Diferenciação de monócitos em macrófagos fenotipicamente distintos após o tratamento com células-tronco do sangue do cordão humano (CB-SC)-Exósmos derivados

Resumo

A aplicação de exosomo é uma ferramenta emergente para o desenvolvimento de medicamentos e medicina regenerativa. Estabelecemos um protocolo de isolamento exossomo com alta pureza para isolar exosóis de células-tronco identificadas chamadas CB-SC para estudos mecanicistas. Também cocultura cb-SC-derivado exosósmos com monócitos humanos, levando à sua diferenciação em macrófagos fenotipicamente distintos.

Resumo

A terapia com células-tronco (SCE) é uma nova abordagem clínica para o tratamento de diabetes tipo 1 e outras doenças autoimunes. A terapia de CIP circula as células mononucleares sanguíneas isoladas do paciente (por exemplo, linfócitos e monócitos) através de uma máquina de aferese, co-culturas as células mononucleares sanguíneas do paciente com células-tronco derivadas do sangue do cordão aderente (CB-SC) no dispositivo SCE e, em seguida, devolve essas células imunes "educadas" ao sangue do paciente. Exosóis são vesículas extracelulares de tamanho nano-tamanho entre 30\u2012150 nm existentes em todos os meios de cultura biofluida e celular. Para explorar ainda mais os mecanismos moleculares subjacentes à terapia SCE e determinar as ações de exosóis liberados do CB-SC, investigamos quais células fagocitizam esses exosóis durante o tratamento com CB-SC. Ao co-culturar exosóis derivados do CB-SC com células mononucleares de sangue periféricos (PBMC), descobrimos que exosóis derivados do CB-SC foram predominantemente tomados por monócitos humanos CD14-positivos, levando à diferenciação de monócitos em macrófagos tipo 2 (M2), com morfologia semelhante ao fuso e expressão de marcadores moleculares de superfície associados a M2. Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento e caracterização de exosóis derivados do CB-SC e o protocolo para a co-cultura de exosóis derivados do CB-SC com monócitos humanos e o monitoramento da diferenciação M2.

Introdução

As células-tronco do sangue do cordão umbilical (CB-SC) são um tipo único de células-tronco identificadas do sangue do cordão humano e distinguem-se de outros tipos conhecidos de células-tronco, como células-tronco mesenquimais (MSC) e células-tronco hematopoiéticas (HSC)¹. Com base em suas propriedades únicas de modulação imunológica e sua capacidade de aderir firmemente à superfície das placas de Petri, desenvolvemos uma nova tecnologia designada como terapia de Educador de Células-Tronco (SCE) em ensaios clínicos^2,3. Durante a terapia de SCE, as células mononucleares de sangue periféricos (PBMC) são coletadas e circuladas através de um separador celular e co-cultivadas com cb-SC aderente in vitro. Essas células "educadas" (PBMC tratada pelo CB-SC) são então devolvidas à circulação do paciente em um sistema de loop fechado. Os ensaios clínicos já demonstraram a segurança clínica e a eficácia da terapia de ED para o tratamento de doenças autoimunes, incluindo diabetes tipo 1 (T1D)^2,4 e alopecia areata (AA)⁵.

Exosóis são uma família de nanopartículas com diâmetros que variam de 30\u2012150 nm e existem em todos os meios biofluidos e de cultura celular⁶. Exosóis são enriquecidos com muitas moléculas bioativas, incluindo lipídios, mRNAs, proteínas e microRNAs (miRNA), e desempenham um papel importante nas comunicações célula-célula. Ultimamente, os exósmos tornaram-se mais atraentes para pesquisadores e empresas farmacêuticas devido aos seus potenciais terapêuticos nas clínicas^7,8,9. Recentemente, nossos estudos mecanicistas demonstraram que exosóis liberados pelo CB-SC contribuem para a modulação imunológica da terapia SCE¹⁰.

