Um modelo de loop hemodinâmico in vitro para investigar a hemocitocompatibilidade e ativação celular hospedeira de dispositivos médicos vasculares

O teste de hemocompatibilidade de dispositivos médicos é um passo crucial no desenvolvimento de novos dispositivos, como stents vasculares ou tubos de perfusão para oxigenação de membrana extracorpórea. Até hoje, os modelos animais são considerados como ferramentas padrão para finalizar o procedimento de teste dos dispositivos médicos antes de sua implementação em humanos. A partir de agora, é necessário encontrar modelos in vitro alternativos que ajudem ainda mais na minimização das investigações sobre animais. Neste estudo, temos explorado, portanto, um modelo de loop hemodinâmico in vitro em miniatura. O objetivo deste método apresentado é testar a compatibilidade sanguínea in vitro dos dispositivos médicos de acordo com a norma ISO 10993-4.

O padrão ISO 10993-4 descreve conjuntos padronizados de parâmetros clínicos a serem investigados na amostra de sangue¹. Resumidamente, são trombose (agregação e contagem de plaquetas), coagulação (fibrinopeptídeo A, FPA), análise hematológica (contagem completa de células sanguíneas), índice de hemolise (hemoglobina plasmática livre) e sistema de complementação (complexo terminal de complemento, sC5b9). No entanto, marcadores adicionais, como elastase polimorfonuclear de neutrófilo (PMN), interleucina 6 (IL-6) e fator de necrose tumoral - alfa (TNF) refletindo o estado de ativação dos leucócitos também podem ser contabilizados para as medições. Para determinar e quantificar as proteínas livres de células circulantes presentes no plasma de sangue, o ensaio imunosorbente ligado ao sanduíche (ELISA) representa um método convencional e mais confiável^2,3. Da mesma forma, o fenotipo e o status de ativação das células hospedeiras (por exemplo, leucócitos) podem ser quantificados detectando a expressão da superfície celular das moléculas por citometria de fluxo (FACS) que fornece leituras baseadas em suspensão celular única, onde anticorpos específicos rotulados fluorescentes se ligam às moléculas de superfície celular alvo⁴. A microscopia eletrônica de varredura (SEM) também é recomendada para determinar a formação de trombos no material testado pelo padrão ISO 10993-4¹. Este método pode ser complementado com microtomografia de raios-X (μCT), para realizar análises estruturais do trombo, por exemplo, sua espessura, tamanho e localização em uma imagem renderizada 3D⁵.

A lógica por trás do uso desse modelo hemodinâmico in vitro é a triagem para os dispositivos médicos de melhor desempenho e compatíveis, entendendo a dinâmica fisiológica básica dos componentes sanguíneos, como plaquetas, que estão envolvidos na hemostase primária ou leucócitos e sua interação com diferentes tipos de dispositivos vasculares. Tais sistemas in vitro são altamente demandados, pois reduzem a necessidade de estudos em animais.

O modelo de loop aqui apresentado atende a essas exigências. Este modelo foi descrito pela primeira vez por A.B. Chandler em 1958 para a produção de trombo de sangue e é, portanto, também chamado chandler loop modelo⁶. Até agora, este modelo tem sido usado em uma série de experimentos e modificações para investigar a biocompatibilidade sanguínea dos dispositivos médicos^{7,8,9,10,11,12,13,14}. Consiste em tubos de polímero, que são parcialmente preenchidos com sangue e moldados em laços re-closable. Estes laços giram em um banho de água controlado pela temperatura para simular condições de fluxo vascular com seus efeitos hemorheológicos. Métodos alternativos como modelos ou modelos acionados por bombas que usam válvulas mecânicas de esfera dentro das alças para induzir um fluxo sanguíneo dentro dos tubos de polímero já foram descritos^15,16. No entanto, a vantagem geral do método aqui apresentado é que a força mecânica aplicada às células sanguíneas e proteínas é baixa, evitando a hemólise, e não há contato entre sangue e conectores, o que poderia possivelmente levar a turbulências de fluxo e ativação de componentes sanguíneos. Os principais fatores de ativação dentro do loop são o próprio material de teste e o ar que está preso dentro. Isso ajuda a minimizar as fontes de erro de medição e a fornecer uma alta reprodutibilidade, mesmo que a interface sangue-ar possa levar à desnaturação proteica¹⁷. Também é possível investigar variedades de materiais de tubulação e diâmetros de stent sem restrições de comprimento ou tamanho, permitindo assim o uso de tubos de diferentes comprimentos e diâmetro interno. Além disso, hemocompatibilidades hospedeiras sobre fechamento de loop impreciso e exposição à superfície do tubo não revestida também são possíveis de investigar. Outras aplicações médicas similares deste modelo de loop hemodinâmico in vitro é que ele também pode ser usado para estudar as interações entre imunoterapêuticas (drogas) e componentes sanguíneos durante o desenvolvimento pré-clínico ou triagem individual de segurança de drogas antes do primeiro teste clínico da fase I, ou para a geração de material thrombus que pode ser usado em experimentos adicionais^18,19,20.

