O objetivo geral deste protocolo é fornecer instruções sobre como medir a capacidade dos anticorpos presentes no soro ou plasma de indivíduos, naturalmente expostos à infecção por Plasmodium falciparum, para opsonizar e induzir fagocitose dos eritrócitos infectados por parasitas (IEs).
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Artigo de método
Medindo anticorpos indutores de fagocitose naturalmente adquiridos para parasitas plasmodium falciparum por um ensaio baseado em citometria de fluxo
Neste artigo
Resumo
Resumo
O protocolo descreve como configurar e executar um ensaio de fagocitose baseado em citometria de fluxo de plasmodium falciparum-infectado eritrócitos (IEs) opsonizados por anticorpos IgG naturalmente adquiridos específicos para VAR2CSA. VAR2CSA é o antígeno parasita que media o sequestro seletivo de IEs na placenta que pode causar uma forma grave de malária em gestantes, chamada malária placentária (PM). A proteção contra PM é mediada por anticorpos específicos var2CSA que se acredita funcionar inibindo o sequestro placentário e/ou opssonizando IEs para fagocitose. O ensaio emprega IEs sincronizados em estágio final que foram selecionados in vitro para expressar VAR2CSA, plasma/soro-anticorpos de mulheres com imunidade específica de PM adquirida naturalmente, e a linha de células fagocíticas THP-1. No entanto, o protocolo pode ser facilmente modificado para avaliar a funcionalidade de anticorpos para qualquer antígeno parasita presente na superfície do IE, seja induzido pela exposição natural ou pela vacinação. O ensaio oferece avaliação simples e de alto rendimento, com boa reprodutibilidade, de um importante aspecto funcional da imunidade mediada por anticorpos na malária. É, portanto, útil na avaliação da imunidade clínica à malária P. falciparum, uma das principais causas de morbidade e mortalidade nos trópicos, particularmente na África subsaariana.
Introdução
A malária é uma doença transmitida por vetores causada em humanos após infecção com cinco espécies diferentes do gênero Plasmodium. A espécie mais prevalente é a P. falciparum,que também é responsável pela maior morbidade e mortalidade1. A apresentação clínica da malária varia de infecções assintomáticas ou benignas a doenças complicadas/graves, esta última ocorrendo principalmente em crianças menores de cinco anos. A exposição ao P. falciparum não induz imunidade estéril, mas indivíduos que vivem em áreas endêmicas lentamente desenvolvem imunidade contra a doença clínica. A proteção é dependente de idade/exposição e ....
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Protocolo
As amostras de soro humano utilizadas para os resultados aqui apresentados foram coletadas em estudo separado19. A coleta foi aprovada pelo Conselho de Revisão Institucional do Noguchi Memorial Institute for Medical Research, Universidade de Gana (estudo 038/10-11), e pelos Comitês Regionais de Ética em Pesquisa, Região capital da Dinamarca (protocolo H-4-2013-083).
1. Cultura de parasitas
NOTA: Siga as normas locais para o manuseio de patógenos humanos.
- Manter os parasitas de P. falciparum de acordo com o protocolo padrão descrito antesdos 20 ano....
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Resultados
Aqui apresentamos em detalhes um protocolo que já foi descrito31 e utilizado11,12,13,14,15,16,17,18 para medir a capacidade de anticorpos voltados para a superfície das IEs P. falciparum para induzir opsonização e fagocitose.......
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Discussão
O protocolo aqui apresentado foi previamente descrito e utilizado12,,15,17,31 para medir a capacidade dos anticorpos voltados para a superfície das IEs de P. falciparum para induzir opsonização e fagocitose pelas células THP-1. Os resultados aqui apresentados focam em anticorpos específicos VAR2CSA adquiridos naturalmente no plasma/soro de mulheres residentes em uma região endêmica
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Maiken Visti é grato por excelente assistência técnica. Este trabalho foi parcialmente financiado por uma subvenção (MAVARECA II; 17-02-KU) do Ministério das Relações Exteriores da Dinamarca e administrado pelo Danida Fellowship Centre. O financiador não teve papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placas de cultura de células de 96 poços, fundo redondo com tampa | Corning | 3799 | Qualquer placa semelhante pode ser usada, certifique-se de que é compatível com o instrumento de citômetro de fluxo que você pretende usar |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5%) | - | - | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0,2g/L hipoxantina (Sigma, H9377) em RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Glóbulos Anti-Vermelhos anticorpo | Abcam | ab34858 | Prepare 2μ l alíquotas e congelar a -20 graus. Use uma alíquota por experimento. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| Solução de brometo de etídio | Sigma | E1510 | Prepare uma solução estoque a 0,1 mg / mL em RPMI1640 (R5886). Armazenar protegido da luz |
| Citômetro de fluxo FC500 | Beckman Coulter | Qualquer citômetro de fluxo que suporte o formato de placa de 96 poços e tenha os lasers/filtros apropriados para medir a fluorescência EtBr pode ser usado. | |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | Gibco | 10099-141 | Inativar o calor antes de usar. |
| Camundongo FITC anti-humano CD16 | BD Biosciences | 555406 ou 556618 | |
| camundongo FITC anti-humano CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| camundongo FITC anti-humano CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
| software FlowLogic | Tecnologias | Qualquer análise de citometria de fluxo pode ser usada, por exemplo, FlowJo ou Winlist | |
| Gentamicina (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
| Hipoxantina | Sigma | H9377 | |
| L-glutamina (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Solução de lisinga | - | - | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
| MACS CS-coluna e acessórios | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| Meio de cultura de parasitas | - | - | 2mM L-glutamina (Sigma, G7513), 50µ g / mL de gentamicina (Sigma, G1272), 0,5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) em RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Penicilina / Estreptomicina (10000U e 10mg / mL) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640 meio | de cultura Sigma | R5886 | |
| THP-1 - | 10% FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamina (Sigma, G7513), 100U / mL de penicilina, 0,1mg / mL de estreptomicina (Sigma, P0781) em RPMI1640 (Sigma, R5886) | ||
| Ímã Vario MACS | Miltenyi Biotec |
Referências
- World Health Organization. World Malaria Report - 2018. World Health Organization. , (2018).
- Pierce, S. K., Miller, L. H. World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not. Journal of Immunology. 182 (9), 5....
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Reimpressões e permissões