Aqui, descrevemos o protocolo para explorar o mecanismo da terapia SCE visando monócitos por exosóis liberados pela CB-SC. Primeiro, os exosóis liberados pelo CB-SC foram isolados da mídia condicionada pelo CB-SC usando métodos de ultracentrifugação e validados por citometria de fluxo, mancha ocidental (WB) e dispersão dinâmica de luz (DLS). Em segundo lugar, os exosóis derivados do CB-SC foram rotulados com um corante lipofílico fluorescente verde: Dio. Em terceiro lugar, foram co-cultivados com o PBMC para examinar os percentuais positivos de exosóis derivados do CB-SC rotulados por Dio nas diferentes subpopulações do PBMC por citometria de fluxo. Este protocolo fornece orientação para estudar a ação de exosóis subjacentes à modulação imunológica das células-tronco.

Protocolo

O protocolo segue as diretrizes do comitê institucional de ética em pesquisa humana do Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health. Unidades de sangue de casacos de buffy humanos foram compradas no Blood Center de Nova York (Nova York, NY). Unidades de sangue do cordão umbilical humano foram coletadas de doadores saudáveis e compradas do banco de sangue Cryo-Cell International (Oldsmar, FL). Tanto o Hemocente de Nova York quanto o Crio-Cell receberam todas as credenciais para coletas e distribuições de sangue, com aprovação do IRB e formulários de consentimento assinados por doadores.

1. Cultura celular e preparação do meio condicionado derivado do CB-SC

1. Transfira 25 mL de sangue do cordão umbilical(Tabela de Materiais) acima de 20 mL de gradiente de densidade médio (γ = 1,077) em um tubo cônico de 50 mL.
2. Centrifugar a 1.690 x g por 20 min a 20 °C em um rotor de balde balançando sem freio.
3. Transfira cuidadosamente a camada de célula mononuclear (casaco buffy) para um novo tubo cônico de 50 mL. Encha o tubo cônico com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) a 40 mL. Misture e centrífugas em células de pelotas a 751 x g por 10 min a 20 °C.
4. Descarte o supernasciente e adicione 15 mL de tampão de lise ACK(Tabela de Materiais) à pelota celular. Suspender as células através da tubulação. Em seguida, incubar por 10 minutos em temperatura ambiente.
   NOTA: Esta etapa remove os glóbulos vermelhos.
5. Encha o tubo cônico com 25 mL de PBS. Centrifugar a 751 x g por 5 min e descartar supernasce para obter células mononucleares pelleted.
6. Lave 2x com 40 mL de PBS para remover o tampão de lise restante.
7. Centrifugar a 751 x g por 5 min para pelotar as células.
8. Descarte as células mononucleares de sangue do cordão umbilical supernascida e suspenda-se de novo com 10 mL de meio sem soro(Tabela de Materiais)por tubo.
9. Combine células mononucleares de sangue do cordão um a um tubo.
10. Pegue suspensão celular de 20 μL e misture com 20 μL de solução azul trypan de 0,4%(Tabela de Materiais)em um tubo de 1,5 mL.
11. Carregue no slide da câmara e quantifique o número da célula e a viabilidade celular com um contador automático de células.
    NOTA: A suspensão celular é diluída às 1:10 se a concentração celular estiver acima de 1 x 10⁷ células/mL.
12. Sementes mononucleares em placas de Petri de 150 mm x 15 mm a 1 x 10⁶ células/mL, 25 mL/prato em meio de cultura celular sem soro definido por produtos químicos.
13. Incubar a 37 °C sob 8% de condições de CO₂ por 10\u201214 dias até que o CB-SC atinja mais de 80% de confluência.
14. Descarte o supernaspe e lave com 15 mL de PBS por placa de Petri; em seguida, remova o PBS.
    NOTA: O CB-SC está bem ligado às placas de Petri.
15. Repita o passo 1.14 duas vezes.
16. Adicione 25 mL de meio livre de soro definido por placa de Petri.
17. Incubar a 37 °C sob 8% de condições de CO₂ por 3\u20124 dias.
18. Colete o meio condicionado derivado do CB-SC em tubos cônicos de 50 mL.

