É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Nanofios de Silício e Estimulação Óptica para Investigações de Acoplamento Elétrico Intra e Intercelular

4.1K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/61581

⸱

28 de janeiro de 2021

 ,  ,  , 
1The James Franck Institute, The University of Chicago, 2Department of Chemistry, The University of Chicago, 3The Institute for Biophysical Dynamics, The University of Chicago

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o uso de nanofios de silício para bio modulação óptica intracelular de células em um método simples e fácil de executar. A técnica é altamente adaptável a diversos tipos de células e pode ser usada para aplicações in vitro e in vivo.

Resumo

Myofibroblasts pode internalizar espontaneamente nanofios de silício (SiNWs), tornando-os um alvo atraente para aplicações bioeletrônicas. Esses híbridos de silício celular oferecem capacidades de modulação óptica sem chumbo com perturbação mínima ao comportamento celular normal. As capacidades ópticas são obtidas pelas propriedades fototérmicas e fotoelétricas dos SiNWs. Esses híbridos podem ser colhidos usando técnicas padrão de cultura tecidual e, em seguida, aplicados a diferentes cenários biológicos. Demonstramos aqui como esses híbridos podem ser usados para estudar o acoplamento elétrico das células cardíacas e comparar como os miofibroblasts se casam uns com os outros ou com cardiomiócitos. Este processo pode ser realizado sem equipamento especial além de um microscópio fluorescente com linha laser acoplada. Também é mostrado o uso de uma rotina MATLAB personalizada que permite a quantificação da propagação de cálcio dentro e entre as diferentes células da cultura. Myofibroblasts são mostrados ter uma resposta elétrica mais lenta do que a de cardiomiócitos. Além disso, a propagação intercelular myofibroblast mostra velocidades ligeiramente mais lentas, embora comparáveis às suas velocidades intracelulares, sugerindo propagação passiva através de junções de lacunas ou nanotubos. Essa técnica é altamente adaptável e pode ser facilmente aplicada a outras arenas celulares, tanto para investigações in vitro quanto in vivo ou ex vivo.

Introdução

Todos os organismos biológicos usam eletricidade, na forma de íons, para regular o comportamento celular. As membranas celulares contêm vários tipos de canais de íons específicos permitindo o transporte passivo e ativo de íons. Esses íons regem as funções das células excitáveis, como atividade neuronal e contratude muscular esquelética e cardíaca. No entanto, a bioeletricidade também desempenha um papel importante em células não excitáveis, regendo muitas funções celulares como a proliferação celular1, neuroimunidade2,3,4, e diferenciação de células-tronco5.

Nas últimas décadas, o campo da bioeletricidade tem atraído um nível crescente de interesse, o que tem contribuído para o desenvolvimento de inúmeras tecnologias para interfaces bioeletrônicas. Pipetas de patch de microeletrodo são o padrão ouro de gravação intracelular e estimulação6. Nesta metodologia, uma pipeta de vidro é puxada em condições específicas para formar uma borda afiada com um tamanho de poros de poucos mícrons. Esta pipeta é preenchida com um tampão e a pipeta permite o contato direto do buffer com o volume intracelular. Isso resulta em uma interface bioelétrica que produz relações de sinal a ruídos extremamente altas, controle preciso sobre a atividade elétrica celular e resolução temporal extremamente alta. Embora essa metodologia seja uma ferramenta extremamente poderosa, que recentemente foi desescalada para uma configuração de nano-pipeta7,está associada a várias limitações técnicas importantes. O efeito de diluição do citosol8,bem como vibrações mecânicas, limita sua utilidade a interrogatórios de curto prazo, e requer equipamentos especializados caros e um alto nível de habilidade técnica. Além disso, sua volumosidade limita o número de células que podem ser registradas ou estimuladas simultaneamente, e devido à sua invasividade, não pode ser reconfigurada ao longo de um experimento. Para superar essas limitações, foram desenvolvidas matrizes de microeletrodos, mas o tamanho dos eletrodos limita a resolução espacial, bem como o acesso intracelular. As matrizes nanoeletríndulas permitem gravação e estimulação intracelulares, mas requerem eletroporação abrasiva para acessar o citosol9,10. Além disso, todas essas metodologias são ligadas a substratos e, portanto, estão limitadas a culturas celulares in vitro, ou a células superficiais externas, sem acesso a células que estão dentro de um tecido tridimensional (3D).

A optogenética11 é amplamente utilizada para lidar com essas limitações 3D e in vivo. No entanto, os métodos optogenéticos são baseados nas perturbações dos canais de íons de membrana plasmática ativados pela luz que são distribuídos na membrana plasmática, limitando a resolução espacial 3D12 e as capacidades intracelulares.

Recentemente mostramos que os nanofios de silício (SiNWs) podem ser usados para realizar interrogatórios bioelétricos intracelulares com resolução espacial submicron com diferentes células não excitáveis, ou seja, miofibroblasts cardíacos e oligodenrócitos13. Além disso, usamos esses SiNWs para realizar interrogatórios específicos de células ex-vivo dentro de um tecido cardíaco 3D, para investigar como as células cardíacas se acoplam eletricamente in vivo14. Uma grande vantagem dessa metodologia é sua simplicidade; não requer qualquer modificação genética ou instrumentação volumosa. Muitas células internalizarão espontaneamente SiNWs foto-responsivos sem necessidade de sônica ou eletroporação15. Além disso, eles escaparão espontaneamente do encapsulamento endosomal e formarão uma integração perfeita com as organelas citosol e intracelular13,15. Esses compostos célula-SiNWs, denominados híbridos de silício celular, possuem a natureza dinâmica, suave e versátil da célula original, bem como as capacidades optoelétricas dos SiNWs. Após a hibridização, o híbrido celular-SiNW pode ser colhido utilizando técnicas padrão de cultura tecidual e usado para diversas aplicações, como estimulação bioelétrica intracelular; estudar o acoplamento bioelétrico intercelular in vitro; e para interrogatório específico de célula in vivo. Como uma estimulação eficaz requer a co-localização de altas densidades de energia óptica e SiNWs, pode-se alcançar alta resolução espacial tanto em 2D quanto em 3D. Neste protocolo descrevemos detalhadamente a metodologia, bem como como os resultados podem ser analisados. O foco é colocado na investigação intra e intercelular in vitro, mas a implementação in vivo dessa metodologia pode ser utilizada diretamente para muitos outros cenários biológicos.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Para garantir o cumprimento das normas éticas, todos os procedimentos animais relacionados à isolação de cardiomiócitos de corações de roedores foram aprovados pela Primeira Vez pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Chicago (IACUC). Além disso, todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com a orientação da Universidade de Chicago IACUC.

