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Artigo de método

Taurocholate de sódio induziu pancreatite aguda grave em C57BL/6 camundongos

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DOI:

10.3791/61547

⸱

28 de junho de 2021

 ,  ,  ,  , 
1Discipline of Clinical Emergencies, Department of Clinical Medicine, HCFMUSP / LIM 51, University of São Paulo Medical School

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Modelos animais para pancreatite aguda grave permitem o estudo de alterações fisiodicosiológicas no estágio inicial, facilitando a observação da evolução dos eventos inflamatórios. Aqui fornecemos um protocolo para a indução de pancreatite biliar aguda grave por infusão retrógrada de taurocholate de sódio no ducto pancreático de camundongos C57BL/6 anestesiados.

Resumo

A indução de pancreatite aguda biliar por infusão de taurocoolato de sódio tem sido amplamente utilizada pela comunidade científica devido à representação da condição clínica humana e à reprodução de eventos inflamatórios correspondentes ao aparecimento de pancreatite biliar clínica. A gravidade dos danos pancreáticos pode ser avaliada medindo a concentração, velocidade e volume do ácido biliar infundido. Este estudo fornece uma lista atualizada dos materiais e métodos utilizados na reprodução do protocolo e mostra os principais resultados deste modelo de pancreatite aguda (AP). A maioria das publicações anteriores limitou-se a reproduzir esse modelo em ratos. Aplicamos esse método em camundongos, o que proporciona vantagens adicionais (ou seja, a disponibilidade de um arsenal de reagentes e anticorpos para esses animais, juntamente com a possibilidade de trabalhar com cepas geneticamente modificadas de camundongos) que podem ser relevantes para o estudo. Para indução aguda de pancreatite em camundongos, apresentamos um protocolo sistemático, com uma dose definida de 2,5% de taurocolato de sódio a uma velocidade de infusão de 10 μL/min por 3 min em camundongos C57BL/6 que atinge seu nível máximo de gravidade dentro de 12 h de indução e destacam resultados com resultados que validam o método. Com a prática e a técnica, o tempo total estimado, desde a indução da anestesia até a conclusão da infusão, é de 25 minutos por animal.

Introdução

Em humanos, a presença de cálculos biliares é a causa mais comum de pancreatite devido à obstrução da porção terminal do choledochal, interrompendo o fluxo de secreções pancreáticas e causando um intenso processo inflamatório no pâncreas, com aumento da concentração de enzimas digestivas no soro e mediadores inflamatórios1,2.

Duas teorias diferentes foram propostas para explicar o desenvolvimento de pancreatite aguda (AP). A teoria do "canal comum" sugere que as pedras presentes na vesícula biliar obstruem o sistema de ducto biliar comum distal, permitindo que a secreção biliar flua retrógrada para o ducto pancreático. A segunda teoria (a teoria da "obstrução do ducto") sugere que a obstrução do ducto pancreático por excesso de cálculos biliares causa um bloqueio no fluxo de secreção pancreática para o duodeno, causando hipertensão ductal3. Embora os mecanismos que levam à pancreatite biliar aguda não sejam totalmente compreendidos, o resultado é um processo inflamatório intenso. Erupção de enzima digestiva e auto-digestão do pâncreas levam a alterações histopatológicas, aumento de citocinas inflamatórias (IL-1β, IL-6, TNF-α) em fluido ascético e soro, e aumento de proteínas de fase aguda4,5,6.

A pancreatite aguda grave é uma condição que merece atenção clínica devido ao envolvimento de múltiplos órgãos e a um alto risco de mortalidade. Modelos animais para a reprodução de pancreatite aguda (AP) são importantes, pois explicam os mecanismos fisiodicosiológicos da doença e ajudam no acompanhamento da evolução dos eventos inflamatórios, a partir dos estágios iniciais da doença. Isso geralmente não é possível nas clínicas2,7. Além disso, o acesso a tecidos pancreáticos é fácil em estudos pré-clínicos, favorecendo a elucidação de alterações ligadas às condições clínicas8, juntamente com a possibilidade de trabalhar com espécies isogênicas, eliminando variáveis indesejáveis e espelhando a semelhança clínica com os desfechos observados na condição humana9.

