo foi obter mBMSCs purificados por adesão integral da medula óssea e triagem de citometria de fluxo. A morfologia anatômica da mandíbula de rato, claramente observada através de tomografia microcomputífica (Micro-CT) e seções histológicas, mostrou que o osso trabecular da mandíbula estava entre o espaço medular incisivo e o osso alveolar. A medula óssea do osso trabecular foi lavada para obter células de medula mandibular, mas as células cultivadas dessa forma não eram mBMSCs puras e provavelmente consistiam em múltiplos tipos de células com potências incertas e diversas linhagens como células de células ósseas, gordas e endoteliais13,14. O próximo passo da purificação celular foi particularmente importante. A citometria de fluxo filtra as células reconhecendo uma combinação de proteínas da superfície celular e tem sido amplamente adotada no enriquecimento de células-tronco mesenquimais. A homogeneidade celular é a principal vantagem da citometria de fluxo, mas o processo não determina a viabilidade celular e pode resultar em um rendimento celular limitado. Neste estudo, os P0 mBMSCs obtidos a partir da adesão total da medula óssea foram classificados por citometria de fluxo para obtenção de mBMSCs com alta pureza e forte capacidade de proliferação.

Este estudo introduz um protocolo reprodutível e confiável para isolamento, cultura e diferenciação de BMSCs mandibulares de ratos usando uma combinação de adesão total da medula óssea e classificação de citometria de fluxo. É um método confiável e conveniente para pesquisadores em áreas relacionadas a usar.

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Protocolo

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Todos os procedimentos experimentais animais neste artigo foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais do Hospital do Nono Povo de Xangai, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine.

1. Preparação

  1. Use dois ratos de 5 semanas de idade, Sprague Dawley, para o experimento.
  2. Esterilize todos os instrumentos, incluindo porta-agulhas, pinças e tesouras em alta temperatura ou imerso em 75% de etanol por 10 minutos.
    NOTA: A imersão do etanol não deve demorar muito para evitar danos celulares.
  3. Prepare previamente os meios de comunicação culturais, da qual a composição está prevista na Tabela 1. Suplemente cada meio descrito abaixo.
    1. Preparação de α-MEM médio cultural (com 10% FBS): Suplementação mínimo de alfa médio essencial mínimo (α-MEM) com soro bovino fetal de 10% e 1% penicilina e estreptomicina.
    2. Preparação do meio de diferenciação osteogênica: Suplemento de diferenciação osteogênica meio basal com soro bovino fetal de 10%, 1% glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 0,20% ácido ascórbico, 1% β-glicosfatosfato e 0,01% de dexametasona.
    3. Preparação do meio de indução osteogênica: Misture 70% α-MEM meio de cultura (com 10% FBS) e 30% de meio de diferenciação osteogênica.
    4. Preparação do meio de diferenciação adipogênica A: Suplemento de diferenciação adipogênica meio basal com soro bovino fetal de 10%, 1% glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 0,20% insulina, 0,10% IBMX, 0,10% Rosiglitazone e 0,01% Dexametasona.
    5. Preparação do meio de diferenciação adipogênica B: suplemento de diferenciação adipogênica meio basal com soro bovino fetal de 10%, 1% glutamina, 1% penicilina-estreptomicina e 0,20% insulina.
    6. Preparação do meio de diferenciação condrogênica: Suplemento de diferenciação condrogênica meio basal com 0,01% Dexametasona, 0,30% Ácido ascórbico, 1% ITS, 0,10% piruvato de sódio, 0,10% Proline e 1% TGF-β3.
      NOTA: O meio de diferenciação osteogênica deve ser utilizado dentro de um mês após a configuração. O período efetivo do meio de diferenciação condrogênica configurado é de 12 h.

2. Isolamento e cultivo de mBMSCs de ratos

NOTA: Todas as operações experimentais devem ser realizadas no gelo o máximo possível para manter a viabilidade celular.