2. Caracterização do CB-SC

1. Despeça CB-SC por pipetar 10 mL de tampão de dissociação celular baseado em PBS para cima e para baixo com uma ponta de pipeta de 5 mL(Tabela de Materiais).
2. Centrifugar a 1.690 x g por 5 min para pelotas e suspender em 200 μL de PBS.
3. Fixação e permeabilizatura para coloração intracelular através do kit de preparação de coloração(Tabela de Materiais).
4. Adicione 5 μL de bloqueador de Fc(Tabela de Materiais) por amostra e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente.
   NOTA: O bloqueador de fc inibe a ligação não específica ao coloração com anticorpos.
5. Adicione anticorpos monoclonais de camundongos conjugados pela fluorescência, incluindo CD34, CD45, SOX2, OCT3/4, CD270 e Galectin 9 a 25 μg/mL(Tabela de Materiais)a 100 μL de volume de células. Incubar por 30 minutos em temperatura ambiente com proteção contra luz.
6. Após a coloração, lave as células com 1 mL de PBS e centrífuga a 751 x g por 10 minutos para as células de pelotas.
7. Re suspenda as células com 200 μL de PBS e transfira para um tubo de 5 mL.
8. Realize a citometria de fluxo para validar a expressão de cb-SC-associado acima de marcadores específicos.

3. Isolamento de exosóis derivados do CB-SC

1. Centrifugar o meio condicionado coletado da etapa 1.18 a 300 x g para 10 min a 4 °C. Transfira o supernatante para um novo tubo cônico de 50 mL.
2. Centrifugar o supernante coletado da etapa 3.1 a 2.000 x g para 20 min a 4 °C. Transfira o supernatante para um novo tubo cônico de 50 mL.
3. Centrifugar o supernante coletado da etapa 3.2 a 10.000 x g para 30 min a 4 °C. Transfira o supernatante para um novo tubo cônico de 50 mL.
   NOTA: O rotor de ângulo fixo é usado para que as pelotas celulares sejam precipitadas na lateral do tubo. Marque o lado da tampa e desenhe um círculo na lateral do tubo onde a pelota é esperada.
4. Supernantes de filtro coletados da etapa 3.3 com um filtro de 0,22 μm(Tabela de Materiais).
5. Transfira 15 mL de mídia para cada unidade de filtro centrífugo de 10 kDa(Tabela de Materiais).
6. Centrifugar a 4.000 x g por 30 min para isolar a mídia exosome concentrada.
7. Transfira os exossomos concentrados para um tubo ultracentrífuga. Em seguida, exossomos de pelota a 100.000 x g para 80 min a 4 °C.
8. Descarte o supernatante e suspenda os exossomos de pelotas em 10 mL de PBS.
9. Centrifugar a 100.000 x g por 80 min a 4 °C para coletar a pelota exosósma.
10. Suspenda a pelota de exosóis em 200 μL de PBS, pipetando para cima e para baixo.

