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Artigo de método

Isolamento de núcleos de tumores cerebrais congelados frescos para RNA-seq de núcleo único e ATAC-seq

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DOI:

10.3791/61542

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25 de agosto de 2020

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1Neurology Clinic and National Center for Tumor Diseases, University Hospital Heidelberg, 2Bioinformatics and Omics Data Analytics, German Cancer Research Center (DKFZ), 3Clinical Cooperation Unit Neurooncology, German Cancer Research Center (DKFZ), 4Division of Experimental Neurosurgery, Department of Neurosurgery, University of Heidelberg, INF 400, Heidelberg, Germany

Neste artigo

Resumo

A heterogeneidade intra-tumoral é uma característica inerente aos tumores, incluindo gliomas. Desenvolvemos um protocolo simples e eficiente que utiliza uma combinação de buffers e centrífugas gradientes para isolar núcleos únicos de tecidos glioma congelados frescos para estudos de sequenciamento de núcleo único RNA e ATAC.

Resumo

Gliomas difusos adultos apresentam heterogeneidade inter e intra-tumor. Até recentemente, a maioria dos esforços de perfil molecular em larga escala se concentraram em abordagens em massa que levaram à classificação molecular de tumores cerebrais. Nos últimos cinco anos, abordagens de sequenciamento de células únicas têm destacado várias características importantes dos gliomas. A maioria desses estudos tem utilizado amostras de tumores cerebrais frescos para isolar células únicas usando citometria de fluxo ou métodos de separação baseados em anticorpos. Seguindo em frente, o uso de amostras de tecido fresco congelados de biobancos fornecerá maior flexibilidade às aplicações de células únicas. Além disso, à medida que o campo unicelular avança, o próximo desafio será gerar dados multi-omics de uma única célula ou da mesma preparação amostral para desvendar melhor a complexidade tumoral. Portanto, protocolos simples e flexíveis que permitem a geração de dados para vários métodos, como sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq) e ensaio de núcleo único para Chromatina Transposase-Acessível com sequenciamento de alto throughput (snATAC-seq) serão importantes para o campo.

Os recentes avanços no campo de células únicas, juntamente com instrumentos microfluidos acessíveis, como a plataforma de genômica 10x, facilitaram aplicações de células únicas em laboratórios de pesquisa. Para estudar a heterogeneidade do tumor cerebral, desenvolvemos um protocolo aprimorado para o isolamento de núcleos únicos de gliomas congelados frescos. Este protocolo mescla protocolos de célula única existentes e combina uma etapa de homogeneização seguida de filtração e centrifugação de gradiente mediada por buffer. As amostras resultantes são suspensões de núcleos únicos puros que podem ser usadas para gerar dados de expressão genética de núcleo único e de acessibilidade de cromatina a partir da mesma preparação de núcleos.

Introdução

Gliomas de menor grau difuso (LGG), o tumor cerebral primário mais comum em adultos, são neoplasias infiltrativas que frequentemente surgem no hemisfério cerebral. Os LGGs apresentam heterogeneidade inter e intra-tumor, que não é apenas impulsionada pela população tumoral, mas também pelas células não malignas intrincadamente envolvidas no desenvolvimento e progressão do tumor1,2,3,4,5.

Na última década, houve uma avalanche de dados genômicos coletados no campo dos gliomas. Esses dados vêm principalmente de estudos de sequenciamento de tumores em massa e têm contribuído imensamente para a caracterização molecular, e a classificação atual dos tumores cerebrais5,6,7,8,9,10,11. No entanto, embora esses estudos tenham revelado a ampla paisagem molecular associada aos gliomas, ainda há uma decepcionante falta de progresso em relação à intervenção terapêutica. Um dos obstáculos à resistência ao tratamento em tumores cerebrais é a heterogeneidade intra-tumoral. Para abordar essa questão, vários estudos têm se concentrado na heterogenidade genômica, transcriômica, proteômica e epigenética presente dentro de um tumor em um único nível celular12,13,14,15,16,17.

Embora tenha havido notáveis avanços tecnológicos no campo de células únicas nos últimos dois anos, um dos principais fatores limitantes é a disponibilidade de espécimes frescos necessários para isolar as células e realizar esses experimentos. Para superar essa limitação, houve várias tentativas bem sucedidas de realizar ensaios, como snRNA-seq e snATAC-seq de tecidos congelados, utilizando núcleos em vez de células18,19. A maioria desses métodos depende tanto da classificação celular ativada por fluorescência (FACS) quanto das estratégias de filtragem. Tanto as abordagens de células únicas quanto de núcleos únicos têm seus pontos fortes e desvantagens. Abordagens unicelulares mantêm transcrições mitocondriais, que embora possam ser informativas, também podem reduzir a cobertura do transcriptome devido à sua alta abundância. Abordagens de isolamento de núcleos únicos eliminam uma alta porcentagem da fração mitocondrial, permitindo assim uma cobertura mais aprofundada das transcrições nucleares20.

