Artigo de método

Caracterização citométrica de fluxo do desenvolvimento de células B murinas

DOI:

10.3791/61565

⸱

22 de janeiro de 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Regeneron Tech Centers, Regeneron Pharmaceuticals, Inc., 2Regeneron Therapeutic Proteins, Regeneron Pharmaceuticals, Inc., 3Immunology and Inflammation, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descrevemos aqui uma simples análise da heterogeneidade do compartimento de células B imunes da murina nos tecidos peritônio, baço e medula óssea por citometria de fluxo. O protocolo pode ser adaptado e estendido a outros tecidos do mouse.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estudos extensivos caracterizaram o desenvolvimento e diferenciação de células murinas B em órgãos linfoides secundários. Anticorpos secretados por células B foram isolados e desenvolvidos em terapêutica bem estabelecida. A validação do desenvolvimento de células murinas B, no contexto de camundongos propensos a autoimunes, ou em camundongos com sistemas imunológicos modificados, é um componente crucial para desenvolver ou testar agentes terapêuticos em camundongos e é um uso apropriado da citometria de fluxo. Parâmetros citométricos de fluxo celular B bem estabelecidos podem ser usados para avaliar o desenvolvimento de células B no peritônio murina, medula óssea e baço, mas uma série de melhores práticas devem ser aderidas. Além disso, a análise citométrica de fluxo dos compartimentos de células B também deve complementar leituras adicionais do desenvolvimento de células B. Os dados gerados usando essa técnica podem promover nossa compreensão de modelos de camundongos propensos a doenças, autoimunes, bem como camundongos humanizados que podem ser usados para gerar anticorpos ou moléculas semelhantes a anticorpos como terapêuticas.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os anticorpos monoclonais têm se tornado cada vez mais a terapia de escolha para muitas doenças humanas à medida que se tornam parte da medicina convencional1,2. Descrevemos anteriormente camundongos geneticamente modificados que produzem anticorpos de forma eficiente abrigando regiões variáveis totalmente humanas com constantes de IgH de camundongos3,4. Mais recentemente, descrevemos camundongos geneticamente modificados que produzem moléculas semelhantes a anticorpos que têm antígeno-vinculativos distintos5. Anticorpos são secretados por células B e formam a base da imunidade humorativa adaptativa. Existem dois tipos distintos de células B, B-1 e B-2. Em mamíferos, as células B-1 originam-se no fígado fetal e são enriquecidas em tecidos mucosas e nas cavidades pleural e peritoneal após o nascimento, enquanto as células B-2 se originam no fígado fetal antes do nascimento e posteriormente na medula óssea (MMO). As células B-2 são enriquecidas em órgãos linfoides secundários, incluindo o baço e o sangue 6,7,8. No BM, progenitores hematopoiéticos B-2 começam a se diferenciar para células pró-B após o início do rearranjo da cadeia pesada Ig mu9,10. O rearranjo bem sucedido da cadeia pesada de Ig e sua montagem no receptor de células pré-B (pré-BCR), juntamente com sinalização e expansão proliferativa, leva à diferenciação das células pré-B. Depois que as células pré-B reorganizam suas cadeias leves Ig kappa (Igκ), ou se improdutivas, Ig lambda (Igλ), elas combinam com μ corrente pesada, resultando na expressão IgM BCR superficial. É importante ressaltar que a expressão superficial IgM é conhecida por ser reduzida em condições de autoreatividade, contribuindo assim para a auto tolerância em células B funcionalmente não respondidas ou argicasas11,12. As células B imaturas então entram em um estágio de transição, onde começam a co-expressar IgD e migram do BM para o baço. No baço, a expressão igD aumenta ainda mais e as células amadurecem em um segundo estágio de células B transitórias, seguidas pela conclusão de seu status de maturação e desenvolvimento em células de zona marginal (MZ) ou folicular (Fol)13,14,15. Em camundongos adultos, em um ambiente não doente, o número de células B maduras permanece constante, apesar de 10-20 milhões de células B imaturas serem geradas diariamente no BM. Destes, apenas 3% entram no pool de células B maduras. O tamanho do compartimento celular B periférico é limitado pela morte celular, devido em parte a vários fatores, incluindo auto-reatividade e maturação incompleta16,17,18. A análise citométrica de fluxo tem sido amplamente usada para caracterizar e enumerar muitos subcompartimentais de células imunes em humanos e camundongos. Embora existam algumas semelhanças entre compartimentos de células B humanas e murinas, este protocolo se aplica apenas à análise de células murinas B. Este protocolo foi desenvolvido com o propósito de fenotipar camundongos geneticamente modificados, para determinar se a manipulação genética alteraria o desenvolvimento de células B. A citometria de fluxo também tem sido extremamente popular em muitas aplicações adicionais, incluindo na medição da ativação celular, função, proliferação, análise de ciclo, análise de conteúdo de DNA, apoptose e classificação celular 19,20.