Modelos biliares e não biliares para a indução de pancreatite aguda em espécies de ratos e camundongos têm sido frequentemente estudados na literatura científica. Os métodos não biliares de indução incluem a administração de doses estimulantes supramaximais da colecistocina secretagogue ou sua cerulein analógica10; administração de doses quase letais de L-arginina; ou administração de uma dieta deficiente de colina suplementada com ethionine11. Embora esses métodos sejam fáceis de reproduzir e resultem em inflamação pancreática, eles não replicam os mecanismos que, em teoria, desencadeiam AP (ou seja, o refluxo da secreção bile no ducto pancreático). A técnica que aborda o modelo biliar baseia-se na infusão retrógrada de ácidos biliares no ducto pancreático e requer pesquisadores bem treinados para realizar este protocolo. Vários estudos foram publicados utilizando esse método em ratos (aparentemente por razões técnicas, uma vez que esses experimentos envolvem procedimentos cirúrgicos)12,13. No entanto, a abordagem em camundongos pode oferecer resultados mais interessantes no estudo da inflamação3,14,15. Neste estudo, mostraremos uma lista dos passos a serem seguidos para a reprodução de pancreatite aguda grave por infusão de taurocolato de sódio em camundongos anestocás C57BL/6.

Para trabalhos que envolvem a necessidade de experimentos com anticorpos e análise da expressão genética e proteica, o uso de camundongos é preferível devido ao maior arsenal de materiais para esses animais e à possibilidade de trabalhar com espécies isogênicas e eliminatórias, entre outras que podem ser utilizadas relevantes para estudos16. Camundongos C57BL/6 é uma variedade de camundongos originalmente desenvolvida para o estudo da atividade antitumoral e imunologia. Essa cepa está cada vez mais sendo preferida pelos pesquisadores por ser isogênica, permitindo uma maior reprodutibilidade de resultados, o que pode implicar o uso de um número menor de animais em um experimento e menor variabilidade dos resultados entre o mesmo grupo17,18.

Perides et al. (2010)14 publicaram um protocolo para indução de AP em camundongos por infusão de taurochoola de sódio. Aqui atualizamos este modelo utilizando uma maior concentração de taurocholate de sódio (2,5%) em camundongos C57BL/6, com volume e velocidade definidos de infusão (Figura 1). O nível máximo de gravidade é alcançado dentro de 12 h de indução em camundongos. A elevação da concentração de IL-6 tanto no soro quanto na cavidade peritoneal está correlacionada com a progressão da AP. Com a prática, o tempo total estimado desde a indução da anestesia até a conclusão da infusão, é de 25 minutos por animal. É essencial que um pesquisador treinado conduza esse experimento. Para garantir que a solução seja injetada corretamente no ducto biliar comum, realize várias sessões de treinamento piloto usando azul de metileno em vez de taurocolato de sódio.

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Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética para o uso de animais da Faculdade de Medicina da USP, Num. Projeto: 1343/2019-CEUA: FMUSP. Para este protocolo, foram utilizados camundongos C57BL/6, com idade de 6 semanas, pesando 20 ± 2 g (n = 9/grupo).

1. Laparotomia

  1. Anestesize animais com xilazina (10 mg/kg) e solução de cetamina (80 mg/kg), subcutânea (0,1 mL/10g de peso corporal) utilizando uma seringa de 1 mL e agulha de 13x0,45mm 26G 1/2. Verifique se há profundidade de anestesia suficiente beliscando o dedo do dedo do sol. Controle a temperatura do corpo usando almofadas aquecidas. Certifique-se de que todos os materiais cirúrgicos são estéreis.
  2. Limpe a área abdominal com 5% de solução de povidona-iodo e use um aparador para remover o cabelo entre o peito e o abdômen inferior (aproximadamente 2 cm2). Limpe a área cirúrgica com 70% de álcool.
  3. Imobilize o animal no tabuleiro cirúrgico usando fita cirúrgica. Use uma tesoura para cortar 5 mm da pele horizontalmente, na parte superior do abdômen e 1 cm abaixo do processo xifoide. Repita o corte no peritônio. Isso resultará em uma laparotomia com exposição mínima da cavidade.