Este estudo descreve um protocolo detalhado para testar as hemocompatibilidades de tubos de perfusão e/ou stents. Aqui, a comparação entre tubos de PVC não revestidos e revestidos (hepPVC: revestimento de heparina, poliPVC: revestimento com polímero bioativo). A ativação reduzida das plaquetas, mas uma maior ativação do sistema de coagulação (FPA) foi encontrada para ambos os tubos revestidos em comparação com os tubos não revestidos. Os tubos de hepPVC utilizados aqui são modificados com heparina covalentemente ligada para torná-los tromboressistentes²¹ e já foram empregados em um modelo de loop para otimizar e caracterizar diferentes parâmetros²². Os tubos de polipvc utilizados neste estudo são tubos comercialmente disponíveis usados em ambientes clínicos de perfusão sanguínea extracorpórea e são revestidos com um polímero de heparina para reduzir sua trombogenicidade²³. Às vezes, em aplicações clínicas até mesmo tubos de PVC não revestidos são usados. Por isso, incluímos tubos de látex como um grupo de controle positivo que mostrou ativação excessiva de plaquetas, sistema de coagulação e fatores solúveis como IL-6, TNF e PMN elastase. A formação de trombos foi notada quando o fechamento de loop impreciso foi simulado. Isso levou à ativação do sistema de coagulação e complementação, bem como leucócitos e plaquetas em comparação com as condições da linha de base. Além disso, o contato sanguíneo com o material de stent aqui usado (stent nitinol metálico nu, coberto com politetrafluoroetileno expandido impregnado de carbono) levou a uma maior ativação de plaquetas e leucócitos em termos de elastase PMN. No geral, o modelo apresentado não induziu hemólise em nenhum dos dispositivos vasculares testados, pois eram comparáveis às condições básicas ou estáticas, exceto os tubos de látex, onde a hemolise de glóbulos vermelhos (RBC) era óbvia. Além disso, esses tubos de perfusão podem ser examinados por imagem ou por histologia. Embora as avaliações histológicas possam ser viáveis, focamos principalmente na ELISA e na citometria de fluxo para realizar esses experimentos e, assim, possibilitando a viabilidade da realização de experimentos baseados no modelo aqui apresentado para muitos laboratórios. Assim, este método representa um método viável para testar a biocompatibilidade sanguínea dos dispositivos médicos vasculares de acordo com as recomendações da norma ISO 10993-4. Além disso, este método pode ser utilizado sempre que uma interação entre sangue e materiais deve ser testada em condições de fluxo, imitando as condições in vivo.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da faculdade de medicina do Hospital Universitário Magdeburg (aplicação número 88/18) e os sujeitos forneceram consentimento por escrito informado antes do procedimento de coleta de sangue.

1. Preparação do estoque de heparina e amostragem de sangue

1. Calcule a quantidade de sangue necessária para todos os experimentos.
   NOTA: Quase, 5 mL de sangue heparinizado são necessários para cada dispositivo vascular em duplicatas (loops). Da mesma forma, 5 mL de sangue são necessários para cada condição de base e estática que é mantida de lado à temperatura ambiente.
2. Prepare uma solução de estoque de heparina na concentração de 100 UI/mL diluindo a heparina não fratizada (por exemplo, Rotexmedia) em água desionizada. Use 150 μL desta solução para a heparinização de 10 mL de sangue fresco.
3. Calcule a quantidade de sangue, bem como plasma que são necessários para a contagem total de células sanguíneas, ensaios ELISA e FACS.
   NOTA: As medidas representadas neste estudo são obtidas a partir de duas alças em paralelo (uma como duplicada) com um volume sanguíneo total de 10 mL.
4. Com base na quantidade necessária de sangue, encha 10 mL de seringas com 150 μL de solução de estoque de heparina para evitar a coagulação sanguínea com uma concentração final de heparina de 1,5 UI/mL de sangue.
5. Tirar sangue usando uma borboleta (tamanho: 21 G). Encha as seringas muito suavemente para evitar hemólise ou ativação celular devido ao vácuo excessivo.
   NOTA: A permissão do comitê de ética local deve ser obtida antes do início dos experimentos. Obter consentimento informado de cada doador de sangue humano. Certifique-se de que o doador de sangue é saudável e não toma nenhum medicamento, especialmente nenhum antiplaquelho ou anti-inflamatório não esteroide por pelo menos 10 dias antes dos experimentos. Note-se que o mesmo doador é preferido ao comparar diferentes tipos de dispositivos vasculares pela primeira vez como apresentado neste manuscrito. Para avaliar melhor as diferenças entre indivíduos, o protocolo pode ser repetido com diferentes doadores.
6. Coletar sangue em um copo de vidro, evitar agitação excessiva.