A citometria de fluxo é a ferramenta escolhida para caracterizar vários compartimentos de linfócitos em camundongos e humanos, inclusive em órgãos complexos como o baço, BM e sangue. Devido a reagentes de anticorpos específicos do rato amplamente disponíveis para citometria de fluxo, esta técnica pode ser usada para investigar não apenas proteínas da superfície celular, mas também fosfoproteínas intracelulares e citocinas, bem como leituras funcionais21. Aqui demonstramos como reagentes de citometria de fluxo podem ser usados para identificar subconjuntos de células B à medida que amadurecem e diferenciam em órgãos linfoides secundários. Após a otimização das condições de coloração, manuseio de amostras, configuração correta do instrumento e aquisição de dados e, finalmente, análise de dados, um protocolo para análise citométrica de fluxo abrangente do compartimento celular B em camundongos pode ser utilizado. Tal análise abrangente baseia-se em uma nomenclatura de décadas concebida por Hardy e colegas, onde o desenvolvimento de células BM B-2 pode ser dividido em diferentes frações (Fração) dependendo de sua expressão de B220, CD43, BP-1, CD24, IgM e IgD22. Hardy et al., mostraram que as células B220+ CD43 BM B podem ser subdivididas em quatro subconjuntos (Fração A-C') com base na expressão BP-1 e CD24 (30F1), enquanto as células B220+ CD43-(dim to neg) BM B podem ser resolvidas em três subconjuntos (Fração D-F) com base na expressão diferencial de IgD e IgM23 de superfície. A fração A (células pré-pró-B) são definidas como BP-1- CD24 (30F1)-, A fração B (células pro-B precoces) são definidas como BP-1- CD24 (30F1)+, Fração C (células pro-B tardias) são definidas como BP-1+ CD24 (30F1)+, e Fração C' (células pré-B precoces) são definidas como BP-1+ e CD24nenta. Além disso, as células Fração D (pré-B) são definidas como células B220+ CD43-IgM-B e Fração E (células B recém-geradas, combinação de imaturo e transitório) são definidas como células B220+ CD43- IgM+ B e Fraction F (células B maduras e recircuturas) são definidas como células B220high CD43- IgM+ B. Em contraste, a maioria das células B ingênuas encontradas no baço pode ser dividida em células B maduras (B220+ CD93-) e células transitórias (T1, T2, T3) dependendo da expressão de CÉLULAS CD93, CD23 e IgM. Células B maduras podem ser resolvidas em subconjuntos marginais e foliculares baseados na expressão de IgM e CD21/CD35, e subconjuntos foliculares podem ser ainda divididos em subconjuntos de células foliculares maduras tipo I e folicular tipo II B, dependendo do nível de sua expressão de superfície IgM e IgD24. Essas populações de células B esplênicas expressam predominantemente cadeia de luz Igκ. Finalmente, as populações de células B-1 B, que se originam no fígado fetal e são encontradas principalmente nas cavidades peritoneal e pleural de camundongos adultos, foram descritas na literatura. Estas células B peritoneal podem ser distinguidas das células B-2 B descritas anteriormente pela falta de expressão CD23. Eles são então subdivididos em populações B-1a ou B-1b, com o primeiro definido pela presença de CD5 e o segundo por sua ausência25. Progenitores de células B-1 são abundantes no fígado fetal, mas não são encontrados em BM adulto. Enquanto as células B-1a e B-1b são originárias de diferentes progenitores, ambas semearam as cavidades peritoneal e pleural24. Em contraste com as células B-2, as células B-1 são exclusivamente capazes de auto-renovação e são responsáveis pela produção de anticorpos IgM naturais.