2. Localizar e expor o pâncreas

  1. Com o auxílio de um retrátil, puxe o fígado em direção à cabeça do rato, ~1 cm do intestino.
  2. Localize a região do pâncreas que será injetada com taurocholate de sódio (cabeça de pâncreas). Localize o duodeno com referência ao fígado abaixo do fígado, no lado direito (à esquerda como o rato é visto). O duodeno é a primeira parte do intestino delgado e está ligado à parte final do estômago.
  3. Com o auxílio de fórceps, levante o fígado em direção à cabeça do animal, e puxe suavemente a porção do intestino delgado. Fixar as duas extremidades laterais do intestino delgado com uma sutura de polipropileno 6-0 para melhor visualizar a porção distal do ducto biliar comum.

3. Indução grave de pancreatite aguda

  1. Oclui temporariamente o ducto biliar comum proximal com um clipe de microvessel para evitar que a infusão retrógrada vaze no fígado. O ducto biliar comum pode ser visto no lado do fígado do duodeno e sua junção com o duodeno aparecerá branca. Expor o órgão da cavidade abdominal.
  2. Puna a região periampulária (parte esbranquiçada da parede do intestino delgado) para acessar o ducto biliar comum com uma agulha de 0,4 mm conectada a um tubo de polietileno de 0,54 mm.
  3. Faça uma oclusão temporária do ducto biliar comum distal com 8-0 sutura para evitar que a solução de taurocholate de sódio vaze para o duodeno.
  4. Inicie a bomba de infusão e programe uma solução de taurocholate de sódio de 2,5% (diluída em 0,9% de soro fisiológico) a uma velocidade constante de 10 μL/10 g de peso corporal por 3 min.
  5. Após a infusão, remova o clipe de microvessel, o 8-0 temporário sutura, e a agulha de injeção do ducto pancreático bile para reconstituir o fluxo fisiológico da bile.
  6. No final, sutura o abdômen com 6-0 monofilament monofilament polipropilente sutura. O tempo entre a laparotomia e a sutura final deve ser de no máximo 30 min (ver Figura 1).
  7. Após a cirurgia, abriga os animais em caixas de polietileno forradas com aparas de madeira e água e ad libitum alimentar.
  8. Trate os camundongos de controle da mesma forma que os camundongos experimentais, mas certifique-se de que o infusor consiste apenas em soro fisiológico. Realizar o procedimento cirúrgico e a infusão de solução salina (10 mL/min, por 3 min) em um grupo controle (SHAM) para eliminar o viés inflamatório causado pela cirurgia e cannulação.
  9. Use tramadol 12,5 mg/kg subcutâneamente a cada 8 horas, começando após a recuperação pós-cirúrgica.

