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Artigo de método

Um novo paradigma de condicionamento do medo pavloviano para estudar o congelamento e o comportamento de voo

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DOI:

10.3791/61536

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5 de janeiro de 2021

 , 
1Department of Psychology, Tulane University, 2Tulane Brain Institute, Tulane University

Neste artigo

Resumo

As respostas comportamentais defensivas dependem da intensidade da ameaça, proximidade e contexto de exposição. Com base nesses fatores, desenvolvemos um paradigma de condicionamento clássico que provoca transições claras entre congelamento condicionado e comportamento de voo dentro de indivíduos. Esse modelo é crucial para a compreensão das patologias envolvidas em ansiedade, pânico e transtornos de estresse pós-traumático.

Resumo

Comportamentos relacionados ao medo e à ansiedade contribuem significativamente para a sobrevivência de um organismo. No entanto, respostas defensivas exageradas à ameaça percebida são características de vários transtornos de ansiedade, que são a forma mais prevalente de doença mental nos Estados Unidos. A descoberta dos mecanismos neurobiológicos responsáveis pelos comportamentos defensivos ajudará no desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas. O condicionamento do medo pavloviano é um paradigma laboratorial amplamente utilizado para estudar o aprendizado e a memória relacionados ao medo. Uma grande limitação dos paradigmas tradicionais de condicionamento do medo pavloviano é que o congelamento é o único comportamento defensivo monitorado. Recentemente desenvolvemos um paradigma de condicionamento do medo pavloviano modificado que nos permite estudar tanto o congelamento condicionado quanto o comportamento de fuga (também conhecido como fuga) dentro de indivíduos individuais. Este modelo emprega choques de pé de maior intensidade e maior número de pares entre o estímulo condicionado e o estímulo incondicionado. Além disso, esse paradigma de voo condicionado utiliza a apresentação serial de estímulos auditivos de tom puro e ruído branco como estímulo condicionado. Seguindo o condicionamento nesse paradigma, os ratos exibem comportamento de congelamento em resposta ao estímulo de tom e respostas de voo durante o ruído branco. Esse modelo de condicionamento pode ser aplicado ao estudo de transições rápidas e flexíveis entre as respostas comportamentais necessárias para a sobrevivência.

Introdução

O medo é uma resposta adaptativa evolutivamente conservada a uma ameaça imediata1,2. Embora os organismos possuam respostas defensivas inatas a uma ameaça, associações aprendidas são cruciais para obter respostas defensivas apropriadas a estímulos preditivos de perigo3. A desregulação nos circuitos cerebrais que controlam as respostas defensivas provavelmente contribuirá para reações mal adaptativas associadas a múltiplos transtornos de ansiedade debilitantes, como transtorno de estresse pós-traumático (TEPT), transtorno de pânico4e fobias específicas5,6. A prevalência nos Estados Unidos para transtornos de ansiedade é de 19,1% para adultos e 31,9% em adolescentes7,8. A carga dessas doenças é extremamente elevada no cotidiano dos indivíduos e impacta negativamente sua qualidade de vida.

Nas últimas décadas, o condicionamento do medo pavloviano serviu como um poderoso sistema modelo para obter uma visão tremenda dos mecanismos neurais subjacentes ao aprendizado e memória relacionados ao medo9,10,11. O condicionamento do medo pavloviano implica emparelhar um estímulo condicionado (CS, como um estímulo auditivo) com um estímulo incondicionado aversivo (EUA; por exemplo, um choque elétrico)12. Como o congelamento é o comportamento dominante evocado e medido nos paradigmas de condicionamento pavloviano padrão, os mecanismos de controle neural de formas ativas de comportamento defensivo, como respostas de fuga/fuga permanecem em grande parte inexplorados. Estudos anteriores mostram que diferentes formas de comportamento defensivo, como o voo, são evocadas dependendo da intensidade da ameaça, proximidade e contexto13,14. Estudar como o cérebro controla diferentes tipos de comportamento defensivo pode contribuir significativamente para a compreensão dos processos neuronais que são desregulados nos transtornos de medo e ansiedade.

Para atender a essa necessidade crítica, desenvolvemos um paradigma de condicionamento pavloviano modificado que provoca saltos de voo e fuga, além de congelar15. Nesse paradigma, os camundongos são condicionados com um estímulo composto serial (SCS) consistindo em um tom puro seguido de ruído branco. Após dois dias emparelhando o SCS com um forte choque elétrico, os ratos exibem congelamento em resposta ao componente de tom e voo durante o ruído branco. Os interruptores comportamentais entre congelamento condicionado e comportamento de voo são rápidos e consistentes. Curiosamente, os ratos exibem comportamento de voo apenas quando o ruído branco CS é apresentado no mesmo contexto que um footshock anteriormente entregue (o contexto de condicionamento), mas não em um contexto neutro. Em vez disso, as respostas congelantes dominam neste contexto neutro, com níveis significativamente maiores de congelamento em resposta ao ruído branco em comparação com o tom. Isso é consistente com o papel do contexto na modulação da intensidade da resposta defensiva e com o papel regulatório da informação contextual na aprendizagem e memória relacionadas ao medo encontradas nos paradigmas tradicionais de condicionamento de ameaças16,17. Este modelo permite comparações diretas e dentro do assunto de múltiplos comportamentos defensivos de forma específica do contexto.