Defeitos no desenvolvimento celular B podem surgir em muitos casos, incluindo deficiências nos componentes do BCR26,27, perturbações de moléculas de sinalização que impactam a força de sinalização BCR14,28,29, ou interrupção de citocinas que modulam a sobrevivência celular B30,31 . A análise da citometria de fluxo dos compartimentos linfoides contribuiu para a caracterização dos blocos de desenvolvimento de células B nesses camundongos e muitos outros. Uma vantagem da análise citométrica de fluxo dos compartimentos linfoides é que ele oferece a capacidade de fazer medições em células individuais obtidas a partir de tecido dissociado vivo. A disponibilidade de reagentes em uma gama cada vez maior de fluoroforos permite a análise simultânea de múltiplos parâmetros e permite a avaliação da heterogeneidade celular B. Além disso, a enumeração das células B por análise citométrica de fluxo complementa outros ensaios imunológicos, como métodos imunohistoquímicos que visualizam a localização celular dentro de órgãos linfoides, detecção de níveis de anticorpos circulantes como medida de imunidade humoral, bem como duas microscopia fótons para medir as respostas das células B no espaço real e no tempo32.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os estudos sobre camundongos foram supervisionados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Regeneron. O experimento foi realizado em tecidos de três camundongos C57BL/6J femininos (17 semanas de idade) dos Laboratórios Jackson. Titular todos os anticorpos antes de iniciar o experimento para determinar a concentração ideal. Ao usar contas de compensação para compensação de cor única, certifique-se de que elas colorem tão brilhantes ou brilhantes do que suas amostras. Mantenha todos os buffers, anticorpos e células no gelo ou a 4 °C. Após a adição de corante de viabilidade, realize todas as etapas e incubações a 4°C em luz baixa ou no escuro.

1. Colheita de células peritoneais e isolamento celular único

  1. Eutanize o mouse usando CO2 ou de acordo com o protocolo aprovado.
  2. Coloque o rato nas costas, pulverize com 70% de etanol, e corte a pele abdominal externa com uma tesoura, tomando cuidado para não cortar o peritônio.
  3. Injete 3 mL de tampão de lavagem gelada (0,5% de albumina de soro bovino (BSA) em DPBS [vol/vol]) na cavidade peritoneal com uma seringa de 3 mL equipada com uma agulha de calibre 25.
  4. Massageie suavemente o peritônio com as pontas dos dedos.
  5. Repita as etapas 1.3 e 1.4.
  6. Insira uma seringa de 3 mL equipada com uma agulha de 18 G através do peritônio, tomando cuidado para evitar órgãos e gordura.
  7. Extrair o tampão de lavagem, agora contendo células peritoneais, e transferir para tubo cônico de 15 mL no gelo.
  8. Repita as etapas 1.3 e 1.4.
  9. Faça um pequeno buraco no peritônio enquanto segura com pinças.
  10. Insira uma pipeta de transferência descartável no orifício e colete o tampão de lavagem restante, mais uma vez evitando gordura e órgãos.
  11. Transfira as células peritoneais remanescentes coletadas para o tubo cônico de 15 mL no gelo.
    NOTA: Descarte a amostra se a contaminação sanguínea for evidente.
  12. Incubar as células no gelo até que o baço e a extração óssea estejam completos.
  13. Centrifugar as células a 300 x g por 8 min a 4 °C. Aspire o supernatante.
  14. Resuspense a pelota da célula em 1 mL de tampão de lavagem.
  15. Filtre as células através de um coador de células de 70 μM em um tubo cônico limpo de 15 mL no gelo.
  16. Determine a concentração celular usando um instrumento de contador celular ou hemócito.

