Diferenciação de monócitos em macrófagos fenotipicamente distintos após o tratamento com células-tronco do sangue do cordão humano (CB-SC)-Exósmos derivados

Wei Hu; Xiang Song; Haibo Yu; Jingyu Sun; Yong Zhao

doi:10.3791/61562

Artigo de método

Diferenciação de monócitos em macrófagos fenotipicamente distintos após o tratamento com células-tronco do sangue do cordão humano (CB-SC)-Exósmos derivados

DOI:

10.3791/61562

⸱

12 de novembro de 2020

Wei Hu¹^,² , Xiang Song¹ , Haibo Yu¹ , Jingyu Sun² , Yong Zhao¹

¹Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health Center, ²Department of Chemistry and Chemistry Biology, Stevens Institute of Technology

Neste artigo

Resumo

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A aplicação de exosomo é uma ferramenta emergente para o desenvolvimento de medicamentos e medicina regenerativa. Estabelecemos um protocolo de isolamento exossomo com alta pureza para isolar exosóis de células-tronco identificadas chamadas CB-SC para estudos mecanicistas. Também cocultura cb-SC-derivado exosósmos com monócitos humanos, levando à sua diferenciação em macrófagos fenotipicamente distintos.

Resumo

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A terapia com células-tronco (SCE) é uma nova abordagem clínica para o tratamento de diabetes tipo 1 e outras doenças autoimunes. A terapia de CIP circula as células mononucleares sanguíneas isoladas do paciente (por exemplo, linfócitos e monócitos) através de uma máquina de aferese, co-culturas as células mononucleares sanguíneas do paciente com células-tronco derivadas do sangue do cordão aderente (CB-SC) no dispositivo SCE e, em seguida, devolve essas células imunes "educadas" ao sangue do paciente. Exosóis são vesículas extracelulares de tamanho nano-tamanho entre 30\u2012150 nm existentes em todos os meios de cultura biofluida e celular. Para explorar ainda mais os mecanismos moleculares subjacentes à terapia SCE e determinar as ações de exosóis liberados do CB-SC, investigamos quais células fagocitizam esses exosóis durante o tratamento com CB-SC. Ao co-culturar exosóis derivados do CB-SC com células mononucleares de sangue periféricos (PBMC), descobrimos que exosóis derivados do CB-SC foram predominantemente tomados por monócitos humanos CD14-positivos, levando à diferenciação de monócitos em macrófagos tipo 2 (M2), com morfologia semelhante ao fuso e expressão de marcadores moleculares de superfície associados a M2. Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento e caracterização de exosóis derivados do CB-SC e o protocolo para a co-cultura de exosóis derivados do CB-SC com monócitos humanos e o monitoramento da diferenciação M2.

Introdução

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As células-tronco do sangue do cordão umbilical (CB-SC) são um tipo único de células-tronco identificadas do sangue do cordão humano e distinguem-se de outros tipos conhecidos de células-tronco, como células-tronco mesenquimais (MSC) e células-tronco hematopoiéticas (HSC)¹. Com base em suas propriedades únicas de modulação imunológica e sua capacidade de aderir firmemente à superfície das placas de Petri, desenvolvemos uma nova tecnologia designada como terapia de Educador de Células-Tronco (SCE) em ensaios clínicos^2,³. Durante a terapia de SCE, as células mononucleares de sangue perifé....

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Protocolo

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O protocolo segue as diretrizes do comitê institucional de ética em pesquisa humana do Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health. Unidades de sangue de casacos de buffy humanos foram compradas no Blood Center de Nova York (Nova York, NY). Unidades de sangue do cordão umbilical humano foram coletadas de doadores saudáveis e compradas do banco de sangue Cryo-Cell International (Oldsmar, FL). Tanto o Hemocente de Nova York quanto o Crio-Cell receberam todas as credenciais para coletas e distribuições de sangue, com aprovação do IRB e formulários de consentimento assinados por doadores.