4. Caracterização de exosóis derivados do CB-SC

1. Quantificando a concentração total de proteínas de preparação exosóica por kit de ensaio de ácido bicinchonínico (BCA)
   1. Pipeta 10 μL de cada amostra exosome padrão e isolada preparada na etapa 3.10 em uma placa de 96 poços em duplicata.
   2. Adicione 200 μL do reagente de trabalho do kit BCA a cada poço. Misture bem o conteúdo da placa no agitador de placas por 10 s.
      NOTA: Reagente de trabalho (WR): reagente de 50 partes A com reagente de 1 parte B.
   3. Cubra as placas com papel alumínio e incuba-as a 37 °C por 30 min.
   4. Esfrie as placas à temperatura ambiente (RT).
   5. Meça a absorvância da amostra a 562 nm através de um leitor de placas.
2. Preparação e coloração de exosóis para citometria de fluxo
   1. Capture exossomos adicionando 20 μL de contas magnéticas CD63 anti-humanas (tamanho de 4,5 μm)(Tabela de Materiais) em 25 μg de exosóis derivados do CB-SC preparados na etapa 3.10 no volume total de 100 μL de PBS.
   2. Incubar o tubo durante a noite (18\u201222 h) a 4 °C no agitador a 800 rpm.
   3. Centrifugar o tubo a 300 x g por 30 s para coletar a amostra na parte inferior do tubo.
   4. Adicione 300 μL de tampão de isolamento (0,1% de albumina de soro bovino (BSA) no PBS) e misture suavemente por pipetação.
      NOTA: Esta etapa lava os exosóis ligados a contas.
   5. Coloque o tubo em uma posição de ímã por 1 min (Tabela de Materiais) e descarte o sobrenante.
   6. Repetição de passos 4.2.4\u20124.2.5.
   7. Suspenda os exosóis ligados a contas com 400 μL de tampão de isolamento.
   8. Alíquota de 100 μL de exosóis ligados a contas para cada tubo.
   9. Adicione anticorpos conjugados com fluorescência (CD9-FITC, CD81-PE e CD63-FITC a 25 μg/mL, respectivamente) a cada tubo de fluxo com exosóis capturados por contas CD63.
      NOTA: Os IgGs com correspondência de isótipo servem como controles negativos.
   10. Incubar por 45 min à temperatura ambiente com proteção luminosa no shaker a 800 rpm.
   11. Repetição de passos 4.2.4\u20124.2.5.
   12. Suspenda os exossomos ligados a contas em 200 μL de tampão de isolamento e transfira para tubos de fluxo de 5 mL.
   13. Coloque os tubos no carrossel amostral do citómetro de fluxo.
   14. Abra o protocolo para testes exosóis.
   15. Execute a amostra automaticamente por citômetro de fluxo.
3. Detecção exósia por mancha ocidental
   NOTA: A mancha ocidental é um método bem estabelecido e não entraremos em detalhes do método em si.
   1. Lyse as pelotas de exosóis derivados do CB-SC a partir da etapa 3.10 com 100 μL de tampão RIPA, pipeta 20x, em seguida, coloque no gelo por 5 minutos.
   2. Quantifique a concentração proteica de lise exosósada pelo kit BCA e carregue 25 μg de proteína por poço.
   3. Separe as proteínas por eletroforese de gel por 40 min a 150 V.
   4. Transfira a proteína para a membrana de flúor de polivinida (PVDF) utilizando o método de transferência semi-seco¹¹.
   5. Bloqueie a membrana com 5% de leite sem gordura por 30 minutos.
   6. Incubar com 2 μg/mL anti-humano Alix (Tabela de Materiais) e anticorpos calnexin anti-humanos de 1 μg/mL(Tabela de Materiais).
   7. Detecte a proteína por chemiluminescência com um sistema de imagem digital.
4. Validação exósmida por dispersão dinâmica de luz (DLS)
   1. Diluir 10 μg de amostras exóssias derivadas do CB-SC em 1 mL de PBS.
   2. Transfira o 1 mL de amostra diluída para o semi-micro cuvette descartável (Tabela de Materiais).
   3. Coloque a cuvette no instrumento DLS. Defina o índice de refração (RI) como 1,39 para todo o monitor amostral.
   4. Execute amostras a 25 °C e adquira três medidas por fração para obter uma distribuição de tamanho médio.
5. Validação exosós por microscopia eletrônica de transmissão (TEM)
   1. Casaco formvar em 300 grades de cobre de malha¹² (Tabela de Materiais).
   2. Fortaleça o formvar com a camada adicional de carbono evaporado nas redes de cobre¹².
      NOTA: Tal abordagem de revestimento é excelente para suporte de espécimes.
   3. Carregue 10 μL de amostras exosós em grades e deixe secar ao ar.
   4. Manchar negativamente amostras com acetato de urano por 5 min.
   5. Lave três vezes com água DI e deixe secar ao ar.
   6. Observe e fotografe as amostras em TEM. Ajuste a tensão acelerada em 200 kV e o tamanho da mancha em 2.

