Isolamento de núcleos de tumores cerebrais congelados frescos para RNA-seq de núcleo único e ATAC-seq

Resumo

A heterogeneidade intra-tumoral é uma característica inerente aos tumores, incluindo gliomas. Desenvolvemos um protocolo simples e eficiente que utiliza uma combinação de buffers e centrífugas gradientes para isolar núcleos únicos de tecidos glioma congelados frescos para estudos de sequenciamento de núcleo único RNA e ATAC.

Resumo

Gliomas difusos adultos apresentam heterogeneidade inter e intra-tumor. Até recentemente, a maioria dos esforços de perfil molecular em larga escala se concentraram em abordagens em massa que levaram à classificação molecular de tumores cerebrais. Nos últimos cinco anos, abordagens de sequenciamento de células únicas têm destacado várias características importantes dos gliomas. A maioria desses estudos tem utilizado amostras de tumores cerebrais frescos para isolar células únicas usando citometria de fluxo ou métodos de separação baseados em anticorpos. Seguindo em frente, o uso de amostras de tecido fresco congelados de biobancos fornecerá maior flexibilidade às aplicações de células únicas. Além disso, à medida que o campo unicelular avança, o próximo desafio será gerar dados multi-omics de uma única célula ou da mesma preparação amostral para desvendar melhor a complexidade tumoral. Portanto, protocolos simples e flexíveis que permitem a geração de dados para vários métodos, como sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq) e ensaio de núcleo único para Chromatina Transposase-Acessível com sequenciamento de alto throughput (snATAC-seq) serão importantes para o campo.

Os recentes avanços no campo de células únicas, juntamente com instrumentos microfluidos acessíveis, como a plataforma de genômica 10x, facilitaram aplicações de células únicas em laboratórios de pesquisa. Para estudar a heterogeneidade do tumor cerebral, desenvolvemos um protocolo aprimorado para o isolamento de núcleos únicos de gliomas congelados frescos. Este protocolo mescla protocolos de célula única existentes e combina uma etapa de homogeneização seguida de filtração e centrifugação de gradiente mediada por buffer. As amostras resultantes são suspensões de núcleos únicos puros que podem ser usadas para gerar dados de expressão genética de núcleo único e de acessibilidade de cromatina a partir da mesma preparação de núcleos.

Introdução

Gliomas de menor grau difuso (LGG), o tumor cerebral primário mais comum em adultos, são neoplasias infiltrativas que frequentemente surgem no hemisfério cerebral. Os LGGs apresentam heterogeneidade inter e intra-tumor, que não é apenas impulsionada pela população tumoral, mas também pelas células não malignas intrincadamente envolvidas no desenvolvimento e progressão do tumor^1,2,3,4,5.

Na última década, houve uma avalanche de dados genômicos coletados no campo dos gliomas. Esses....

Protocolo

Amostras de glioma congelado fresco foram obtidas do Banco Nacional de Doenças tumorais (NCT) em Heidelberg, Alemanha. O uso do material do paciente foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Faculdade de Medicina de Heidelberg, e o consentimento informado foi obtido de todos os pacientes incluídos no estudo.

1. Preparação experimental

1. Realize todos os passos no gelo ou a 4 °C.
2. Tubos pré-frio, pratos, lâminas de barbear, douncers e pilões a 4 °C.
3. Prepare todos os buffers com antecedência. Estes tampões estão estáveis à temperatura ambiente. Recomenda-se filtragem estéril, especialmente para sacarose....

Resultados

Genômica de núcleo único é um campo em evolução com dados e protocolos limitados. Um fator crítico que influencia o resultado de ensaios de núcleos únicos é o isolamento de núcleos puros e intactos. Combinamos dois protocolos publicados (protocolos DroNc-seq e Omni-ATAC-seq) para isolar núcleos de alta qualidade e puros de blocos de tecido glioma congelados frescos em um tempo relativamente curto, mantendo assim a estabilidade das transcrições(Figura 1).

O uso de .......

Discussão

O campo da heterogeneidade intra-tumoral está em uma fase emocionante, com novos ensaios e plataformas sendo desenvolvidos para desafiar e expandir o conhecimento existente. A heterogeneidade intra-tumoral é um fator crucial que contribui para a progressão da doença e resistência às modalidades atuais de tratamento em gliomas²⁸. Estudos recentes sobre tumores cerebrais têm focado nesse importante aspecto usando ensaios transcriômicos e epigenômicos de células únicas para melhor caracterizar a hete.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-Mercaptoethanol	Sigma	M6250
CaCl2	Sigma	21115-100ML
Dounce Homogeneizador	Motivo ativo	40401
EDTA (0.5 M)	Thermo Scientific	R1021
Falcon 15 mL Tubos de Centrífuga Cônicos	Fisher Scientific	352096
Iodixanol (também conhecido como Optiprep)	Stem cell technologies	07820
MACs Smart Strainers (30 µ m)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS SmartStrainers (100 µ m)	Miltenyi Biotec	130-098-463
Mg(Ac)2	Sigma	63052-100ML
NP-40	Abcam	ab142227
Kit de Isolamento de Núcleos: Filtros	Sigma	NUC101-1KT
Fluoreto de Fenilmetanossulfonil (PMSF)	Sigma	P7626
(20 µ m)	Miltenyi Biotec	130-101-812
Tubos de trava segura 1,5 mL	Eppendorf	0030120086
Tubos de trava segura 2,0 mL	Eppendorf	0030120094
Single Cell ATAC	10x Genômica
Expressão Gênica de Célula Única	10x Genômica
Sacarose	Sigma	S0389
Pontas de pipeta de diâmetro largo (1000 µ L)	Themo Fisher Scientific	2079GPK
Pontas de pipeta de diâmetro largo (200 µ L)	Themo Fisher Científico	2069GPK

de Pré-Separação