1. Cultura celular e preparação do mei....

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Resultados

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Inicialmente, o fenótipo e a pureza do CB-SC foram examinados por citometria de fluxo com marcadores associados ao CB-SC, como o antígeno comum de leucócito CD45, os fatores de transcrição específicos da célula ES OCT3/4 e SOX2. CB-SC exibe altos níveis de CD45, OUT3/4, SOX2, CD270 e expressão galectin 9, mas nenhuma expressão de CD34(Figura 1A). A análise da citometria de fluxo confirmou a expressão de marcadores específicos exossomos, incluindo CD9, CD81 e CD63, em exosóis derivados do CB-.......

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Discussão

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A aplicação de exosóis é um campo emergente para diagnóstico clínico, desenvolvimento de medicamentos e medicina regenerativa. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado sobre a preparação de exosóis derivados do CB-SC e o estudo funcional de exosóis sobre a diferenciação de monócitos humanos. O protocolo atual demonstrou que os exosóis funcionais derivados do CB-SC são isolados por centrifugação sequencial e ultracentrifugação com alta pureza e exibindo a modulação imunológica em monócitos.

Em.......

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Divulgações

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Dr. Zhao é um dos fundadores da Tianhe Stem Cell Biotechnology Inc. Dr. Zhao é um inventor da tecnologia Stem Cell Educator. Todos os outros autores não têm interesses financeiros que possam ser relevantes para o trabalho submetido.