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Protocolo

As seguintes etapas/procedimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais após aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Tulane.

1. Preparação de ratos

  1. Use camundongos adultos do sexo masculino e/ou feminino com idade entre 3 e 5 meses. No presente estudo, utilizamos camundongos C57BL/6J machos obtidos do Laboratório Jackson, mas qualquer cepa de rato de um fornecedor respeitável pode ser usada.
  2. Pelo menos uma semana antes do experimento, abriga todos os ratos individualmente em um ciclo claro/escuro de 12:12 h ao longo do estudo. Forneça aos ratos acesso a ad libitum a comida e água.
  3. Realize todos os experimentos comportamentais durante o ciclo de luz. Realize todas as sessões na mesma hora do dia dentro de uma coorte individual. Por exemplo, se iniciar o experimento às 9:00 no dia 1, continue a partir desse momento até que o experimento seja concluído.

2. Preparação de materiais de estudo

  1. Contextos de estudo
    1. Escolha dois contextos diferentes para realizar os experimentos.
    2. Use uma câmara cilíndrica composta de plexiglas claras (diâmetro de 30 cm) como contexto A, com um piso plexiglas liso. A altura da câmara deve ser suficiente para evitar a fuga (pelo menos 30 cm de altura).
    3. Para o contexto B use um gabinete retangular (25 cm x 30 cm) com um piso de grade elétrica usado para fornecer choques de pé de corrente alternada. A altura desta câmara é muito importante e deve ter pelo menos 35 cm de altura. Alternativamente, use um teto transparente (certifique-se de que o vídeo possa ser gravado através deste material).
      NOTA: Use uma câmara com superfícies de parede lisas que podem ser facilmente limpas.
    4. Use uma solução de limpeza diferente para limpar os contextos. Por exemplo, contexto limpo A com ácido acético de 1% e contexto B com 70% de etanol. Limpe os contextos antes de iniciar a primeira sessão, entre testar ratos individuais e após a conclusão das sessões do dia. Isso é vital para remover as pistas olfativas de ratos anteriores. A limpeza completa também ajudará a evitar o dimensionamento da urina na rede de choque, o que comprometerá as sessões de condicionamento.
      NOTA: As soluções de limpeza também servem como uma sugestão olfativa, portanto, use o mesmo líquido de limpeza para um contexto específico.
    5. Coloque o contexto A ou o contexto B em uma caixa atenuante de som durante as respectivas sessões de estudo.
  2. Gerador de áudio
    1. Monte um alto-falante acima dos contextos para fornecer estímulos auditivos a 75 dB.
    2. Use um gerador de áudio programável para gerar estímulos auditivos em um cronograma pré-definido. O tom puro de 7,5 kHz é um som com uma forma de onda sinusoidal, enquanto o ruído branco é um sinal aleatório com intensidade igual em diferentes frequências, variando de 1 a 20.000 Hz.
    3. Use pulsos TTL para fornecer estímulos auditivos e sinais de choque com precisão temporal.
      NOTA: Antes de iniciar os experimentos, meça a saída de intensidade sonora do alto-falante montado em cada câmara usando um medidor dB.
  3. Shocker: Conecte o amortecedor com o piso da rede elétrica que é usado para entregar o choque AC de 0,9 mA. Defina a frequência, o início e a duração dos choques em um programa de computador. Entregue cada estímulo de choque no final de cada SCS por uma duração de 1 s, totalizando cinco pares de choque SCS por sessão de condicionamento.