2. Montagem in vitro de loop hemodinâmico

1. Encha o banho de água até que o nível da água chegue até o centro da unidade de rotação. Atee a temperatura da água para 37 °C.
2. Montagem de loop para testar diferentes materiais de tubulação (polyPVC, hepPVC, PVC e látex)
   1. Corte dois pedaços de 50 cm de comprimento de cada material do tubo (diâmetro interno 5 mm) com o cortador de tubo. Certifique-se de que a superfície de corte é plana, pois isso é particularmente importante para o fechamento perfeito para os laços com diâmetros pequenos para que o sangue flua sem qualquer distorção na borda de montagem.
      NOTA: Este protocolo inteiro utiliza os tubos com diâmetro interno de 5 mm.
   2. Para facilitar o manuseio e evitar o atraso no processamento pós-amostra após a rotação, execute apenas quatro loops (2 materiais em duplicatas) em paralelo.
   3. Para gerar uma forma de loop, conecte as terminações abertas dos tubos em um pequeno pedaço de tubo de silício que encaixe o diâmetro externo do tubo investigativo.
   4. Use as faixas de tensão de policarbonato para garantir o fechamento adequado das alças. Quando usado pela primeira vez, ajuste o comprimento das bandas para encaixar o diâmetro externo da alça, cortando a faixa de tensão com uma tesoura nos comprimentos necessários e fixá-la com uma chave de torque de 3 mm.
   5. Aperte cuidadosamente o parafuso de travamento do conector da banda de tensão sob inspeção das terminações do tubo. Ajuste a força de fechamento para que não fique uma lacuna entre as terminações do tubo. Se o parafuso de bloqueio estiver totalmente apertado e a tensão da faixa de policarbonato parecer muito baixa para fechar a lacuna entre as terminações do tubo, abra o bloqueio do sistema e corte alguns mm da faixa de tensão. Repita isso, até que o fechamento preciso do loop seja alcançado(Figura 1A).
   6. Se o material de tubulação for muito macio e tende a escorregar dentro das faixas de tensão, fixe o laço com fita elétrica na faixa de tensão(Figura 1B,C).
   7. Prepare um loop adicional de PVC para controle de temperatura com as mesmas dimensões dos loops de teste.
   8. Fixar as voltas no berço de loop da unidade de rotação fora do banho de água. Posteriormente, conecte o suporte de laço à unidade de rotação dentro do banho de água(Figura 1E).
   9. Desmonte a faixa de tensão em parte dos loops e desligue uma extremidade de cada tubo para abrir o laço.
   10. Preencha suavemente cada laço com 5 mL de sangue com uma pipeta sorológica de 5 mL. Misture o sangue suavemente duas vezes no copo de vidro, estonteantemente para cima e para baixo antes de carregar nas alças.
   11. Pegue o termômetro descartável e coloque-o dentro do laço de controle de temperatura. Se o termômetro for muito grande, corte-o com uma tesoura para caber tubos menores. Encha o laço com 5 mL de água deionizada à temperatura ambiente.
   12. Feche os loops e certifique-se se os laços, as faixas de tensão e o rack estão devidamente encaixados.
   13. Defina a velocidade de rotação para 30 rodadas por minuto (rpm) e gire por 3h.
3. Montagem de loop para testar o impacto do fechamento de loop inadequado (gap)
   1. Prepare quatro loops (polyPVC) conforme descrito em 2.2.
   2. Feche dois dos loops corretamente com as faixas de tensão e evite qualquer lacuna entre as terminações do tubo.
   3. Para os outros dois loops conecte as terminações abertas no tubo maior, como descrito em 2.2.3, mas deixe uma lacuna de 1-2 mm entre as terminações de loop. Não use as faixas de tensão para estes loops(Figura 1D).
   4. Prepare um loop de controle de temperatura conforme descrito em 2.2.7 e 2.2.11.
   5. Encha todos os laços com sangue como descrito em 2.2.10.
   6. Defina a velocidade de rotação para 30 rpm e gire por 3h.
4. Montagem de loop para testes de stent
   1. Prepare quatro loops como descrito em 2.2 e a seguir.
      NOTA: Para avaliar a biocompatibilidade sanguínea dos stents, o material de tubulação em si deve ser testado como biocompatível para evitar a mascaramento da ativação celular. Se não houver dados, o material do tubo em si pode ser testado conforme descrito em 2.2. Além disso, a faixa de diâmetro dentro do stent pode ser aplicada (veja as instruções do fabricante) e deve se encaixar no diâmetro interno do material do tubo.
   2. Abra dois loops e tire o tubo do sistema de banda de tensão.
   3. Insira o stent no meio do tubo de acordo com as instruções do fabricante.
   4. Use os outros dois loops sem stent como controle. Encha todos os laços com sangue como descrito em 2.2.10.
   5. Defina a velocidade de rotação a 30 rpm e gire por 3h.
5. Controle de temperatura
   1. A qualquer momento durante a duração e quando a rotação é interrompida, a temperatura do sangue dentro das alças é indicada pelo termômetro dentro do circuito de controle de temperatura. Para ler a temperatura, pare a rotação e leia imediatamente a temperatura indicada pelo termômetro.