5. Medida Dio-rotulado cb-SC-derivado exosomes tomados por diferentes subpopulações de PBMC

1. Rótulo CB-SC-derivado exosomos com corante lipofílico fluorescente verde Dio
   1. Transfira 100 μg de exosósmos derivados do CB-SC (preparados na etapa 3.10) para um tubo de centrífuga de 15 mL.
   2. Amostra diluída com PBS a 5 mL.
   3. Adicione corante lipofílico fluorescente verde Dio(Tabela de Materiais)até que a concentração de trabalho atinja 5 μM.
   4. Incubar por 15 minutos à temperatura ambiente protegido da luz.
   5. Transfira a amostra para um tubo ultracentrífuga.
   6. Centrífuga a 100.000 x g por 80 min para pellet Dio-labeled CB-SC-derivado exosomos.
   7. Suspenda desapropramentados os exossomos rotulados em 200 μL de PBS.
2. Preparação do PBMC humano
   1. Transfira 25 mL de casaco de buffy humano(Tabela de Materiais) acima de 20 mL de gradiente de densidade médio (γ = 1,077) em um tubo cônico de 50 mL.
   2. Repita as etapas 1.2 a 1.11.
   3. Transfira 1 x 10⁶ PBMC em uma placa hidrofóbica não tratada com tecido (1 mL/bem).
      NOTA: Uma placa não tratada com tecido foi usada para evitar a adesão de monócitos.
3. Exósmos co-culturais com PBMC
   1. Transfira 40 μL Dio-labeled CB-SC-derivado exosósmos preparados na etapa 5.1.7 para cada poço contendo PBMC em uma placa de 24 poços usando uma pipeta de 200 μL. Adicione o mesmo volume de PBS para controlar poços.
   2. Misture por pipetação 10x. Incubar por 4h.
   3. Colete 200 PBMC tratados com exosome e etiqueta com Hoechst 33342 por 10 min a temperatura ambiente.
   4. Centrifugar a 300 x g por 10 min a temperatura ambiente. Descarte o supernatante e suspenda a pelota de célula em 100 μL de PBS.
   5. Monte células em deslizamentos de microscópio.
   6. Observe e fotografe a interação de exosóis derivados do CB-SC com PBMC rotulados por Hoechst 33342 usando um microscópio.
   7. Transfira as células restantes da etapa 5.3.3 para um tubo de 1,5 mL.
   8. Centrifugar a 300 x g por 10 min a 4 °C. Descarte o supernatante e suspenda a pelota de célula em 200 μL de PBS.
   9. Adicione 5 μL de bloqueador de Fc por amostra. Incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.
   10. Adicione anticorpos (CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD19 e CD56 a 25 μg/mL)(Tabela de Materiais) para coloração do PBMC.
       NOTA: Os IgGs com correspondência de isótipo servem como controles negativos.
   11. Incubar por 30 minutos em temperatura ambiente com proteção contra luz.
   12. Adicione 1 mL de PBS e centrífuga a 300 x g por 10 min a 4 °C para pelotar as células.
   13. Suspenda as células com 200 μL PBS. Adicione 5 μL de iodeto de propidium.
   14. Use a citometria de fluxo para avaliar o nível de absorção exossoma rotulada por Dio em diferentes subpopulação de PBMC.