2. Colheita de baço e isolamento de célula única

  1. Coloque o rato em sua barriga e corte o peritônio na parte traseira esquerda usando uma tesoura limpa. Corte o baço, removendo gordura e tecido conjuntivo.
  2. Transfira o baço para um tubo de microcentrifusagem de 1,5 mL contendo 1 mL de tampão de lavagem no gelo.
  3. Incubar o baço no gelo até que a extração óssea esteja completa.
  4. Mova o baço para o tubo de dissociação automatizado com 5 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Coloque o tubo no instrumento dissociador do tecido e dissociar por 60 s para criar uma única suspensão celular.
    NOTA: Também é permitido usar outros métodos de rotina para obter suspensões de baço de célula única, como quebrar entre lâminas de vidro fosco no tampão de lavagem. Se for utilizado outro método de dissociação, siga a dissociação com centrifugação, aspiração e, em seguida, resuspensão em 5 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos antes de continuar a etapa 2.5.
  5. Incubar as células à temperatura ambiente por 3 minutos.
  6. Adicione 10 mL de tampão de lavagem de 4 °C contendo 2mM EDTA.
  7. Transfira para um tubo cônico limpo de 15 mL.
  8. Centrifugar as células a 300 x g por 8 min a 4 °C. Aspire o supernatante.
  9. Resuspenda a pelota da célula em 5 mL de tampão de lavagem de 4 °C.
  10. Filtre as células através de um coador de células de 70 μM em um tubo cônico limpo de 15 mL no gelo.
  11. Determine a concentração celular usando um instrumento de contador celular ou hemócito.

3. Colheita de BM e isolamento de célula única

  1. Remova a pele da metade inferior do corpo do rato. Corte o excesso de músculo da perna. Retire toda a perna com uma tesoura, tomando cuidado para não cortar o fêmur. Limpe o fêmur e a tíbia removendo o músculo, gordura e pés restantes.
  2. Transfira os ossos para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL contendo 1 mL de tampão de lavagem no gelo.
  3. Perfure o fundo de um tubo de microcentrifuuge de 0,5 mL, deixando um orifício pequeno o suficiente para os ossos das pernas não se projetarem. Insira o tubo de 0,5 mL em um tubo de microcentrifusagem de 1,5 mL limpo. Corte a extremidade do fêmur e da tíbia proximal até o joelho e coloque as extremidades de corte voltadas para baixo no tubo de 0,5 mL.
  4. Centrifugar as células a 6.780 x g por 2 min a 4 °C.
  5. Resuspenha a pelota celular em 1 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos e transfira para um tubo cônico de 15 mL contendo um adicional de 3 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos.
  6. Incubar em temperatura ambiente por 3 minutos.
  7. Adicione 10 mL de tampão de lavagem de 4 °C contendo 2mM EDTA.
  8. Centrifugar as células a 300 x g por 8 min a 4 °C. Aspire o supernatante.
  9. Resuspenda a pelota da célula em 3 mL de tampão de lavagem de 4 °C.
  10. Filtrar células através de um coador de células de 70 μM em um tubo cônico limpo de 15 mL no gelo.
  11. Determine a concentração celular usando um instrumento de contador celular ou hemócito.