3. Processamento de amostras de sangue

1. Após a rotação, deixe os loops ficarem no rack por 2 minutos em uma posição ascendente para deixar o sangue acumular na parte inferior das alças, evitando qualquer derramamento durante a abertura dos loops.
2. Inspecione o sangue deixado para condições estáticas: Se este sangue for coagulado, suspeita-se de uma heparinização inadequada. Neste caso, repita o experimento de preferência também com outro doador de sangue.
3. Tire cuidadosamente os laços do rack. Abra os conectores e deixe o sangue fluir em um copo de vidro de 10 mL.
4. Acumule o sangue dos tubos que são executados em duplicatas.
5. Extrair sangue fresco para análise de linha de base do mesmo doador descrito em 1,5 e 1,6.
6. Coleta de sangue citrato de sódio
   1. Para a coleta de sangue citrato de sódio, encha quatro tubos de 1,5 mL, cada um com uma solução de citrato de sódio de 111 μL coletada a partir de tubos de citrato de sódio, para gerar uma concentração final de 3,2% de citrato de sódio.
   2. Encha cada tubo com 1 mL de sangue dos béquers de vidro, conforme descrito em 1,6 e 3,3.
   3. Mantenha o sangue em temperatura ambiente e use este sangue para análises FACS, conforme descrito em 12.
      NOTA: Para alterar o comprimento dos loops para diferentes configurações experimentais, planeje corretamente as alíquotas com base na quantidade de medições a serem feitas. Pode ser necessário estabelecer todas as medidas necessárias com sangue fresco antes dos experimentos reais para garantir que o volume de sangue nos laços seja suficiente para todas as medidas.
7. Coleta de amostras de sangue e plasma de ácido e plasma de etilenodiaminetetraactic (EDTA).
   1. De cada béquer de vidro com sangue (ver 1,6 e 3,3) transfira 4,5 ml de sangue em um tubo EDTA de 5 ml. Encha dois tubos EDTA de cada béquer de vidro de 10 ml com sangue.
   2. Misture suavemente o sangue e mantenha-o no gelo.
   3. Transfira 2 mL de sangue para um tubo de centrifugação de bloqueio de 2 mL e use este sangue para contagem de células sanguíneas e medição de hemoglobina livre, conforme descrito em 5. E 6.
   4. Centrifugar o sangue restante a 3.500 x g por 20 min.
   5. Colete cuidadosamente o plasma no supernatante em alíquotas de 500 μL e congele imediatamente a -80 °C.

4. Digitalizar imagens de microscopia eletrônica e μCT

1. Após o processamento da amostra de sangue, enxágue as alças esvaziadas preparadas como descrito em 2,3 com 10 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) cada.
2. Corte cuidadosamente uma amostra de 1 cm de comprimento de cada extremidade de cada tubo com um bisturi.
3. Incubar a amostra durante a noite a 4 °C em uma solução de glutaraldeído de 2%.
   ATENÇÃO: A inalação de vapores de aldeído pode causar sintomas nasais, como um entupiço persistente do nariz escorrendo e irritação das vias aéreas, e o contato com a pele causa dermatite. Aldeídos devem ser manuseados em um capuz de fumaça enquanto usam luvas, um vestido de proteção e óculos de segurança.
4. Enxágüe a amostra (3 vezes) com PBS.
5. Prepare uma solução de 1% de tetroxida de ósmio (OsO₄) em água deionizada e incubar a amostra por 15 minutos à temperatura ambiente.
   ATENÇÃO: O OsO₄ é um agente oxidante forte, pode ser reduzido pela exposição à luz. Para evitar a redução durante a preparação, armazene o OsO₄ em uma garrafa de vidro marrom. OsO₄ é extremamente volátil, seus vapores são tóxicos para os olhos, nariz e garganta. Sempre trabalhe sob um capô de fumaça e use luvas e protegendo roupas, garantindo que nenhuma parte do corpo seja exposta ao OsO₄. Entre em contato com as diretrizes da sua instituição sobre o manuseio e armazenamento de resíduos. Em geral, o OsO₄ é armazenado por vários meses, mas precisa de garrafas de vidro especiais com forro Teflon e um dessecador, pois o OsO₄ pode descolorir superfícies internas e conteúdos da geladeira na presença de fumaça vazando.
6. Pegue amostras, transfira-as em novos tubos de centrífugas de 15 mL e enxágue amostras 3 vezes com PBS.
7. Prepare uma série de etanol com concentrações variadas (25%, 50%, 75%, 95%, 100%)
8. Desidratar amostras no etanol: incubar por 20 min cada em 25%, 50%, 75% e 90% e 30 min em 100%.
9. Pegue amostras de 100% de etanol e deixe o ar seco durante a noite à temperatura ambiente.
10. Examine amostras no microscópio eletrônico de varredura a uma tensão de aceleração de 5 kV e com o scanner de raios-X μCT.