6. Examine a ação de exosóis derivados do CB-SC em monócitos

1. Isolamento monócitos humanos CD14 positivos
   1. Transfira 3 x 10⁷ PBMC humano para um tubo de 15 mL.
   2. Centrifugar a 300 x g por 10 min a 4 °C.
   3. Coloque a coluna de separação(Tabela de Materiais)no separador de ímãs(Tabela de Materiais).
   4. Lavar colunas de separação três vezes com 2 mL de tampão de corrida a frio(Tabela de Materiais).
   5. Suspenda as células em 300 μL de PBS frio. Adicione 60 μL de microesferas CD14. Misture bem e incubar no gelo por 15 minutos.
   6. Adicione 6 mL de PBS frio. Centrifugar a 300 x g por 10 min a 4 °C.
   7. Suspenda as células pelleted em 500 μL de tampão de corrida a frio.
   8. Transfira as células para a coluna de separação (preparada na etapa 6.14) e deixe-as passar.
   9. Lave a coluna de separação três vezes com 2 mL de tampão de corrida por lavagem. Levante a coluna do separador de ímãs e coloque-a em um tubo de centrífuga de 15 mL.
      NOTA: O tubo de 15 mL deve ser colocado no gelo devido à adesão de monócitos CD14 positivos ao tubo à temperatura ambiente.
   10. Transfira 2 mL de tampão de corrida a frio para a parte superior da coluna e isole as células CD14 positivas no tubo de 15 mL.
   11. Centrifugar a 300 x g por 10 min a 4 °C para pelotar as células CD14 positivas.
   12. Suspenda as células com 2 mL de meio livre de soro definido por produtos químicos a frio(Tabela de Materiais).
   13. Transfira 50 μL de células para um tubo de 1,5 mL.
   14. Mancha com 10 μL de KROme Orange-conjugado anti-humano CD14 mAb (Tabela de Materiais) por 20 min.
       NOTA: Os IgGs com correspondência de isótipo servem como controles negativos.
   15. Adicione 1 mL PBS às células. Centrífuga a 300 x g por 10 min para células de pelota.
   16. Suspenda as células em 200 μL de PBS e transfira-as para um tubo de 5 mL. Determine a pureza dos monócitos CD14 positivos por citometria de fluxo.
2. Tratamento de monócitos com exosóis derivados do CB-SC
   1. Sementes 1 x 10⁶ monócitos purificados com meio de cultura sem soro definido por produtos químicos(Tabela de Materiais) em placa de 6 poços tratadas com cultura tecidual (2 mL/well).
   2. Incubar por 2 h a 37 °C abaixo de 5% de CO₂.
   3. Descarte o supernatante com pipeta de 1 mL. Adicione 2 mL de 37 °C pré-aquecido meio de cultura sem soro definido por soro(Tabela de Materiais) suavemente.
      NOTA: Os monócitos foram aderidos à placa dentro de 2h. Células flutuantes foram identificadas como mortas ou outras contaminações celulares.
   4. Adicione 80 μg exosóis derivados do CB-SC isolados da etapa 3.10 às culturas monócitos em uma placa de 6 poços com volume total de 2 mL.
      NOTA: O mesmo volume de PBS foi adicionado ao controle de poços.
   5. Incubar a 37 °C abaixo de 5% de CO₂ por 3\u20124 dias.
   6. Fotografe a morfologia celular usando um microscópio invertido a 200× ampliação(Tabela de Materiais).
   7. Desprender células por tubulação para cima e para baixo em 1 mL de um tampão de dissociação celular baseado em PBS com ponta de pipeta de 1 mL.
   8. Colher as células anexadas restantes através de um raspador de células.
      NOTA: Uma vez que monócitos primários ou macrófagos diferenciados se prendem firmemente, algumas células permanecem aderidas ao fundo após o tratamento com tampão de dissociação. Portanto, essas células são colhidas com um raspador de células.
   9. Coletar células a 1.690 x g por 5 min. Re suspenda células em 200 μL de PBS.
   10. Adicione 5 μL de bloqueador fc (25 μg/mL) para bloquear a vinculação não específica.
   11. Adicione anticorpos (CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 e CD209 a 25 μg/mL, Tabela de Materiais) às células. Incubar por 30 minutos em temperatura ambiente.
       NOTA: IgGs com correspondência de isótipo servem como controle negativo
   12. Adicione 1 mL de PBS às células e centrífuga a 300 x g por 10 min. Descarte o supernatante e suspenda-o com 200 μL de PBS.
   13. Adicione 5 μL de iodeto de propidium por amostra (200 μL) e transfira células para um novo tubo de fluxo de 5 mL.
   14. Realize a citometria de fluxo e avalie os níveis de expressões de CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 e CD209.