4. Colori manchas de células e prepare compensação

  1. Alíquota 106 células de cada tipo de célula de cada animal para uma placa inferior 96 bem U.
    1. Certifique-se de incluir poços suficientes para todas as amostras e controles, incluindo mancha completa, fluorescência-menos-um (FMO), não manchada, e finalmente a compensação opcional de cor única para cada fluoróforo usado.
    2. Para o painel de maturação BM e o painel de maturação do baço, as células de alíquota em 2 poços, 106 células por poço, para cada amostra completa de manchas. Para os controles de viabilidade de compensação de uma cor única, adicione 2 x 106 células de cada tipo de célula a poços individuais.
  2. Centrifugar a placa a 845 x g por 2 min a 4 °C. Decante o supernatante invertendo rapidamente e sacudindo a placa sobre uma pia, tomando cuidado para não contaminar cruzmente os poços.
  3. Resuspensar as células em 200 μL de DPBS (sem BSA ou FBS). Este passo é importante para remover a proteína antes de colorir com corante de viabilidade amina-reativa.
  4. Repita as etapas 4.2 e 4.3.
  5. Repita o passo 4.2.
  6. Resuspend as células em 100 μL de diluição de corante de viabilidade diluído 1:1.000 em DPBS.
    NOTA: Se usar células para compensação de cor única, não adicione corante de viabilidade a esses poços.
    1. Para cada conjunto de manchas, deixe vários poços não manchados para uma amostra completamente inconteídia e quaisquer outros controles que você possa precisar.
    2. Para cada conjunto de manchas, deixe um poço adicional não manchado para o controle FMO de viabilidade.
    3. Para os controles de compensação de viabilidade de cor única: Resuspend as células 2 x 106 , aliquos na etapa 4.1, em 200 μL de corante diluído de viabilidade. Transfira 100 μL de células para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL, células de calor por 5 min a 65 °C e transfira os 100 μL de células mortas pelo calor de volta ao poço original com as células vivas restantes de 100 μL.
  7. Incubar células a 4 °C, protegidas da luz, por 30 minutos.
  8. Centrifugar a placa a 845 x g por 2 min a 4 °C. Decante o supernatante invertendo rapidamente e sacudindo a placa sobre uma pia, tomando cuidado para não contaminar cruzmente os poços.
  9. Resuspensar as células em 200 μL de DPBS (sem BSA ou FBS).
  10. Repita as etapas 4.8 e 4.9.
  11. Repita o passo 4.8.
  12. Resuspense as células em 50 μL de bloco Fc diluído 1:50 (concentração final=10 μg/mL) no tampão de manchas (0,5% BSA em DPBS [vol/vol]).
    1. Para células peritoneais - adicione também 5 μL de bloqueador de monócitos para reduzir a coloração não específica.
  13. Incubar as células a 4 °C, protegidas da luz, por 15 minutos.