3. Preparação de programa de computador e rastreamento de vídeo

  1. Gerar protocolos comportamentais usando codificação em um programa de software.
  2. No programa, defina o estímulo composto serial SCS. Este estímulo é uma apresentação serial de um tom puro de 10 s (cada pip é apresentado para 500 ms, na frequência de 7,5 kHz e taxa de 1 Hz) e ruído branco de 10 s (500 ms pips a 1 Hz).
  3. Defina os intervalos inter-ensaio (ITI) apresentados após cada ensaio, pseudorandomly.
  4. Durante o estudo, registo todo o comportamento do mouse em vídeo para análise subsequente.
    NOTA: As caixas de condicionamento de medo disponíveis comercialmente podem não ser configuradas para registrar os comportamentos através da câmera superior. Isso é muito importante, pois o vídeo gravado é usado para calcular o movimento horizontal, a velocidade e a distância total percorrida pelo animal.
  5. Para definir o rastreamento do software, coloque um mouse de teste em cada contexto relevante, ajuste a sensibilidade de rastreamento do contorno e defina o centro de gravidade. Isso garantirá a aquisição de dados confiáveis sobre posição relativa. Além disso, defina toda a área de contexto acessível ao tema.
    NOTA: O ajuste do tamanho do contorno para ambos os contextos é importante, pois a mudança de brilho em diferentes contextos mudará o tamanho do contorno.
  6. Determine um coeficiente de calibração usando os tamanhos conhecidos das câmaras e as dimensões de pixel da câmera que podem ser usadas para calcular a velocidade (cm/s).
  7. Sincronize os eventos de datamp do computador de aquisição de dados às suas ocorrências em tempo real.

4. Experimento comportamental

  1. Ligue todos os equipamentos: computadores, controlador de caixa de condicionamento de medo, shocker e software de gravação de vídeo e cronograma. Certifique-se de que os instrumentos estão ligados na ordem apropriada.
  2. Verifique todas as funções, incluindo tom, ruído branco e entrega de choque, e configure o sistema para a aquisição de dados.
  3. Transporte os animais de seu depósito para a sala de condicionamento. Deixe-os aclimatar lá por pelo menos 10 minutos.
  4. Retire o animal da gaiola de casa, coloque-o suavemente no respectivo contexto e, em seguida, ative imediatamente os programas de computador.
    NOTA: A inicialização do sistema de condicionamento do medo e da coleta de dados (timestamps, rastreamento do mouse e gravação de vídeo) de cada vez pode ser sincronizada usando ativações mediadas por pulso TTL.
  5. Pré-condicionamento/pré-exposição
    1. No primeiro dia, coloque o assunto no contexto A (contexto neutro). Permita-o aclimatar-se à câmara por 3 minutos (período de linha de base) e, em seguida, expô-lo a 4 ensaios de uma SCS de 20 s de duração total(Figura 1A-1B).
    2. Mantenha um ITI pseudorandom médio de 90 s (faixa 80-100 s). A duração total de cada sessão de pré-exposição é de 590 s.
  6. Condicionamento do medo
    1. Nos dias 2 e 3, coloque o assunto no Contexto B. Após um período de 3 min de linha de base, exponha o sujeito a cinco pares do SCS co-terminando com um choque de 1 s, 0,9 mA AC.
    2. Mantenha um ITI pseudorandom médio de 120 s (faixa 90-150 s). Ter cada sessão de condicionamento durando 820 s no total(Figura 1A).
    3. Dependendo do objetivo do experimento, submá-los ratos no dia 4 para um teste de recall (ver passo 4.7) ou para temer a extinção (ver passo 4.8).
  7. Recordação do medo (para testar a dependência do contexto)
    1. No dia 4, coloque o assunto no Contexto A. Após o período de 3 min de linha de base, apresente-o com 4 ensaios do SCS sem choque de pé, acima de 590 s.
    2. Mantenha um ITI pseudorandom médio de 90 s (faixa 80-100 s).
  8. Extinção do medo
    1. No dia 4, coloque o assunto no contexto B. Após o período de 3 min de linha de base, apresentam 16 ensaios do SCS sem choque de pé, ao longo da década de 1910.
    2. Mantenha um ITI pseudorandom médio de 90 s (faixa 60-120 s).
  9. Devolva o animal para sua gaiola e repita o procedimento para todos os animais.

