Medição dinâmica e imagem de capilares, arterioles e pericias em coração de rato

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para estudar a microcirculação coronária no tecido cardíaco murino vivo por ex vivo monitoramento da pressão e fluxo de perfusão arterial que mantém a pressão, bem como componentes de árvores vasculares, incluindo os leitos capilares e pericitos, já que a artéria septal é canulada e pressurizada.

Resumo

O tom arterial coronário, juntamente com a abertura ou fechamento dos capilares, determinam em grande parte o fluxo sanguíneo para cardiomiócitos com pressão constante de perfusão. No entanto, é difícil monitorar as mudanças dinâmicas das artérias coronárias e dos capilares em todo o coração, principalmente devido ao seu movimento e espancamento sem parar. Aqui descrevemos um método que permite o monitoramento da taxa de perfusão arterial, pressão e as alterações de diâmetro das artérias e capilares nos músculos papilares ventriculares do mouse direito. A artéria septal do rato é cânulada e perfundida em um fluxo ou pressão constante com a outra medida dinamicamente. Após a perfusão com uma lectina fluorescente (por exemplo, Alexa Fluor-488 ou -633 rotulada de Agglutinina-Germe de trigo, WGA), as arterioles e capilares (e outros vasos) no músculo papilar e septo papirlículo do ventrículo direito podem ser prontamente imagens. As alterações do diâmetro do vaso poderiam então ser medidas na presença ou ausência de contrações cardíacas. Quando proteínas fluorescentes geneticamente codificadas foram expressas, características específicas poderiam ser monitoradas. Por exemplo, pericítos foram visualizados em corações de camundongos que expressavam NG2-DsRed. Este método forneceu uma plataforma útil para estudar as funções fisiológicas dos pericítos capilares no coração. Também é adequado para estudar o efeito dos reagentes no fluxo sanguíneo no coração, medindo o diâmetro vascular/capilar e a pressão luminal arterial simultaneamente. Esta preparação, combinada com um sistema de imagem óptica de última geração, permite estudar o fluxo sanguíneo e seu controle a nível celular e molecular no coração em condições quase fisiológicas.

Introdução

A regulação adequada do fluxo de pressão coronariana garante o suprimento sanguíneo suficiente ao coração para atender às suas demandas metabólicas¹. No entanto, só recentemente ficou claro como o fluxo de pressão coronária é dinamicamente regulado no coração, apesar de extensos estudos que têm sido realizados in vivo e in vitro nas últimas décadas. Uma das razões é a dificuldade em estabelecer um modelo de trabalho fisiológico para tais estudos devido à constante batida do coração. Independentemente disso, uma variedade de métodos foram estabelecidos para a observação dos micro-vasos coronários em tecidos ou animais vivos, mas nenhum desses mé....

Protocolo

Todos os cuidados com animais estavam de acordo com as diretrizes da Universidade de Maryland Baltimore e o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais aprovou protocolos.

1. Preparação das soluções

NOTA: Prepare as soluções com antecedência. Dois tipos de soluções básicas são utilizadas nos experimentos: (1) soluções fisiológicas de soro fisiológico (PSS) para superfusato de banho e (2) soluções de Tyrode para o perfusato de lúmen. O borbulhamento contínuo com CO₂ é necessário para manter o pH do PSS. A solução de Tyrode tamponada pelo HEPES é usada no lúmen em vez de PSS para evitar que bolhas en....

Resultados

Quando um marcador vascular de fluorescência é perfumado em lúmen vascular (aqui WGA conjugado com Alexa Fluor-488), é possível visualizar árvores vasculares inteiras como mostrado na Figura 5 (painel esquerdo) usando microscópio confocal de alta velocidade. A ampliação adicional permite a imagem capilar em detalhes(Figura 5, Painel Direito). Uma vez que o sistema pressurizado suporta um monitoramento constante da pressão luminal, esta preparação pode ser usada .......

Discussão

No presente trabalho, introduzimos um método ex vivo notavelmente simples, mas altamente prático, para estudar a microcirculação coronariana no coração em condições fisiológicas. Este método foi modificado a partir de investigações mecânicas utilizando ratos². A adição desafiadora foi a tecnologia de imagem com alta velocidade e alta resolução óptica. Nós, portanto, fomos capazes de aproveitar os sistemas avançados de imagem óptica que agora estão disponíveis comercialmente. Através da dissecção c.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 M CaCl2 solução	MilliporeSigma, EUA	21115
1 M MgCl2 solução	MilliporeSigma, EUA	M1028
AxoScope software	Molecular Devices, San Jose, CA, EUA
Chiller/incubadora de água	FisherScientific, EUA	Isotemp 3016S
Confocal	Nikon Instruments, EUA	A1R
Tubulação de vidro personalizada	Drummond Scientific Company	9-000-3301
Digidata 1322A	Molecular Devices, San Jose, CA, EUA
Microscópio de dissecação	Olympus, Japão	SZX12
Endothelin-1	MilliporeSigma, EUA	E7764
Fórceps	Fine Scientific Tools	11295-51
Heparina Sódica Sal	Sigma-Aldrich, EUA	H3393
Aquecedor de solução em linha	Warner Istruments, Hamden, CT, EUA	SH-27B
Isoflurano	VETone, Idaho, EUA	Extrator de
	Sutter Instruments, Novato, CA, EUA	P-97
Suporte de micropipeta/cânula	Warner Istruments, Hamden, CT, EUA	64-0981
Camundongo transgênico NG2DsRedBAC	The Jackson Laboratory	#008241
Fio de nylon para amarrar vasos sanguíneos	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	THR-G
PDMS (polidimetilsiloxano)	SYLGARD, Germantown, WI, USA	184 SIL ELAST KIT
Bomba peristáltica	Gilson, Middleton, WI, USA	minipuls 3
Pressure Servo Controlador	de Instrumentação de Sistemas Vivos, Burlington, Vt, EUA	PS-200-S
Tesoura	Fine Scientific Tools, Foster City, CA, EUA	15000-10
Instrumentação de Sistemas Vivos de Bomba Servo	, Burlington, Vt, EUA	PS-200-P
Controlador de temperatura	Warner Instruments, Hamden, CT, EUA	TC-324B
Aglutinina de Gérmen de Trigo, Alexa Fluor 488 Conjugado	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA EUA	W11261

micropipeta 502017