  1. Colhendo mandíbulas de rato
    1. Eutanize dois ratos de 5 semanas de idade, Sprague Dawley, por asfixia de CO2. Certifique-se de que a respiração do animal está parada antes de prosseguir com o experimento.
    2. Enxágüe esses ratos em um béquer contendo 75% de etanol por 3 min.
    3. Coloque o rato dentro de um capô de fumaça limpa para colher mandíbulas.
      NOTA: Esterilize a capa de fumaça por radiação de luz ultravioleta por 30 minutos antes de usar.
    4. Coloque o rato em uma posição supina. Incisar as peles e os músculos do buccinador desde anguluss bilaterais oris até a região posterior da mandíbula, que é o único osso móvel com incisivo inferior.
      NOTA: Recomenda-se fazer uma incisão de 2 cm em cada lado do angulus oris para obter um campo de operação claro.
    5. Abra a boca do rato empurrando os incisivos maxilares e mandibulares na direção oposta com ambos os polegares para expor os dentes mandibulares, que estão ligados à mandíbula.
    6. Desconecte completamente os músculos buccal e os tendões ligados aos coracoides e à borda inferior da mandíbula.
      NOTA: Observa-se um aumento da mobilidade da mandíbula durante esta etapa devido à falta de tensão muscular.
    7. Pressione os dentes posteriores mandibulares e gire para trás e para baixo até que os condyles de ambos os lados estejam claramente expostos.
      NOTA: Este passo é realizado para abrir artificialmente a boca do rato na medida do possível para deslocar o condíle. A mandíbula está conectada ao crânio através de condyles bilaterais, então a exposição dos condyles leva à desconexão entre o crânio e a mandíbula.
    8. Separe o corpo da mandíbula do crânio.
    9. Limpe o tecido mole aderente na superfície óssea usando uma gaze molhada.
    10. Coloque o osso em um prato de vidro estéril de 10 cm cheio de α mínimo essencial pré-cozido (α-MEM) ou salina tampão fosfato (PBS) no gelo para preservar a viabilidade.
  2. Isolamento e cultivo dos mBMSCs
    1. Corte o osso anterior ao longo da borda mesial do primeiro molar do corpo mandibular. Remova o ramus mandibular, incluindo coracoide e condíle ao longo da borda distal do terceiro molar para expor a cavidade da medula.
    2. Encha um prato de vidro estéril de 10 cm com 10 mL de α-MEM (com 10% de FBS).
    3. Use seringa de 1 mL para aspirar α-MEM. Com a agulha de seringa inserida na cavidade da medula óssea, lave repetidamente a medula óssea no prato. Lave a cavidade óssea pelo menos 3 vezes dos lados mesial e distal do osso, respectivamente, até que o osso ficou branco.
      NOTA: Este é o passo mais crítico, pois a cavidade da medula óssea de uma mandíbula de rato não é tão óbvia quanto no osso longo e o ponto adequado para inserir a agulha precisa ser determinado empiricamente. Todas as amostras experimentais acima devem ser armazenadas no gelo para manter a viabilidade celular e, portanto, o tempo de operação não deve ser superior a 2 h.
    4. Transfira a mídia contendo as células lavadas em um tubo de centrífuga de 15 mL e centrífuga a 800 x g em 4 °C por 5 min. Descarte o supernaspeso.
    5. Resuspense as células com 3 mL de α-MEM (com 10% de FBS). Coloque as células em um novo prato de cultura de 10 cm e incubar a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO2.
    6. Verifique as mudanças morfológicas e o crescimento dessas células no 3º dia de cultura. Remova o meio de cultura com células não aadeentes e fragmentos de tecido. Adicione suavemente 10 mL de α-MEM fresco (com 10% de FBS).
    7. Após 7 dias de cultura, os P0 mBMSCs atingiram 70% a 80% de confluência.
  3. Classificação de células de fluxo
    NOTA: Os P0 mBMSCs foram identificados fenotipicamente e purificados principalmente através da triagem de células de fluxo.
    1. Aspire e descarte o meio de cultura e depois lave o prato com PBS. Descarte o PBS.
    2. Adicione 1 mL de 0,25% de trippsina com 0,02% de EDTA no prato. Digerir as células a 37 °C por 5 min, depois adicione 2 mL de α-MEM (com 10% de FBS) para parar a reação.
    3. Transfira a suspensão das células para um tubo de centrífuga de 15 mL e centrífuga a 800 x g por 5 min.
    4. Resuspensar as células em 120 μL de PBS (com 10% de FBS) após centrifugação.
    5. Bloqueie estas suspensões celulares com 1 μL de anticorpo contra CD16/CD32 a 4 °C por 15 min.
    6. Transfira 100 μL da suspensão celular para um novo tubo de microcentrífuga, colorir as células com anticorpo conjugado Phycoerythrin (PE) contra CD45, anticorpo conjugado fluoresceína (FITC)contra CD90 e Allophycocyanin (APC)-anticorpo contra CD29 a 4 °C por 1 h no escuro13,15. A concentração de anticorpos utilizados neste experimento é mostrada na Tabela 2. Use os outros 20 μL de suspensão celular como controle negativo não manchado.
    7. Em seguida, centrifugar os tubos a 800 x g por 5 min, descartar a suspensão e resuspensar as células em 0,5 mL de PBS (com 10% de FBS).
    8. Adicione 10 μL de 0,01 mg/mL DAPI por 10 minutos antes da análise.
    9. Use filtros de 40 nm colocados em tubos de centrífuga para filtrar as células.
    10. Analise as células do Sorter celular ativado pela Fluorescência. Coloque os painéis da seguinte forma. Em primeiro lugar, remova as células mortas da contagem total de células, gating DAPI- células, depois portão CD29+CD90+CD45- nas células selecionadas como mBMSCs direcionados.
    11. Colete as células cd29+CD90+CD45classificadas em um tubo de centrífuga de 15 mL com 3 mL de α-MEM (com 10% FBS) pré-preparados.
    12. Centrifugar os tubos a 800 x g por 5 min. Remova o buffer de coleta e adicione 1 mL de α-MEM fresco (com 10% de FBS) para resuspensar as células. Em seguida, emplaque-los em um prato de cultura de 6 cm.