5. Quantificação do comportamento

  1. Tenha um observador cego para a pontuação do experimento os vídeos gravados para o comportamento de congelamento usando limiares automáticos de detector de congelamento seguido de uma análise quadro a quadro de alterações de pixels.
    NOTA: Outros pacotes de software também podem ser usados para calcular o congelamento automaticamente usando o sistema de 2 câmeras. Também é possível para um observador pontuar manualmente o comportamento de congelamento.
  2. Defina o congelamento como uma cessação completa dos movimentos corporais, exceto os necessários para a respiração, para um mínimo de 1 s.
  3. Saltos de pontuação quando todas as 4 patas saem do chão, resultando em um movimento vertical e/ou horizontal.
  4. Exporte o arquivo marcado com marcadores de congelamento, salto e evento.
  5. Extrair eventos relevantes (congelamento e saltos) de períodos de tempo definidos (por exemplo, 10 s duração de pré-SCS, tom e ruído branco, para cada ensaio).
  6. Utilizando as durações de início de parada extraídas de eventos em um arquivo de planilha, calcule a duração do congelamento (em s) subtraindo o tempo de início a partir do tempo final, a partir dos respectivos períodos de ensaio.
  7. Represente este teste de dados em termos de teste ou em dia, resumindo a duração do congelamento de todos os ensaios.
    NOTA: Dependendo da finalidade do estudo, os comportamentos de voo ou congelamento podem ser pontuados e calculados a partir de qualquer ensaio/duração da sessão de estudo.
  8. Soma o número total de saltos de uma duração de teste específica.
  9. Extrair o arquivo gerado pelas coordenadas de rastreamento do mouse a partir do movimento do eixo quadro X-Y do centro de gravidade do mouse e calcular a velocidade do mouse (cm/s).
    NOTA: Os dados de velocidade podem estar presentes no formato cm/s ou pixel/s. Converta a unidade pixel/s em cm/s usando valor de polegada ou cm/pixel definido no vídeo para esse contexto de teste (consulte a seção 3.6).
  10. Depois de extrair dados de velocidade para o movimento quadro por quadro do animal, com base na taxa de quadros do vídeo (preferencialmente 30 quadros/s), calcule a velocidade média do animal em um suporte específico de número de quadro (multiplique os tempos de início e fim em s por 30 para obter o número do quadro inicial e final).
  11. Calcule as pontuações de voo dividindo a velocidade média durante cada SCS pela velocidade média durante os 10 s pré-SCS (linha de base, BL) e, em seguida, adicionando 1 ponto para cada salto de fuga (speedCS/speedBL + # de saltos). Uma pontuação de voo de 1, portanto, não indica nenhuma mudança no comportamento de voo do período pré-SCS.
  12. Opcionalmente, marque vídeos manualmente para outros comportamentos, como criação e preparação.

6. Análise estatística

  1. Analisar dados para significância estatística utilizando software de análise estatística. Para todos os testes, a definição de significância estatística é P<0,05.
  2. Verifique os dados para distribuição normal usando o teste de normalidade Shapiro-Wilk (α=0,05).
  3. Para testar o efeito das pistas, realize as comparações pareadas usando o teste paramétrico apropriado (t-test emparelhado) ou não paramétrico (teste de classificação assinada de Wilcoxon).
  4. Para avaliar a interação de 2 vias de fatores (teste cue X), realize um ANOVA de 2 vias seguido de testes pós-hoc (por exemplo, teste de comparação múltipla de Bonferroni/teste de Tukey).

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Resultados

Conforme descrito no diagrama(Figura 1A),a sessão começa com pré-exposição (Dia 1), seguida pelo condicionamento do medo (Dias 2 e 3), e depois extinção ou recuperação (dia 4).

As apresentações do SCS na sessão de pré-exposição (Dia 1) não provocaram voo ou resposta de congelamento nos camundongos(Figura 2A-2B). A análise comportamental durante o condicionamento (Dias 2 e 3) revelou que o componente de tom do SCS aume...

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Discussão

Os parâmetros de som e choque descritos são elementos importantes deste protocolo. É fundamental, portanto, testar a amplitude de choque e o nível de pressão sonora antes de iniciar os experimentos. Estudos de condicionamento do medo normalmente usam níveis de pressão sonora de 70-80 dB e intensidade de choque de 0,1-1 mA18; assim, os parâmetros descritos estão dentro dos limites dos paradigmas tradicionais de condicionamento do medo. Em um experimento de controle anterior de CS (sem choque de pé)...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Regentes da Louisiana através do Fundo de Apoio ao Conselho de Regentes (LEQSF(2018-21)-RD-A-17) e pelo Instituto Nacional de Saúde Mental dos Institutos Nacionais de Saúde sob o prêmio número R01MH122561. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
ContextoCilindro de plexiglass 30 X 30 cm 
Caixa de condicionamento do medoMed Associates, Inc.VFC-00825 X 30 X 35 cm dimensões
Gerador de áudio Associados Médicos, Inc.ANL-926 
ShockerMed Associates Inc.ENV-414SAlto-falante de grade de aço inoxidável
MedAssociates, Inc.ENV-224AMAdequado para tom puro e ruído branco 
Camundongos C57/BL6JJackson laboratory, EUA664Envelhecido 3-5 meses
Software Cineplex (Editor/estúdio)PlexonCinePlex Studio v3.8.0Para rastreamento de vídeo e análise de pontuação comportamental
Software MedPC VMed Associates, Inc.SOF-736
NeuroexplorerPlexonUsado para extrair os dados de congelamento pontuados no PlexonEditor
GraphPad Prism 8GraphPad Software, Inc.Versão 8Software de análise estatística
neutro

Referências

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