4. Métodos para análise

  1. Às 12h após a indução de AP, anestesia os animais com xilazina (10 mg/kg) e cetamina (80 mg/kg) para coletar aproximadamente 250 μL de sangue através do plexo orbital.
    1. Segure suavemente a pele nas costas, promovendo uma leve saliência do globo ocular, e posicione-a com o olho voltado para cima.
    2. Incutir um gota de pomada ocular contendo anestésico local no olho do animal.
    3. Posicione a extremidade do tubo capilar no canto medial do olho e insira-o suavemente sob o globo ocular, com um ângulo de ~30°-45°. Gire o tubo capilar até que o fluxo sanguíneo comece. Lembre-se que não é necessário usar a força para o procedimento.
    4. Uma vez que a coleção acabou, certifique-se de homeostase mantendo as pálpebras fechadas por compressão leve com a gaze. Descarte o tubo capilar no recipiente sharps19.
    5. Centrifugar o soro (700 x g, 15 min) e estocar o supernatante para dosagem de amilase e IL-6 (passo 4.7 e 4,8).
  2. Eutanize camundongos por asfixia de CO2 .
  3. Use uma agulha de 27 G para injetar 4 mL de 1x PBS gelado na cavidade peritoneal. Erram a pele abdominal e garantem que a agulha seja empurrada lentamente no peritônio para não perfurar nenhum órgão. Após a injeção, massageie suavemente o peritônio por 10 s para remover as células aderidas ao peritônio.
  4. Usando tesouras e pinças, faça um pequeno corte (0,5 cm) na pele interna e musculatura para expor a cavidade abdominal. Insira uma pipeta de lâmpada no peritônio e colete o fluido. Tenha cuidado para não aspirar tecido gorduroso ou outros órgãos.
  5. Colete o máximo de fluido possível e deposite a suspensão celular coletada em tubos mantidos no gelo. Descarte a pipeta da lâmpada no recipiente sharps20. Centrifugar o fluido peritoneal (250 x g, 5 min) e estocar o supernacido para dosagem IL-6 (passo 4.9).
  6. Recolher a região do pâncreas adjacente ao duodeno (<5mm).
  7. Processe o pâncreas fixando em 10% de formalina e incorpore-o em parafina.
    1. Manche os slides com hematoxilina e eosina para análises histopatológicas sob microscopia leve. Use o protocolo de Schmidt21 (edema pancreático, célula acinar, lesão/necrose, inflamação pancreática) para avaliar a extensão da AP.
  8. Medir amilase (U/dL) usando kits disponíveis comercialmente de acordo com as recomendações do fabricante.
  9. Medir os ensaios IL-6 da Luminex utilizando kits comerciais de acordo com as recomendações do fabricante.
  10. Armazene o supernanato de fluido peritônio e sérico obtido nas etapas 4.1 e 4.4 em um congelador a -80 °C, se necessário.

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Resultados

A gravidade da pancreatite foi pontuada entre 0-3 de acordo com a escala de Schmidt21 , onde zero corresponde à ausência, 1 corresponde a uma presença leve (<25%), 2 corresponde a uma presença moderada (entre 25 e 50%) e 3 corresponde a uma presença intensa (> 50%) (Tabela 1). As medidas realizadas foram atividade de amilase plasmática, edema pancreático, célula acinar, lesão/necrose, inflamação pancreática (por análise histologia de seções m...

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Discussão

O método de indução de pancreatite aguda por infusão de taurocholate de sódio retrógrado já foi mostrado em ratos22,23,24. Três trabalhos semelhantes, publicados em 2008, 2010 e 2015, serviram de referência para o protocolo3,14,15. Neste trabalho, listamos todas as etapas críticas para a reprodução deste método em camundongos C57BL/6 e ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Universidade de São Paulo; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agulha de 0,4 mmINTRAG MEDICAL TECH30G
  Tubo de polietileno de 0,54 mmTygon730010-Blocode
isopor---
adesiva para montagem do mouseMissner1236-Bomba
de infusão programada para 10µ L / min.Bomba Peristáltica Havard aparatus SérieMA1 55-7766  Modelo 66 Tesoura
pequena Iodo antisséptico Pfizer12086ORanti-sepsia
70% etanolSIGMA459836Misture 700 mL 100% etanol com 300 mL dH2O Lâmina de
barbearLordbdk9a1ghk6Para tricotomia
Taurocolato de sódioSigma-Aldrich86339- 1GNÚMERO CAS- 345909-26-4
clipe de microvasoMedicon Surgical56.87.35Aproximador, abertura 4,0 mm, pressão de fechamento 30 -  40 g
6-0 proleneBioline5162Linha de sutura
Ketamin NP (cloridrato de dextrocetamina) 50mg/mLCristá lia
Xilazine 2%Syntec
Solução salina estéril (0,9% (peso/vol) salina)Farmace105851
Methyl BlueSigma-Aldrich ChemicalsM5528
MILLIPLEX  MAPA Painel de esferas magnéticas de citocinas/quimiocinas de camundongo - Ensaio multiplex de imunologiaMERCKMCYTOMAG-70KAnalise simultaneamente vários biomarcadores de citocinas e quimiocinas com ensaios multiplex baseados em esferas usando a tecnologia Luminex, em amostras de soro de camundongo, plasma e cultura de células.
Ensaio de amilaseLabtest11
Desmarres afastador 13-mm
largura		ROBOZRS-6672
90183210 fita e pinça peristáltica

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