3. Capacidade de formação de colônias

NOTA: Esta etapa foi realizada para verificar a capacidade de divisão dos mBMSCs. 15

  1. Selecione mBMSCs de segunda passagem (P2) para este experimento. Quando a confluência celular atingiu 80% a 90%, reseed as células em um gradiente serial em uma placa de 6 poços para avaliar sua capacidade de proliferação clonal.
    NOTA: Recomenda-se definir o gradiente de 1 x 102 a 1 x 103 células por poço, mas as diluições finais de diferentes linhas celulares de origem humana ou animal foram empiricamente determinadas.
  2. Cultura as células em α-MEM (com 10% de FBS) por aproximadamente duas semanas até que um bom número de unidades formadoras de colônias pudesse ser visto sob microscópio leve. Refrescar o meio de cultura a cada 3 dias.
  3. Aspire e descarte o meio de cultura, lave os poços com PBS duas vezes por 5 minutos de cada vez. Em seguida, adicione 4% de solução de paraformaldeído a cada poço e fixe por pelo menos 10 min.
  4. Retire o paraformaldeído e enxágue os poços duas vezes com PBS.
  5. Manche as células com solução de coloração violeta cristalina e incuba-as em 37 °C por cerca de 10 minutos.
    NOTA: O tempo de coloração ajustado adequadamente até que a sombra desejada seja alcançada.
  6. Remova a solução de coloração e lave as amostras com água destilada para impedir a reação.
  7. Imagem sob um estereómico e contar colônias de células dispersas que consistiam de pelo menos 50 células.

4. Diferenciação de multilineagem de mBMSCs

NOTA: Os P2 mBMSCs foram usados para experimentos subsequentes, a menos que descritos de outra forma.