  14. Prepare misturas completas de mestre de manchas e FMOs no tampão de manchas para um volume final de 100 μl por 106 células. Consulte a Tabela 1-Tabela 4 para as listas de anticorpos.
    NOTA: Os FMOs são feitos por incluir todos os anticorpos em um conjunto de manchas, exceto um. Prepare um FMO para cada anticorpo em um conjunto de manchas. Quando um conjunto de manchas contém vários corantes brilhantes, substitua 50 μL de tampão de manchas brilhante para tampão de manchas por amostra
  15. Sem remover o bloco Fc, adicione 100 μL de misturas de manchas completas e FMOs aos poços selecionados.
  16. Prepare controles de compensação de cores únicas para cada anticorpo em um conjunto de manchas.
    1. Se usar contas de compensação siga as instruções do fabricante para uso.
    2. Se usar células, adicione anticorpos titutados a 106 células, reservada anteriormente na etapa 4.6.1 sem corante de viabilidade, em tampão de manchas de 100 μL. Se todas as células da amostra forem positivas para um marcador específico, reserve células não manchadas para serem usadas ao adquirir dados de compensação no citómetro de fluxo.
  17. Incubar as células e as contas a 4 °C, protegidas da luz, por 30 minutos.
  18. Centrifugar a placa a 845 x g por 2 min a 4 °C. Decante o supernatante invertendo rapidamente e sacudindo a placa sobre uma pia, tomando cuidado para não contaminar cruzmente os poços.
  19. Resuspense as células e contas em 200 μL de tampão de manchas.
  20. Repita as etapas 4.18 e 4.19 duas vezes.
  21. Repita o passo 4.18.
  22. Para fixar as amostras para análise dentro de 48 h, resuspend células e contas em 200 μL de 2% paraformaldeído em DPBS.
    ATENÇÃO: O parafomaldeído é um sério risco à saúde e inflamável. Consulte a Folha de Dados Safty antes de usar.
  23. Incubar as células e as contas a 4 °C, protegidas da luz, por 30 minutos.
  24. Repita as etapas 4.18 e 4.19 duas vezes.
  25. Coloque uma placa de filtro sobre uma placa de fundo U limpa de 96 poços. Usando uma multi-pipeta, transfira cada amostra para um poço da placa do filtro.
  26. Centrifugar a placa do filtro-96 bem configuração de placa de fundo U a 845 x g para 2 min a 4 °C. Remova a placa do filtro e decante o supernatante invertendo rapidamente e movendo a placa sobre uma pia, tomando cuidado para não contaminar os poços.
  27. Para os painéis de maturação de BM e baço, resuspenja as células totalmente manchadas em 100 μL de tampão de manchas. Misture os 2 poços para cada animal em 1 bem. Resuspenque os painéis restantes, FMOs e controles em 200 μL de tampão de manchas.
  28. Incubar células fixas e contas a 4 °C, protegidas da luz, durante a noite.