5. Contagem de células sanguíneas

1. Tome 2 mL do sangue EDTA obtido como descrito em 3.7.3
2. Insira o tubo no analisador automatizado de hematologia e siga as instruções do fabricante.

6. Medição de hemoglobina livre (fHb) no plasma

1. Descongele uma amostra de plasma de cada condição obtida como descrito em 3.7.5. Guarde gelo depois do descongelamento.
   NOTA: Descongele sempre amostras de plasma congelado em um banho de água a 37 °C e transfira imediatamente para o gelo, contendo um pouco de água, para baixar a temperatura. Isso é importante para evitar a ativação de componentes sanguíneos durante o descongelamento.
2. Use o reagente fHb e siga as instruções do fabricante. Evite contaminação após a abertura e proteja o reagente da luz direta (sol, luz UV).
3. Use um esquema de pipetação (veja as instruções do fabricante) com diluição de 1:5.
4. Adicione 1000 μL do reagente de hemoglobina em um semi-micro cuvette de 1,6 mL. Use este cuvette para determinar o valor em branco.
5. Adicione 1000 μL do reagente de hemoglobina e 250 μL da amostra de plasma em outro semi-micro cuvette.
6. Misture o conteúdo em ambas as cuvetas lavando bem a pipeta, enchendo repetidamente com mistura de reação e incubando pelo menos 3 minutos à temperatura ambiente.
7. Determine a extinção (E) da amostra contra reagente fHb como reagente em branco. Calcule a concentração de fHb (mmol/l) da amostra: E₅₄₀-E₆₈₀ x 0,452.

7. Medição da FPA

1. Descongele uma amostra de plasma de cada condição obtida como descrito em 3.7.5 e armazene no gelo após o descongelamento.
2. Use o kit FPA Elisa e siga as instruções do fabricante.

8. Medição do sC5b9

1. Descongele uma amostra de plasma de cada condição obtida como descrito em 3.7.5 e armazene no gelo após o descongelamento.
2. Use o kit ELISA sC5b-9 e siga as instruções do fabricante.

9. Medição do PMN

1. Descongele uma amostra de plasma de cada condição obtida como descrito em 3.7.5 e armazene no gelo após o descongelamento.
2. Use o kit PMN-Elastase ELISA e siga as instruções do fabricante.

10. Medição de TNF

1. As microplacões devem ser revestidas um dia antes de executar o ELISA. Para o revestimento, adicione 100 μL de solução de anticorpos de captura a todos os poços, placa de vedação e incubar durante a noite a 2 °C-8 °C.
2. Descongele uma amostra de plasma de cada condição obtida como descrito em 3.7.5. Guarde gelo depois do descongelamento.
3. Use o kit TNF ELISA e siga as instruções do fabricante.

11. Medição do IL-6

1. Microplacos devem ser revestidos com anticorpos de captura um dia antes do experimento. Para revestimento, adicione 100 μL de solução de anticorpos de captura a todos os poços da microplacão fornecidos com o conjunto, placa de vedação e incubar durante a noite a 4 °C
2. Descongele uma amostra de plasma de cada condição obtida como descrito em 3.7.5. e armazenar no gelo depois de descongelar.
3. Use o kit IL-6 ELISA e siga as instruções do fabricante..