Resultados

Inicialmente, o fenótipo e a pureza do CB-SC foram examinados por citometria de fluxo com marcadores associados ao CB-SC, como o antígeno comum de leucócito CD45, os fatores de transcrição específicos da célula ES OCT3/4 e SOX2. CB-SC exibe altos níveis de CD45, OUT3/4, SOX2, CD270 e expressão galectin 9, mas nenhuma expressão de CD34(Figura 1A). A análise da citometria de fluxo confirmou a expressão de marcadores específicos exossomos, incluindo CD9, CD81 e CD63, em exosóis derivados do CB-...

Discussão

A aplicação de exosóis é um campo emergente para diagnóstico clínico, desenvolvimento de medicamentos e medicina regenerativa. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado sobre a preparação de exosóis derivados do CB-SC e o estudo funcional de exosóis sobre a diferenciação de monócitos humanos. O protocolo atual demonstrou que os exosóis funcionais derivados do CB-SC são isolados por centrifugação sequencial e ultracentrifugação com alta pureza e exibindo a modulação imunológica em monócitos.

Em...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml	Fisher Scientific	05-408-129
Tubo cônico de 15 ml	Falcon	352196
placa de 24 poços	Falcon	351147	Placa de cultura de tecidos
3,3'-Diostadecyloxacarbociananina perclorato (Dio)	Millipore sigma	D4292-20MG	Armazene a 4 ° C
300 Mesh Grids	Ted Pella	1GC300
Tubo cônico de 50 mL	Falcon	352070
Placa de 6 poços	Falcon	353046	Placa de cultura
tecidos Placa de 96 poços	Falcon	353072	Placa de cultura de tecidos
ACK Lysis Buffer	Lonza	10-548E	100 ml
Amicon-15 10kDa Unidade de Fliter Centrífuga	Millipore sigma	UFC901024
Anti-Human Alix	Biolegend	634501	loja em 4 ° C, RRID: AB_2268110
Calnexina Anti-Humana	Biolegend	699401	loja em 4 ° C, RRID: AB_2728519
anticorpo anti-CD11c humano, Pe-Cy7	BD Bioscience	561356	armazenar a 4 ° C, RRID: AB_10611859
anticorpo CD14 anti-humano, loja Karma Orange	Beckman Coulter	B36294	a 4 ° C, RRID: AB_2728099
anticorpo CD163 anti-humano, PE	BD Bioscience	556018	loja a 4 ° C, RRID: AB_396296
anticorpo CD19 anti-humano, PC5	Beckman Coulter	IM2643U	loja a 4 ° C, RRID: AB_131160
anticorpo CD206 anti-humano, FITC	BD Bioscience	551135	armazenar a 4 ° C, RRID: AB_394065
anticorpo CD209 anti-humano, Brilliant Violet 421	BD Bioscience	564127	loja em 4 ° C, RRID: AB_2738610
anticorpo anti-CD270 humano, PE	Biolegend	318806	loja a 4 ° C, RRID: AB_2203703
anticorpo CD3 anti-humano, Pacfic Blue	Biolegend	300431	loja a 4 ° C, RRID: AB_1595437
anticorpo anti-CD34 humano, APC	Beckman Coulter	IM2427U	loja a 4 ° C, RRID: N / A
Anticorpo CD4 anti-humano, APC	BD Bioscience	555349	loja a 4 ° C, RRID: AB_398593