5. Aquisição de dados citométricos de fluxo

  1. Inicialize e QC o citômetro de fluxo de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Carregue o modelo específico para cada painel.
  3. Antes de registrar dados, certifique-se de que todos os eventos para cada amostra estejam em escala e visíveis nas parcelas de pontos.
  4. Controle de compensação recorde para cada painel de manchas utilizando compensações de manchas únicas preparadas na etapa 4.16. Estabeleça portões positivos e negativos para cada amostra. Que o software calcule a matriz de compensação.
  5. Comece a adquirir a primeira amostra e certifique-se de que os portões sejam definidos adequadamente.
  6. Defina a máquina para gravar pelo menos 50.000 eventos de células B para o painel de células B peritoneal e o painel de baço Igκ e Igλ; Eventos de células B de 150.000 para o painel de maturação BM; e 300.000 eventos de células B para o painel de maturação do baço.
  7. Para cada painel de manchas, execute e regise as amostras totalmente manchadas para cada animal, uma amostra não manchada e as FMOs.

6. Analisar dados

  1. Prossiga com a análise de dados usando o software de análise de citometria de fluxo. Siga as estratégias de gating descritas na Figura 1, Figura 2, Figura 3,Figura 4. 

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui apresentamos a estratégia de gating para caracterizar o desenvolvimento de células B no peritônio do rato, BM e baço. A base da análise é formada em torno do conceito de coloração com corante viável, em seguida, gating out doublets com base nas características de Forward-Scatter-Area (FSC-A) e Forward-Scatter-Height (FSC-H), e finalmente gating out detritos selecionando células de acordo com suas características FSC-A e Side-Scatter-Area (SSC-A), referidos aqui como o portão de taman...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A análise citométrica do fluxo de tecidos linfoides e não linfoides permitiu a identificação e enumeração simultânea de sub-populações de células B em camundongos e humanos desde a década de 1980. Tem sido usado como uma medida de imunidade humoral e pode ser aplicado ainda mais para avaliar a funcionalidade de células B. Este método aproveita a disponibilidade de reagentes para avaliar diferentes estágios de maturação celular B em camundongos e humanos, por meio da análise simultânea de múltiplos parâmetros que permitem...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os autores são funcionários e acionistas da Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos matthew Sleeman pela leitura crítica do manuscrito. Agradecemos também aos departamentos do Vivarium Operations and Flow Cytometry Core da Regeneron por apoiarem esta pesquisa.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos Eppendorf de 0,5 mL com trava segura Eppendorf 22363611tubo de microcentrífuga de 0,5 mL
Tubos Eppendorf de 1,5 mL Eppendorf 22364111Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL
Tubos Falcon de 15 mL Corning 352097Tubo cônico de 15 mL
Agulha de calibre 18BD305196
Agulha de calibre 25BD 
seringa de 3 mLBD309657
70 mM MACS SmartStrainer Miltenyi Biotec 130-110-916Filtro de células de 70 mM
Placa inferior em U de 96 poçosVWR10861-564
ACK tampão de lise GIBCO tampão delise de glóbulos vermelhos
A1049201 Acroprep Advance 96 Placa de filtro de poçoPall Corporation8027placa de filtro
B220eBiosciences17-0452-82
BD CompBead Anti-Mouse Ig/κContascompensaçãoBD 552843
BD CompBead Anti-Rato Ig/κContasde compensação BD 552844Albumina
de Soro BovinoSigma-Aldrich A8577BSA
BP-1BD740882
tampão de manchas brilhanteBD566349tampão de manchas brilhante
C-KitBD564011
CD11bBD563168
CD11bBioLegend101222
CD19BD560143
CD21 / 35BD
CD23 BD740216
CD24 (HSA)BioLegend138504
CD3BD561388
CD3BioLegend100214
CD43BD553270
CD43BioLegend121206
CD5BD563194
CD93BD740750
CD93BioLegend136504
DPBS (1x)ThermoFisher14190-144DPBS
eBioscience Corante de viabilidade fixável eFluor 506ThermoFisher65-0866-14corante de viabilidade
Pipeta de transferência de ponta fina estendidaSamco233pipeta de transferência descartável
FACSymphony A3 citômetro de fluxoBDpedido personalizadocitômetro de fluxo
Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2)BD553142Fc block
FlowJoFlowjosoftware de análise de citômetro de fluxo
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-096-334Tubo de Dissociação Automatizado 
gentleMACS Octo Dissociator com Aquecedores Miltenyi Biotec 130-095-937instrumento dissociador de tecido
GR1 (Ly6C / 6G)BioLegend108422
IgDBioLegend405710
IgMeBiosciences25-5790-82
KappaBD550003
LambdaBioLegend407308
paraformaldeído, 32% de elétronde solução Microscopy Sciences15714
Ter119BioLegend116220
Bloqueador de Monócitos de Manchas VerdadeirasBioLegend426103bloqueador de monócitos
UltraPure EDTA, pH 8.0ThermoFisher15575038EDTA
Vi-CELL XRBeckman Coulter731050instrumento contador de células 
305124 de 562756