12. Análises FACS

1. Prepare 500 mL de tampão FACS adicionando 10 mL de soro de bezerro fetal e 2 mL de solução EDTA (0,5 M) a 488 mL de 1x PBS. O buffer FACS pode ser armazenado por 4 semanas a 4°C.
2. Utilize 100 μL do sangue citrato de sódio (ver 3.6.3) para cada procedimento de coloração (agregados de plaquetas monócitos (MPA), ativação de plaquetas (PA), integrins leucócitos (LI)).
3. Pipeta 100 μL de sangue de cada amostra em um tubo FACS de 5 mL. De cada amostra, prepare 3 tubos para coloração de anticorpos e etiqueta com painel MPA (agregados de plaquetas monocitos), painel PA (agregados de plaquetas) e painel LI (leucocitte integrin).
4. Misture o resto das 4 amostras em um tubo FACS de 5 mL. Use esta mistura para controles não manchados e fluorescência menos um (FMO).
5. Prepare 6 tubos FACS por tubos de 100 μL do sangue de amostra mista em cada tubo. Rotule 3 tubos como não manchados e 3 tubos como FMO-CD41, FMO-CD62P e FMO-CD162.
6. Adicione 100 μL de solução de paraformaldeído de 4% e incubar por 15 minutos no escuro à temperatura ambiente.
   ATENÇÃO: Paraformaldeído é tóxico para pele e olhos. Pode causar irritação pulmonar grave quando inalado e pode levar a danos pulmonares após exposição prolongada. Além disso, é classificada como cancerígena e toxina reprodutiva. Use sempre luvas e óculos de segurança e trabalhe sob o capô da fumaça.
7. Adicione 1 mL de tampão de lavagem a cada tubo e centrífuga a 287 x g por 5 min. Descarte o supernatante e repita a etapa de lavagem duas vezes.
8. Para a lise de glóbulos vermelhos (RBC), adicione 1 mL de tampão de lise RBC tampão de 1x (diluir 10x tampão de lise RBC em água desionizada), misture lentamente tubos para cima e para baixo e incubar por 5 minutos no RT no escuro.
9. Prepare contas de compensação para manchas simples. A 1 mL de tampão FACS adicione 4 gotas de cada contas positivas e negativas. Vórtice completo e adicione 100 μL de solução de contas a um tubo FACS de 5 mL.
10. Prepare 4 tubos com contas e rótulo como CD14-FITC, CD41-BV421, CD45-APC e CD62P-PE. Adicione 1 mL de tampão FACS a cada tubo e centrífuga a 287 x g por 5 min. Descarte o supernaspe e mantenha no gelo.
11. Após a lise RBC, adicione 1 mL de tampão FACS a cada tubo e lave conforme descrito em 12,7. Descarte o supernaspeso.
12. Prepare coquetéis de anticorpos:
    1. Painel MPA: Adicione 4 μL de CD45-APC, 4 μL de CD14-FITC e 4 μL de CD41-BV421 a 388 μL de buffer FACS.
    2. Painel PA: Adicione 1,6 μL de CD41-BV421 e 12 μL de CD62P-PE a 386,4 μL de buffer FACS.
    3. Painel LI: Adicione 4 μL de CD45-APC e 8 μL de CD162-BV421 a 388 μL de buffer FACS. Mantenha-se no gelo.
13. Preparem as manchas únicas: Adicione 0,5 μL a 499,5 μL de tampão FACS cada um para CD14-FITC, CD41-BV421 e CD45-APC. Para CD62P-PE adicione 0,3 μL a 499,7 μL de buffer FACS. Mantenha-se no gelo.
14. Preparar controles FMO: (i) painel MPA (FMO-CD41): Adicionar 1 anticorpo CD14-FITC μL e 1 μL de anticorpo CD45-APC a 98 μL FACS buffer. (ii) Painel PA (FMO-CD62P): Adicionar 0,4 μL de CD41-BV421 a 99,6 μL de buffer FACS. (iii) Painel LI (FMO-CD162): Adicionar 1 μL de CD45-APC a 99 μL de buffer FACS. Mantenha os controles FMO no gelo.
15. Coquetéis de anticorpos vortex e adicione 100 μL de cada coquetel de anticorpos preparados em 12,12 para cada um dos respectivos tubos rotulados (painel MPA, PA e LI) conforme descrito em 12,3 e misture suavemente por pipetar para cima e para baixo. Mantenha-se no RT no escuro.
16. Diluições de anticorpos de cor da única mancha de vórtice e adicionar 100 μL das diluições de anticorpos de uma única mancha, conforme preparado em 12.13. a cada um dos respectivos tubos rotulados com contas como descrito em 12,7 e misture suavemente por pipetar para cima e para baixo. Mantenha-se no RT no escuro.
17. Coquetéis de anticorpos Vortex FMO e adicione 100 μL de cada coquetel de anticorpos FMO-1, conforme preparado em 12.14. para cada um dos respectivos tubos rotulados (controles FMO) conforme descrito em 12,5. e misture suavemente por pipetting para cima e para baixo. Mantenha-se no RT no escuro.
18. Incubar todos os tubos com manchas de anticorpos por 30 minutos no RT no escuro.
19. Pegue os três tubos para controle não manchado (ver 12,4) e pelotas resuspendes em 250 μL de tampão FACS. Mantenha-se no gelo.
20. Após o tempo de incubação, lave todos os tubos, exceto controles não manchados uma vez com tampão FACS, conforme descrito em 12,7. Resuspend pelota em 250 μL de buffer FACS e adquirir dados sobre o citômetro de fluxo.
21. Use células não manchadas para configurações negativas e contas de mouse de compensação para configurações positivas no software FACS. Além disso, use FMO para controlar a estratégia de gating, onde FMO-CD41 é usado no painel MPA, FMO-CD62P é usado no painel PA e FMO-CD162 é usado no painel LI.
22. Adquira quase 0,5 x 10⁶ - 0,25 x 10⁶ eventos por tubo para FACS. Salve dados e analise com um software de análise (versão 9.9.6).