anticorpo anti-CD45 humano, Pe-Cy7	Beckman Coulter	IM3548U	loja a 4 ° C, RRID: AB_1575969
anticorpo anti-CD56 humano, PE	Beckman Coulter	IM2073U	loja a 4 ° C, RRID: AB_131195
anticorpo CD63 anti-humano, PE	BD Bioscience	561925	loja em 4 ° C, RRID: AB_10896821
anticorpo CD8 anti-humano, APC-Alexa Fluor 750	Beckman Coulter	A94686	loja em 4 ° C, RRID: N / A
Anti-Human CD80 antibody, APC	Beckman Coulter	B30642	loja em 4 ° C, RRID: N / A
Anti-Human CD81 anticorpo, FITC	BD Bioscience	561956	loja em 4 ° C, RRID: AB_394049
anticorpo anti-CD86 humano, APC-Alexa Fluor 750	Beckman Coulter	B30646	loja em 4 ° C, RRID: N / A
Anti-Human CD9 anticorpo, FITC	ThermoScientic	MA5-16860	armazenar em 4 ° C, RRID: AB_2538339
anticorpo anti-galectina 9 humana, Brilliant Violet 421	Biolegend	348919	loja em 4 ° C, RRID: AB_2716134
anticorpo anti-humano OCT3/4, eFluor660	ThermoScientic	50-5841-82	armazenar em 4 ° C, RRID: AB_11218882
anticorpo SOX2 anti-humano, Alexa Fluor 488	ThermoScientic	53-9811-82	loja em 4 ° C, RRID: AB_2574479
Kit de Ensaio de Proteína BCA	ThermoFisher Scientific	23227
Albumina de Soro Bovino	Millipore Sigma	A1933
Revestimento Buffy	New York Blood Center		40-60 ml/unidade
Raspador de células	Falcon	353085
Cubeta semi-micro descartável	VWR	97000590
Tampão de dissociação	Gibco	131510014	de 100 ml
	Bio-Rad	1450015
Reagente de detecção de exossomo-humano CD63	ThermoFisher Scientific	10606D	armazenar a 4 ° C
Ficoll-Paque PLUS densidade grandient media	GE Health	17-1440-03	500 ml
(25°)	Thermo Scientifc	75003698	Maxium 24,700 x g
Citômetro de fluxo Gallios	Beckman Coulter		3 lasers 10 Color Max
Sangue do cordão humano	Cryo-Cell International		40-100 ml/unidade
Bloco Fc Humano	BD Bioscience	564220	loja em 4 ° C
Membrana PVDF Immun-Blot	Bio-Rad	1620177
Millex-GP Unidade de Filtro de Seringa, 0.22 µ m	Millipore Sigma	SLGP033RS
Optima XE-90 Ultracentriguge	Beckman Coulter
Orbital Shaker MP4	BioExpress	S-3500-1
PBS	ThermoFisher Scientific	10010049	500 ml
de iodeto de propídio	BD Bioscience	56-66211E	loja em 4 ° C
Microscópio Nikon Eclipse Ti2	Instrumentos Nikon Inc	Eclipse Ti2	NIS-Elements versão do software 5.11.02
Hochest 33342	Thermo Scientifc	62249	5 ml
Reverter microscopia	Fisher scientific	12563518
Rotor 41 Ti	Beckman Coulter	331362	Maxium 41.000 rpm
Sorvall St 16R Centrifuge	Thermo Scientifc	75004381
Rotor de Balde Oscilante	Thermo Scientifc	75003655
contador de células TC-20	Bio-Rad
ThermoScientific Forma 380 Incubadora de CO2 de ciclo esteri	ThermoFisher Scientific
Tubo de	JEOL	JEM-2100 PLUS
	Coulter	331372
X'VIVO 15 Meio sem soro	Lonza	BEBP04-744Q	1000 ml Meio de cultura, armazenar a 4 ° O