Agradecimentos

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Somos gratos ao Sr. Poddar e ao Sr. Ludwig pelo generoso apoio de financiamento através da Fundação Hackensack UMC. Agradecemos laura Zhao pela edição em inglês.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml	Fisher Scientific	05-408-129
Tubo cônico de 15 ml	Falcon	352196
placa de 24 poços	Falcon	351147	Placa de cultura de tecidos
3,3'-Diostadecyloxacarbociananina perclorato (Dio)	Millipore sigma	D4292-20MG	Armazene a 4 ° C
300 Mesh Grids	Ted Pella	1GC300
Tubo cônico de 50 mL	Falcon	352070
Placa de 6 poços	Falcon	353046	Placa de cultura
tecidos Placa de 96 poços	Falcon	353072	Placa de cultura de tecidos
ACK Lysis Buffer	Lonza	10-548E	100 ml
Amicon-15 10kDa Unidade de Fliter Centrífuga	Millipore sigma	UFC901024
Anti-Human Alix	Biolegend	634501	loja em 4 ° C, RRID: AB_2268110
Calnexina Anti-Humana	Biolegend	699401	loja em 4 ° C, RRID: AB_2728519
anticorpo anti-CD11c humano, Pe-Cy7	BD Bioscience	561356	armazenar a 4 ° C, RRID: AB_10611859
anticorpo CD14 anti-humano, loja Karma Orange	Beckman Coulter	B36294	a 4 ° C, RRID: AB_2728099
anticorpo CD163 anti-humano, PE	BD Bioscience	556018	loja a 4 ° C, RRID: AB_396296
anticorpo CD19 anti-humano, PC5	Beckman Coulter	IM2643U	loja a 4 ° C, RRID: AB_131160
anticorpo CD206 anti-humano, FITC	BD Bioscience	551135	armazenar a 4 ° C, RRID: AB_394065
anticorpo CD209 anti-humano, Brilliant Violet 421	BD Bioscience	564127	loja em 4 ° C, RRID: AB_2738610
anticorpo anti-CD270 humano, PE	Biolegend	318806	loja a 4 ° C, RRID: AB_2203703
anticorpo CD3 anti-humano, Pacfic Blue	Biolegend	300431	loja a 4 ° C, RRID: AB_1595437
anticorpo anti-CD34 humano, APC	Beckman Coulter	IM2427U	loja a 4 ° C, RRID: N / A
Anticorpo CD4 anti-humano, APC	BD Bioscience	555349	loja a 4 ° C, RRID: AB_398593
anticorpo anti-CD45 humano, Pe-Cy7	Beckman Coulter	IM3548U	loja a 4 ° C, RRID: AB_1575969
anticorpo anti-CD56 humano, PE	Beckman Coulter	IM2073U	loja a 4 ° C, RRID: AB_131195
anticorpo CD63 anti-humano, PE	BD Bioscience	561925	loja em 4 ° C, RRID: AB_10896821
anticorpo CD8 anti-humano, APC-Alexa Fluor 750	Beckman Coulter	A94686	loja em 4 ° C, RRID: N / A
Anti-Human CD80 antibody, APC	Beckman Coulter	B30642	loja em 4 ° C, RRID: N / A
Anti-Human CD81 anticorpo, FITC	BD Bioscience	561956	loja em 4 ° C, RRID: AB_394049
anticorpo anti-CD86 humano, APC-Alexa Fluor 750	Beckman Coulter	B30646	loja em 4 ° C, RRID: N / A
Anti-Human CD9 anticorpo, FITC	ThermoScientic	MA5-16860	armazenar em 4 ° C, RRID: AB_2538339
anticorpo anti-galectina 9 humana, Brilliant Violet 421	Biolegend	348919	loja em 4 ° C, RRID: AB_2716134
anticorpo anti-humano OCT3/4, eFluor660	ThermoScientic	50-5841-82	armazenar em 4 ° C, RRID: AB_11218882
anticorpo SOX2 anti-humano, Alexa Fluor 488	ThermoScientic	53-9811-82	loja em 4 ° C, RRID: AB_2574479
Kit de Ensaio de Proteína BCA	ThermoFisher Scientific	23227
Albumina de Soro Bovino	Millipore Sigma	A1933
Revestimento Buffy	New York Blood Center		40-60 ml/unidade
Raspador de células	Falcon	353085
Cubeta semi-micro descartável	VWR	97000590
Tampão de dissociação	Gibco	131510014	de 100 ml
	Bio-Rad	1450015
Reagente de detecção de exossomo-humano CD63	ThermoFisher Scientific	10606D	armazenar a 4 ° C
Ficoll-Paque PLUS densidade grandient media	GE Health	17-1440-03	500 ml
(25°)	Thermo Scientifc	75003698	Maxium 24,700 x g
Citômetro de fluxo Gallios	Beckman Coulter		3 lasers 10 Color Max
Sangue do cordão humano	Cryo-Cell International		40-100 ml/unidade
Bloco Fc Humano	BD Bioscience	564220	loja em 4 ° C
Membrana PVDF Immun-Blot	Bio-Rad	1620177
Millex-GP Unidade de Filtro de Seringa, 0.22 µ m	Millipore Sigma	SLGP033RS
Optima XE-90 Ultracentriguge	Beckman Coulter
Orbital Shaker MP4	BioExpress	S-3500-1
PBS	ThermoFisher Scientific	10010049	500 ml
de iodeto de propídio	BD Bioscience	56-66211E	loja em 4 ° C
Microscópio Nikon Eclipse Ti2	Instrumentos Nikon Inc	Eclipse Ti2	NIS-Elements versão do software 5.11.02
Hochest 33342	Thermo Scientifc	62249	5 ml
Reverter microscopia	Fisher scientific	12563518
Rotor 41 Ti	Beckman Coulter	331362	Maxium 41.000 rpm
Sorvall St 16R Centrifuge	Thermo Scientifc	75004381
Rotor de Balde Oscilante	Thermo Scientifc	75003655
contador de células TC-20	Bio-Rad
ThermoScientific Forma 380 Incubadora de CO2 de ciclo esteri	ThermoFisher Scientific
Tubo de	JEOL	JEM-2100 PLUS
	Coulter	331372
X'VIVO 15 Meio sem soro	Lonza	BEBP04-744Q	1000 ml Meio de cultura, armazenar a 4 ° O

de lâminas de contagem de células Dual-Chanber Rotor de ângulo fixo de ultracentrífuga

Referências

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Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration followin....

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