Todos os dados apresentados, exceto as parcelas FACS, foram analisados com um software estatístico. As parcelas FACS foram analisadas por meio do software de citometria de fluxo.

A análise da contagem completa de células sanguíneas não mostrou diferenças significativas em relação aos eritrócitos entre todas as condições testadas(Figura 2). Mas, plaquetas e leucócitos foram drasticamente reduzidas no grupo de látex, indicando uma biocompatibilidade muito ruim de látex. Isso é ainda sublinhado pelo aumento dos níveis de hemoglobina livre no grupo látex, indicando o fato de que, com exceção do grupo de látex, nenhum dos outros dispositivos vasculares ou condições levou a uma hemolise extensa(Figura 2). Além disso, os tubos de PVC revestidos, o policpvc e o hepPVC, bem como o stent testado não levaram à trombose por meio de perda de plaquetas e leucócitos, enquanto o látex apresentou a maior perda de plaquetas e leucócitos, seguido por tubos de PVC não revestidos que apresentaram tendência reduzida.

Enquanto todos os dispositivos vasculares testados levaram ao aumento da ativação do sistema de coagulação (FPA) e componente complementar (sC5b-9), os loops de hepPVC apresentaram uma tendência para a diminuição dos níveis de FPA e sC5b-9 quando comparados especificamente aos loops de policpvc(Figura 3). Curiosamente, os loops de PVC e Gap não revestidos apresentaram níveis mais baixos de FPA em comparação com o poliPVC, embora não atingindo o nível de significância estatística. No entanto, os loops de látex apresentaram níveis significativamente maiores de FPA quando comparados às condições de base e estáticas.

De acordo com toda a contagem de células sanguíneas, os loops de látex apresentaram os mais altos níveis de TNF, IL-6 e PMN elastase(Figura 4),atingindo o nível de significância estatística quando comparados com o resto dos grupos em termos de TNF e IL-6(Figura 4A,B),enquanto as condições estáticas e de linha de base em termos de elastase PMN(Figura 4C). Estes resultados indicam a potente ativação de leucócitos por látex. Os níveis de linha de base dos marcadores de ativação sempre foram comparáveis às condições estáticas, indicando uma heparinização adequada do sangue.

Curiosamente, mostrou-se que as contagens de plaquetas e leucócitos para loops induzidos por lacunas foram apenas ligeiramente reduzidas com ativação moderada do sistema coagulatório (FPA) e leucócitos (PMN elastase), embora o fechamento de loop inadequado com turbulências de fluxo resultantes e contato sanguíneo à superfície de corte não revestida e áspera levou a coágulos macroscopicamente visíveis na emenda(Figura 1F). Os coágulos e sua distribuição sobre toda a superfície da emenda ficaram evidentes com imagens μCT e SEM, enquanto nenhum coágulo foi encontrado quando os loops foram fechados com o dispositivo de fechamento externo não deixando nenhuma lacuna entre as terminações do loop(Figura 5).

A análise citométrica de fluxo das células sanguíneas hospedeiras que foram manchadas com marcadores específicos de plaquetas, CD41 e marcador de ativação de plaquetas CD62P, são mostradas na Figura 6A,B. Aqui, os tubos de látex apresentaram intensidade de fluorescência mediana extremamente alta (MFI) para CD62P em plaquetas sanguíneas, seguidos por stent, enquanto os tubos de polipVC revestidos de heparina apresentaram ativação mínima de plaquetas que retratam propriedade anti-trombogênica de tubos de polipVC. Além disso, os leucócitos foram classificados com base na granularidade baseada em CD45 e SSC (dispersão lateral) em (i) granuócitos; (ii) monócitos e (iii) linfócitos(Figura 7),e a expressão de CD162+ integrin foi detectada em cada subpopulação de leucócitos que são conhecidos por interagir com o CD62P nas plaquetas24. Notou-se que as expressões integrinas foram drasticamente reduzidas em granulócitos e linfócitos em loops de látex. Este resultado foi em linha com os níveis reduzidos de frequências totais de leucócitos nas alças de látex(Figura 2). Em geral, os níveis de integrin foram mais elevados entre os monócitos quando comparados aos granulócitos e linfócitos, indicando a probabilidade de interação monocito com plaquetas ativadas. Nesse sentido, os agregados de plaquetas monócitos também foram avaliados pela coloração das células sanguíneas com CD14 (como marcador monócito) e CD41 (como marcador de plaqueta) e, em última instância, para identificar células duplas positivas, ou seja, CD14+CD41+MPA (Figura 8). Aqui, notamos que o grupo de stent apresentou os mais altos níveis de expressão CD41 no MPA, seguido pelo grupo de látex, indicando uma tendência aumentada para formar MPA, apesar da frequência reduzida de monócito (<1 %) nos loops de látex.