Existem várias plataformas comercialmente disponíveis que têm sido usadas ao longo dos últimos anos para avaliar dados de genômica de células únicas, incluindo RNA-seq e ATAC-seq. Uma das plataformas mais proeminentes é a plataforma 10x Genomics Chromium para expressão genética de células únicas e perfil de célula única ATAC. Como a plataforma trabalha com a ajuda de câmaras microfluídicas, quaisquer detritos ou agregados podem entupir o sistema levando à perda de dados, reagentes e amostras clínicas valiosas. Portanto, o sucesso de estudos unicelulares depende em grande parte do isolamento preciso de células/núcleos únicos.

O protocolo que demonstraremos aqui é uma combinação ligeiramente modificada dos protocolos DroNc-seq e Omni-ATAC-seq, e utiliza uma abordagem semelhante aos estudos recentes que utilizam o snRNA-seq para entender distúrbios neurológicos e tipos de células neuronais no cérebro humano18,19,21,22,23,24. O protocolo utiliza uma combinação de dissociação enzimática/mecânica de amostras congeladas seguida de filtração e centrifugação gradiente e permite o isolamento rápido e preciso de núcleos únicos de tecidos glioma congelados frescos. Usamos com sucesso este protocolo para gerar dados snRNA-seq e snATAC-seq a partir da mesma preparação de núcleos de amostras de tumores cerebrais.

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Protocolo

Amostras de glioma congelado fresco foram obtidas do Banco Nacional de Doenças tumorais (NCT) em Heidelberg, Alemanha. O uso do material do paciente foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Faculdade de Medicina de Heidelberg, e o consentimento informado foi obtido de todos os pacientes incluídos no estudo.

1. Preparação experimental

  1. Realize todos os passos no gelo ou a 4 °C.
  2. Tubos pré-frio, pratos, lâminas de barbear, douncers e pilões a 4 °C.
  3. Prepare todos os buffers com antecedência. Estes tampões estão estáveis à temperatura ambiente. Recomenda-se filtragem estéril, especialmente para sacarose. Os preparos das ações são modificados a partir de Corces et al.19. Ver Tabelas 1-7.
  4. Remova amostras de nitrogênio líquido ou -80 °C de armazenamento congelador e mantenha em gelo seco até o passo 2.1.

2. Dissecção e dissociação de tecidos

  1. Transfira a amostra de tecido congelado fresco (10-60 mgs) para uma placa de Petri pré-refrigerada. Mince/chop tecido congelado fresco com uma lâmina de barbear em pequenos pedaços no gelo.
  2. Adicione 500 μL de tampão de lise de núcleos refrigerados a um tubo pré-refrigerado de 1,5 mL. Coloque os pedaços de tecido no tubo de 1,5 mL contendo o tampão de lise dos núcleos e transfira para um Douncer(Tabela de Materiais).
    NOTA: Existem dois pilões homogeneizadores do Dounce: pilão "solto" ou "A" para redução inicial da amostra e pilão "apertado" ou "B" para homogeneização completa da amostra.
  3. Dounce as peças teciduais com o pilão "solto" por cerca de 20 golpes, até que o atrito seja reduzido. Se os detritos estiver presente, a amostra pode ser pré-limpa por filtragem com um coador de 100 mm.
  4. Dounce com o pilão "apertado" para 20 golpes para alcançar a homogeneização completa do tecido.
  5. Transfira o homogeneato (cerca de 500 μL) para um tubo pré-refrigerado de 2 mL. Adicione 1 mL de tampão de lise resfriado. Misture delicadamente e incubar no gelo por 5 minutos. Misture delicadamente com uma ponta de pipeta larga e repita 1-2 vezes durante a incubação.
  6. Filtre toda a homogeneidade usando uma malha de coador de 30 μm, colecione em um tubo Falcon de 15 mL e transfira de volta para um novo tubo pré-refrigerado de 2 mL. Um único coador é tipicamente suficiente para todo o homogeneizar.
  7. Verifique sob um microscópio de luz para verificar a remoção de grandes detritos e a intactidade da membrana nuclear. Os núcleos precisam ser redondos e a membrana nuclear não deve ser distorcida. Se os detritos estiverem presentes, os núcleos podem ser refilfilfil filtrados.
  8. Centrifugar os núcleos a 500 x g por 5 min a 4 °C em uma centrífuga superior de banco. Remova o supernatante, deixando para trás ~50 μL com pelota contendo os núcleos. Levemente resuspenque a pelota em mais 1 mL de tampão de lise nuclei e incubar por 5 minutos no gelo.
  9. Centrifugar os núcleos a 500 x g por 5 min a 4°C. Retire o supernasce sem perturbar a pelota, adicione 500 mL de tampão de homogeneização de 1x (HB)(Tabela 4) e incubar por 5 minutos sem resususcupação. Em seguida, resuspense os núcleos em outros 1,0 mL de HB 1x.
  10. Centrifugar os núcleos a 500 x g por 5 min a 4 °C. Remova o supernasal e retire suavemente os núcleos em 200 μL de 1x HB em um novo tubo de 2,0 mL.