  1. Indução osteogênica de mBMSCs
    1. Digerir os mBMSCs conforme descrito acima. Células de sementes a uma densidade de 2,5 x 105/cm2 em uma placa de 12 poços suplementadas com 1 mL α-MEM (com 10% FBS).
    2. Quando a confluência celular atingiu 60-70%, mude o meio para 30% de mídia de indução osteogênica. Cultuem as células com α-MEM (com 10% de FBS) como controle negativo e alterem o meio a cada 2 dias.
      NOTA: Depois que um grande bom número de nódulos de cálcio aparecerem durante a osteogênese, recomenda-se alterar o padrão de troca média para uma troca média de meio volume a cada 2 dias, para evitar que os osteoblastos flutuassem.
    3. Após a colheita por sete dias, avalie a calcificação dessas células por manchas alcalinas de fosfatase16,17.
    4. Remova o meio de cultura e fixe as células com 4% de paraformaldeído por 10 minutos. Enxágüe as células usando 1 mL de PBS por poço por 3 minutos duas vezes.
    5. Em seguida, colorir as células com solução alcalina de coloração de fosfatase e incubar a 37 °C por 10-30 min.
      NOTA: A incubação pode ser realizada durante a noite à temperatura ambiente para obter a cor necessária.
    6. Lave os poços com água destilada para parar a reação. Tire fotos sob microscópio leve. Grânulos pigmentados vermelhos representam atividade alcalina de fosfattase (ALP).
    7. Após a cultura das células restantes por mais 7 dias, realize a coloração vermelha alizarina para avaliar a capacidade de mineralização das células.
    8. Colorisse as células com solução de coloração vermelha de 0,5% após fixação celular por 10 min16,18. Pare a reação cromogênica com água destilada após 3-5 min.
      NOTA: O tempo de reação pode ser estendido dependendo da cor desenvolvida.
    9. Por fim, coloque a placa de cultura sob o microscópio de luz para observar o efeito da coloração osteogênica; nódulos vermelhos indicam depósitos de cálcio dessas células.
  2. Indução adipogênica de mBMSCs
    1. Seed P2 mBMSCs em uma placa de 12 poços como descrito acima.
    2. Após o bem se tornar 90% confluente, cultura as células com diferenciação adipogênica média A. Use células cultivadas em α-MEM meio de cultura (com 10% FBS) como controle negativo.
    3. Após 2 dias de indução, aspire o médio A do poço e adicione 1 mL de diferencial adipogênica médio B em cada poço.
    4. Depois de um dia, remova o médio B e inicie o ciclo novamente com o meio A adicionado de volta ao poço. Cultura as células alternadamente usando médio A e B.
    5. Aplique os meios de diferenciação A e B alternadamente por três ciclos e detecte a adipogênese dessas células por mancha O vermelha de óleo16,18.
      NOTA: Muitas gotículas redondas e grandes lipídicas podem ser observadas culminando com essas células com meio de diferenciação B por mais 2 a 3 dias.
    6. Retire o meio e fixe as células com 4% de paraformaldeído por 10 minutos. Lave as células com PBS.
    7. Colora as células com óleo vermelho Solução de coloração O e incubar a 37 °C por aproximadamente 3 min.
    8. Remova a solução de coloração e lave os poços com água destilada.
    9. Observe adipogênese sob microscópio leve.
  3. Indução de condronese de mBMSCs
    1. Semente P2 mBMSCs em tubo centrífuga de 15 mL a uma densidade de 5 x 105/cm2.
    2. Centrifugar os tubos a 300 x g por 5 min. Descarte o supernaspeso.
    3. Resuspense as células com 0,5 mL de meio de diferenciação condrogênica. Centrifugar as células a 300 x g por 5 min.
    4. Solte a tampa do tubo de centrífuga e incuba-o a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO2. Renove o meio a cada 2 dias.
      NOTA: As células começam a ser pelotas após 24h. Recomenda-se não mover o tubo centrífuga por 48 h. Tenha cuidado para não aspirar a pelota celular ao trocar o meio.
    5. Após 21 dias de indução, fixar as pelotas celulares com 4% de paraformaldeído, seguida de desidratação, incorporação de parafina e secção.
    6. Após a desparafinação e hidratação, manche os slides em solução azul alciana por pelo menos 15 min18,19,20,21, depois lave com água destilada para parar a reação. Capture as fotografias sob microscópio leve.
    7. Para coloração imunofluorescente do colágeno tipo II, realize as etapas abaixo.
      1. Incubar os slides com 5 μg/mL proteinase K por 15 min a 37 °C após a desparafinação e a hidratação.
      2. Incubar os slides no tampão de bloqueio por 1h a 37 °C.
      3. Aplique 1 μL de anticorpo tipo 2 de colágeno em 200 μL de tampão de bloqueio para os slides e incubar durante a noite a 4 °C.
      4. No dia seguinte, lave os slides com PBS duas vezes e incubar com anticorpos secundários a 37 °C por 1h.
      5. Incubar as fatias com 40,6-diamidino-2-fenilômado (DAPI) por 10 minutos.
    8. Tire fotos de cada slide sob microscopia de fluorescência.