Figura 1: Visão geral do modelo de loop hemodinâmico in vitro e suas modificações. (A) Loop para o experimento de lacuna com sistema externo de fechamento de loop, não deixando nenhuma lacuna na emenda. (B) Laço feito de tubo de PVC revestido de polipVC e stent dentro (seta). (C) Loop feito de tubo de látex. (D) Loop para o experimento de lacuna sem o sistema de fechamento de loop externo deixando uma lacuna entre as terminações do tubo (seta). (E) Laços colocados no berço de laço dentro do banho de água e cheios de sangue. (F) Trombo resultando em uma lacuna na emenda (seta) após a rotação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Resultados para contagem de células sanguíneas e hemoglobina plasmática. (A) Eritrócitos contam. (B) Contagem de plaquetas. (F) Leucócitos contam. (D) Hemoglobina de plasma livre. Os resultados indicam a baixa biocompatibilidade do látex, levando a hemólise excessiva. Os dados são apresentados como valor médio; as barras de erro indicam SEM. n=1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Resultados para ativação do sistema de coagulação e complementação. (A) Ativação do sistema de coagulação, medida por níveis de Fibrinopeptide A (FPA) (B) Complementar a ativação do sistema, medida por níveis de sC5b-9. Enquanto os tubos de látex evocavam níveis elevados significativos da FPA, a ativação complementar foi forte para todos os materiais testados. Os dados são apresentados como valor médio, as barras de erro indicam SEM. *p<0,05, n=1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Marcadores de ativação de leucócitos. (A) Fator de necrose tumoral alfa (TNF). (B) Interleucina 6 (IL-6) (C) PMN Elastase. Os resultados indicam aumento da ativação de leucócitos devido aos níveis elevados dos marcadores analisados, seguidos por laços de stent, que só levaram a níveis aumentados para PMN Elastase, mas não TNF ou IL-6. Os dados são apresentados como valor médio, as barras de erro indicam SEM. *p<0.5; **p<0,01, n=1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Imagem da emenda dos laços. (A) μ tomografia computadorizada (μCT) de loops com fechamento inadequado (lacuna). As áreas vermelhas indicam material trombo. (B) Renderização do lado luminal do tubo. A seleção retangular indica a área para a microscopia eletrônica de varredura (SEM) (C). (D) μCT de loops com dispositivo de fechamento de loop externo e nenhuma lacuna na emenda, e (E) renderização e visão da superfície luminal. Nenhum material de trombo foi encontrado. (F) IMAGEM SEM da seleção retangular em (E). Nenhum material de trombo foi encontrado na superfície de corte. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Parcela FACS para ativação de plaquetas (CD62P). (A) Gráfico FACS representativo (condição básica) mostrando o sangue CD41+ plaquetas. (B) Gráfico mostrando o estado de ativação plaquetária refletido pela intensidade média de fluorescência (FI) dos diferentes tipos de dispositivos vasculares em comparação com as condições estáticas de TR e linha de base. As barras de dados apresentam dados de medições únicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Trama FACS para leucócito integrin (CD162). (A) Gráfico representativo FACS (condição básica) mostrando o sangue CD45+ leucócitos e subgrupos(B) Gráfico mostrando a intensidade de fluorescência média leucócitos (MFI) dos diferentes tipos de dispositivos vasculares em comparação com as condições estáticas e de linha de base. As barras de dados apresentam dados de medições únicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Gráfico FACS para agregados de monócitos plaquetas (CD41/CD14). (A) Gráfico representativo FACS (condição básica) mostrando a gating para monócitos sanguíneos (CD45+/CD14+), plaquetas (CD41+) e agregados de plaquetas monocitos (CD41+/CD14+) (B) Gráfico mostrando o CD41+ intensidade média de fluorescência (MFI) nos agregados de plaquetas monócitos para os diversos dispositivos vasculares em comparação com as condições estáticas e de linha de base. As barras de dados apresentam dados de medições únicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O funder [ebo kunze industriedesign, Im Dentel 17, 72639 Neuffen, Alemanha] forneceu um apoio financeiro na forma de consumíveis e taxas de publicação para o autor deste manuscrito [Max Wacker]. Os financiadores não apresentaram qualquer papel adicional na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou elaboração do manuscrito.