Após a infecção viral, o rim abriga um número relativamente grande de células CD8+ T e oferece uma oportunidade de estudar células TRM não mucosas. Aqui, descrevemos um protocolo para isolar linfócitos renais de camundongos para análise de citometria de fluxo.
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Artigo de método
Isolamento das células CD8+ T residentes em rim do rato para análise de citometria de fluxo
Neste artigo
Resumo
Resumo
A célula T dememória residente em tecido é um campo de pesquisa de imunologia em rápida expansão. Isolar células T de vários tecidos não linfoides é um dos passos fundamentais para investigar TRMs. Há pequenas variações nos protocolos de isolamento de linfócitos para diferentes órgãos. O rim é um órgão não linfoide essencial com numerosa infiltração de células imunes especialmente após a exposição ao patógeno ou ativação autoimune. Nos últimos anos, vários laboratórios, incluindo o nosso, começaram a caracterizar células CD8+ T residentes nos rins em vários ambientes fisiológicos e patológicos tanto em camundongos quanto em humanos. Devido à abundância de linfócitos T, o rim representa um órgão modelo atraente para estudar TRMsem tecidos não mucosas ou não-barreiras. Aqui, descreveremos um protocolo comumente usado em laboratórios focados em TRMpara isolar células CD8+ T de rins de camundongos após infecção viral sistêmica. Brevemente, utilizando um modelo de infecção por coriomeningite linfocítica aguda (LCMV) em camundongos C57BL/6, demonstramos rotulagem intravascular de células CD8+ T, digestão enzimática e centrífuga de gradiente de densidade para isolar e enriquecer linfócitos de rins de camundongos para preparar amostras para a análise de citometria de fluxo subsequente.
Introdução
As células T de memória residente de tecido (TRM) representam uma das populações de células T mais abundantes em camundongos humanos adultos e infectados. As célulasT RM fornecem a primeira linha de defesa imunológica e estão criticamente envolvidas em diversos processos fisiológicos e patológicos1,2,3,4,5. Comparando com as células T circulantes, as células TRM carregam marcadores de superfície distintos com programas de transcrição únicos6,
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Protocolo
Todos os experimentos em animais realizados após este protocolo devem ser aprovados pelo respectivo Comitê institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC). Todos os procedimentos descritos aqui foram aprovados pela IACUC UT Health San Antonio.
1. Transferência adotiva de células P14 T para receptores C57BL/6 e infecção por LCMV
- Use ratos P14 com 6-12 semanas de idade. Certifique-se de que o sexo do doador P14 TCR transgênico do mouse deve coincidir com o sexo de camundongos receptores C57BL/6. Caso contrário, células como células T machos que se transferem para camundongos fêmeas resultarão em rejeição imuno-mediada de células ....
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Resultados
O protocolo descrito aqui é resumido em um fluxograma(Figura 1A). No dia 30 pós infecção por LCMV, realizamos rotulagem intravascular de células CD8+ T. 5 minutos depois, ambos os rins do animal foram dissecados, picados e submetidos à digestão da colagemnase. Os linfócitos foram purificados ainda mais das amostras digeridas via centrífuga percoll e analisados por citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 1B, mesmo após o enriquecimento de linfócit.......
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Discussão
Como a imunidade específica do tecido é uma área de pesquisa em rápida expansão, evidências acumuladas sugerem que as células imunes, especialmente a população de linfócitos, podem ser identificadas em quase todos os órgãos em camundongos adultos humanos ou infectados ou imunizados. O modelo de infecção por camundongos LCMV é um modelo bem estabelecido para estudar a resposta celular T específica do antígeno, a diferenciação de células T e a diferenciação de células T, incluindo a biologia TRM em vários tecido.......
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Divulgações
Os autores não têm divulgações financeiras relevantes.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado pelas bolsas NIH AI125701 e AI139721, o programa CLIP do Cancer Research Institute e a American Cancer Society concedem RSG-18-222-01-LIB à N.Z. Agradecemos a Karla Gorena e Sebastian Montagnino da Instalação de Citometria de Fluxo. Os dados gerados no Flow Cytometry Shared Resource Facility foram apoiados pelo Centro de Ciência da Saúde da Universidade do Texas em San Antonio (UTHSCSA), NIH/NCI grant P30 CA054174-20 (Clinical and Translational Research Center (CTRC) na UTHSCSA) e UL1 TR001120 (Clinical and Translational Science Award).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| Tubos cônicos de 15 ml | Corning | 431470 | |
| Seringa de 3 ml | BD | 309657 | |
| 37C incubadora | VWR | ||
| Biotina a-CD8a anticorpo (Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Soro de bezerro | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
| Pipetas de Transferência Graduada Descartáveis | |||
| BD | 329424 | ||
| Tesoura de Mola Micro Dissecante | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Kit de isolamento de células T ve | Biolegend | 480043 | |
| lâmpada de calor suspensa | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Mouse de latão maciço Concentrador | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Balde Oscilante Centrífuga com geladeira | Thermofisher | ||
| Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |
Referências
- Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence. Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).
- Mueller, S. N., Mackay, L. K. Tissue-resident memory T cells: local specialis....
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Reimpressões e permissões