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins. Clinical Medicine. 17 (3), London. 220(2017).
  2. Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).
  3. Macdonald, L. E., et al. Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5147-5152 (2014).
  4. Murphy, A. J., et al. Mice with megabase humanization of their immunoglobulin genes generate antibodies as efficiently as normal mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5153-5158 (2014).
  5. Macdonald, L. E., et al. Kappa-on-Heavy (KoH) bodies are a distinct class of fully-human antibody-like therapeutic agents with antigen-binding properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 292-299 (2020).
  6. Pieper, K., Grimbacher, B., Eibel, H. B-cell biology and development. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131 (4), 959-971 (2013).
  7. Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nature Reviews: Immunology. 6 (2), 107-116 (2006).
  8. Lund, F. E. Cytokine-producing B lymphocytes-key regulators of immunity. Current Opinion in Immunology. 20 (3), 332-338 (2008).
  9. Martensson, I. L., Keenan, R. A., Licence, S. The pre-B-cell receptor. Current Opinion in Immunology. 19 (2), 137-142 (2007).
  10. von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14-20 (2010).
  11. Goodnow, C. C., et al. Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice. Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).
  12. Zikherman, J., Parameswaran, R., Weiss, A. Endogenous antigen tunes the responsiveness of naive B cells but not T cells. Nature. 489 (7414), 160-164 (2012).
  13. Melchers, F. Checkpoints that control B cell development. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2203-2210 (2015).
  14. Henderson, R. B., et al. A novel Rac-dependent checkpoint in B cell development controls entry into the splenic white pulp and cell survival. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 837-853 (2010).
  15. Pillai, S., Cariappa, A. The follicular versus marginal zone B lymphocyte cell fate decision. Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 767-777 (2009).
  16. Shahaf, G., Zisman-Rozen, S., Benhamou, D., Melamed, D., Mehr, R. B. Cell Development in the Bone Marrow Is Regulated by Homeostatic Feedback Exerted by Mature B Cells. Frontiers in Immunology. 7, 77(2016).
  17. Nemazee, D. Mechanisms of central tolerance for B cells. Nature Reviews: Immunology. 17 (5), 281-294 (2017).
  18. Petkau, G., Turner, M. Signalling circuits that direct early B-cell development. Biochemical Journal. 476 (5), 769-778 (2019).
  19. McKinnon, K. M. Flow Cytometry: An Overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-5 (2018).
  20. Betters, D. M. Use of Flow Cytometry in Clinical Practice. Journal of the Advanced Practioner in Oncology. 6 (5), 435-440 (2015).
  21. Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews: Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
  22. Van Epps, H. L. Bringing order to early B cell chaos. Journal of Experimental Medicine. 203 (6), 1389(2006).
  23. Hardy, R. R., Carmack, C. E., Shinton, S. A., Kemp, J. D., Hayakawa, K. Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 173 (5), 1213-1225 (1991).
  24. Allman, D., Pillai, S. Peripheral B cell subsets. Current Opinion in Immunology. 20 (2), 149-157 (2008).
  25. Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews: Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
  26. Kitamura, D., Roes, J., Kuhn, R., Rajewsky, K. A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene. Nature. 350 (6317), 423-426 (1991).
  27. Keenan, R. A., et al. Censoring of autoreactive B cell development by the pre-B cell receptor. Science. 321 (5889), 696-699 (2008).
  28. Chan, V. W., Meng, F., Soriano, P., DeFranco, A. L., Lowell, C. A. Characterization of the B lymphocyte populations in Lyn-deficient mice and the role of Lyn in signal initiation and down-regulation. Immunity. 7 (1), 69-81 (1997).
  29. Zikherman, J., Doan, K., Parameswaran, R., Raschke, W., Weiss, A. Quantitative differences in CD45 expression unmask functions for CD45 in B-cell development, tolerance, and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 3-12 (2012).
  30. Miyamoto, A., et al. Increased proliferation of B cells and auto-immunity in mice lacking protein kinase Cdelta. Nature. 416 (6883), 865-869 (2002).
  31. Mecklenbrauker, I., Kalled, S. L., Leitges, M., Mackay, F., Tarakhovsky, A. Regulation of B-cell survival by BAFF-dependent PKCdelta-mediated nuclear signalling. Nature. 431 (7007), 456-461 (2004).
  32. Okada, T., et al. Antigen-engaged B cells undergo chemotaxis toward the T zone and form motile conjugates with helper T cells. PLoS Biology. 3 (6), 150(2005).
  33. Robinson, J. P. Flow Cytometry. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , 630-640 (2004).
  34. Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77 (7), 705-713 (2010).
  35. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584(2017).
  36. Bigos, M. Separation index: an easy-to-use metric for evaluation of different configurations on the same flow cytometer. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1 Unit 1 21(2007).
  37. Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B. B cells and autoimmunity. Current Opinion in Immunology. 23 (6), 721-731 (2011).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Citometria de FluxoC lulas B MurinasMedula sseaBa oPerit nioControles de Compensa oTamp o de Colora oCorante de ViabilidadeBloqueador de FC

Artigos relacionados