5. PCR em tempo real

  1. Extrair RNA total de mBMSCs usando um reagente comercialmente disponível com isothionato à base de guanidium.
  2. Realize a transcrição reversa do RNA em DNA complementar usando um kit comercialmente disponível. As condições de reação da transcrição reversa foram as seguintes: 65 °C para 5 min, 37 °C para 15 min, 85 °C para 15 s.
  3. Execute o PCR em tempo real para detectar genes específicos de osteogênese e adipogênese usando primers listados na Tabela 3. O procedimento de amplificação do PCR foi o seguinte: 95 °C para 5 min. 95 °C para 5 s, 60 °C para 30 s para 40 ciclos.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Usando este protocolo, uma grande proporção de células aderiu à placa no terceiro dia após a cultura inicial. Normalmente, após 3-4 dias adicionais de cultura, a confluência celular atingiu 70 a 80%(Figura 1B). Com classificação celular fluorescente, DAPI-CD29+CD90+CD45− mBMSCs foram purificados18,22, que representaram cerca de 81,1% nas células P0(Figura 1C).<...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve um método para isolar BMSCs de mandíbulas de ratos in vitro, combinando a adesão total da medula óssea e a classificação celular fluorescente, que é uma maneira simples e confiável de obter mBMSCs proliferativos com forte capacidade de diferenciação. Este método poderia purificar preliminarmente os mBMSCs por classificação de células de fluxo, mas se houver requisitos mais elevados para homogeneidade celular, métodos de purificação mais precisos podem ser necessários.

A...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os autores afirmam que não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos pela ajuda do Laboratório de Estomatologia Digitalizada e Centro de Pesquisa para Anomalias Craniofaciais do Hospital do Nono Povo de Xangai. O trabalho deste manuscrito é apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit & Plateau Disciplines, o fundo SHIPM-mu do Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai No People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], o Projeto de Incentivo da Equipe de Inovação de Alto Nível para a Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. E L.J. é um estudioso dos Talentos Médicos Da Juventude, Shanghai "Rising Stars of Medical Talent" Youth Development Program e o projeto "Chen Xing" da Universidade de Xangai Jiaotong.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,25% Tripsina-EDTA (1X)Gibco25200072
placa de cultura de 10 cmCorning
acutenáculo
Meio de diferenciação adipogênicaCyagen biosciences inc.MUBMX-90031
Alcian BlueBeyotime Biotechnology
Alizarin redSigma-AldrichA5533
Kit de Desenvolvimento de Cor de Fosfatase AlcalinaBeyotime BiotechnologyC3206
alfa-Mínimo meio essencialGE Healthcare HyClone Cell CultureSH30265.01B
Anti-CollagenII Rabbit pAbAbcamab34712
Anticorpos contra CD16/CD32
Antifade Meio de Montagem com DAPIBeyotime BiotechnologyP0131
APC anti-camundongo/rato CD29 Anticorpo biolegendinc102215
Gabinete de BiossegurançaEscoAC2-4S8-CN
CD45 Anticorpo Monoclonal (OX1), PE, eBioscienceInvitrogen12-0461-82
CD90.1 (Thy-1.1) Anticorpo monoclonal (HIS51), FITC, eBioscienceInvitrogen11-0900-85
CentrífugaL500
Meio de diferenciação de condrogêneseCyagen Biosciences Inc.
Microscópio confocal de varredura a laserZeissLSM880
Countess II FL Contador de células automatizadoInvitrogenAMQAF1000
Solução de coloração violeta de cristalBeyotime BiotechnologyC0121
Soro bovino fetalGE Healthcare HyClone Cell CultureSH30084.03
Goat Anti-Rabbit IgG H & L (Alexa Fluor 488)abcamab150077
IncubadoraEscoCCL-170B-8
Microscópio invertidoolympusCKX53
Magzol reagente (reagente Trizol)Magen
micropipettorEppendorf
Oil Red O
Meio de diferenciação osteogênicaCyagen Biosciences Inc.MUBMX-90021
Penicilina-EstreptomicinaGibco15070063
Solução salina tamponada com fosfato (1X)Gibco20012027
PrimeScript RT Master KitTakaRa Bio IncRR036A
Proteinase KSigma-AldrichP6556
QuickBlock Blocking BufferBeyotime BiotechnologyP0260
SYBR1 PremixTakaRa Bio Inc
Toluidina AzulBeyotime Biotecnologia
Trypan Blue Solution, 0,4%Gibco15250061
scissor

Referências

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