3. Centrifugação gradiente

  1. Adicione 200 μL de solução iodixanol de 50%(Tabela 5) para dar uma concentração final de 25% de iodixanol. Misture bem 10 vezes com pipeta em 300 mL.
  2. Adicione 300 μL de solução iodixanol de 29%(Tabela 6) sob a mistura de 25%. Use uma ponta fina P1000 para evitar a mistura das camadas.
  3. Adicione 300 μl de solução de Iodixanol de 35%(Tabela 7) sob a mistura de 29%. Use uma ponta fina P1000 para evitar a mistura das camadas.
    Atenção: Esta etapa requer a remoção gradual da ponta da pipeta durante a pipetação para evitar o deslocamento excessivo do volume.
  4. Coloque as amostras em uma centrífuga de balde balançando, gire por 20 min a 3.500 x g a 4°C com o freio desligado.
  5. Remova suavemente as amostras sem tremer e observe sob a luz. Uma faixa branca clara de 95% de núcleos puros deve ser visível entre a segunda e a terceira camada(Figura 1).

4. Isolamento dos núcleos

  1. Aspire as camadas superiores até a faixa de núcleos brancos na interfase de 29%-35%.
  2. Colete a banda de núcleos em um volume de 200 mL, transfira para um tubo fresco e filtro com um filtro de 20 μm(Tabela de Materiais).
    NOTA: Os núcleos não precisam ser resuspendidos antes da filtragem.
  3. Verifique sob um microscópio de luz para verificar a remoção de grandes detritos e a intactidade da membrana nuclear. Os núcleos precisam ser redondos e a membrana nuclear não deve ser distorcida.
  4. Conte núcleos usando manchas azuis trypan em um hemócitometro e núcleos de alíquota para snRNA-seq/snATAC-seq.

5. Núcleos únicos RNA e ATAC seq

  1. Processe imediatamente os núcleos utilizando a expressão genética de célula única e os kits de reagente ATAC de célula única(Tabela de Materiais).
    NOTA: As concentrações de amostra de núcleos para o sistema de genômica 10x são 1500-3000 núcleos por μL para snRNA-seq, e 3500-7000 núcleos por m μL para snATAC-seq. Os núcleos podem ser diluídos usando 1x PBS.
  2. Sequencie as bibliotecas resultantes no Centro de Genômica.
  3. Realize a análise de controle de qualidade dos dados. Os núcleos são incluídos para análise suplementar se eles contêm Identificador Molecular Único (UMI) >1000, número de genes >500 e por cento dos genes mitocondriais <5%, e estão dentro da média + três desvios padrão dos UMIs e genes.

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Resultados

Genômica de núcleo único é um campo em evolução com dados e protocolos limitados. Um fator crítico que influencia o resultado de ensaios de núcleos únicos é o isolamento de núcleos puros e intactos. Combinamos dois protocolos publicados (protocolos DroNc-seq e Omni-ATAC-seq) para isolar núcleos de alta qualidade e puros de blocos de tecido glioma congelados frescos em um tempo relativamente curto, mantendo assim a estabilidade das transcrições(Figura 1).

O uso de ...

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Discussão

O campo da heterogeneidade intra-tumoral está em uma fase emocionante, com novos ensaios e plataformas sendo desenvolvidos para desafiar e expandir o conhecimento existente. A heterogeneidade intra-tumoral é um fator crucial que contribui para a progressão da doença e resistência às modalidades atuais de tratamento em gliomas28. Estudos recentes sobre tumores cerebrais têm focado nesse importante aspecto usando ensaios transcriômicos e epigenômicos de células únicas para melhor caracterizar a hete...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Laboratório Aberto de Células Únicas (scOpenLab) do Centro Alemão de Câncer (DKFZ) por discussões úteis. Esta pesquisa foi apoiada pelo German Cancer Aid, Max-Eder Program grant number 70111964 (S.T.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2-MercaptoethanolSigmaM6250
CaCl2Sigma21115-100ML
Dounce HomogeneizadorMotivo ativo40401
EDTA (0.5 M)Thermo ScientificR1021
Falcon 15 mL Tubos de Centrífuga CônicosFisher Scientific352096
Iodixanol (também conhecido como Optiprep)Stem cell technologies07820
MACs Smart Strainers (30 µ m)Miltenyi Biotec130-098-458
MACS SmartStrainers (100 µ m)Miltenyi Biotec130-098-463
Mg(Ac)2Sigma63052-100ML
NP-40Abcamab142227
Kit de Isolamento de Núcleos: FiltrosSigmaNUC101-1KT
Fluoreto de Fenilmetanossulfonil (PMSF)SigmaP7626
(20 µ m)Miltenyi Biotec130-101-812
Tubos de trava segura 1,5 mLEppendorf0030120086
Tubos de trava segura 2,0 mLEppendorf0030120094
Single Cell ATAC10x Genômica
Expressão Gênica de Célula Única10x Genômica
SacaroseSigmaS0389
Pontas de pipeta de diâmetro largo (1000 µ L)Themo Fisher Scientific2079GPK
Pontas de pipeta de diâmetro largo (200 µ L)Themo Fisher Científico2069GPK
de Pré-Separação

Referências

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