1. Preparação de híbridos de Células SiNWs

  1. Isole os cardiomiócitos primários (CMs) utilizando um kit comercial seguindo as diretrizes do fabricante.
  2. Prepare dMEM completo para isolamento celular primário suplementado com soro bovino fetal inativado 10%, 1% penicilina-estreptomicina e 1% L-glutamina.
  3. Para isolar o miofibroblast (MFs) da suspensão MFs-CMs, pré-emplaque as células isoladas em um prato de cultura tecidual (células isoladas de 2 corações a partir do passo 1.1. por prato de 100 mm) por 1 h. Como os CMs precisam de uma superfície tratada com fibronectina ou colágeno para aderir, apenas os MFs se ligarão à superfície da cultura tecidual.
  4. Aspire a suspensão da célula CMs enriquecida. Estes CMs podem ser usados para experimentos de acoplamento heterocelular, conforme descrito na seção 3. Enxágüe os MFs com DMEM para eliminar quaisquer CMs restantes do prato MFs.
  5. Adicione meio de cultura fresco aos MFs e permita que eles se proliferem até que sejam ~80% confluentes (2-4 dias). Mude o meio dia não.
  6. Quando as células estiverem prontas (80% confluentes), prepare siNWs para a etapa de hibridização abaixo (passo 1.7).
    NOTA: Muitos tipos de SiNWs podem ser usados para isso. Neste experimento, siNWs que foram cultivados por deposição de vapor químico (DCV) com uma configuração de junção p-i-n de concha central foram usados como descrito anteriormente16. Durante o crescimento da DCV, os SiNWs são cultivados em um substrato de wafer de silício, e eventualmente são mantidos como chips de silício cobertos com SiNWs.
  7. Corte um chip de 3 mm x 3 mm de um wafer com SiNWs cultivados em DCV usando um escriba de diamante. Use fórceps afiados para manusear o wafer e minimizar a área de superfície que é tocada com os fórceps, pois isso pode quebrar os SiNWs.
  8. Esterilize o chip enxaguando-o com 70% de etanol e permitindo que o etanol seque por 30 minutos sob luz UV em uma capa de fluxo laminar de biossegurança.
  9. Transfira o chip para um tubo de microcentrifus e enxágue o excesso de etanol usando mídia de cultura completa.
  10. Adicione 1 mL de mídia cultural e sonicar o chip no banho de sônica por 1-10 min. A mídia deve ficar turva à medida que os SiNWs são lançados na mídia.
    NOTA: O tempo e a energia da sônicação devem ser otimizados para diferentes sonicadores ou células diferentes, uma vez que durações mais curtas e potências mais baixas produzirão SiNWs mais longos.
  11. Adicione a suspensão do SiNWs em 5 mL de mídia cultural e semeeá-la no prato de cultura de tecido de 100 mm com MFs. Permita que os SiNWs internalizem por 4h e enxágue o excesso de SiNWs fora 5x com mídia. Permita que os SiNWs parcialmente internalizados completem a internalização, permitindo que eles se sentem por mais 1h antes de usar.
    NOTA: Diferentes tipos de células podem precisar de diferentes tempos de concentração e/ou internalização de SiNWs.
  12. Prepare a solução de revestimento de colágeno diluindo a solução de estoque de colágeno (3 mg/mL) com ácido acético estéril de 20 mM a uma razão de 1:50. Adicione a solução de revestimento de 0,5 mL a uma antena de fundo de vidro de 35 mm e deixe descansar por 1h em 37 °C. Retire a solução e enxágue o prato com PBS estéril.
  13. Colher os híbridos cell-SiNWs tratando as células com 3 mL de trippsina por 2 min a 37 °C. Adicione 10 mL de mídia cultural e enxágue os híbridos vigorosamente por pipetação. Centrifugar as células suavemente a 200 x g por 5 min para evitar danificar as células com os SiNWs internalizados. Remova o excesso de mídia, suspenda as células com mídia de 1 mL e semeie-as no prato de fundo de vidro tratado com colágeno.
    NOTA: Os híbridos podem ser semeados sozinhos, para investigar o acoplamento intracelular ou intercelular ou com CMs para investigar o acoplamento heterocelular in vitro.
  14. Realize uma verificação final da internalização do SiNW rotulando o citosol das células (calcein-AM, 4 μM) e membrana (marcador de membrana, 2 μM) por 30 min a 37 °C, e imagem da célula usando microscopia confocal. Como os SiNWs são altamente reflexivos, a luz refletida pode ser usada em vez de fluorescência para visualizá-los.

2. Preparação de células para investigações intra e intercelulares

  1. Prepare a solução de revestimento de colágeno como em 1.12
  2. Para estimulação elétrica intracelular, híbridos de cultura com baixas densidades de semeadura. Use um hemótmetro padrão para contar células da seção 1.11. e sementes 50.000 células em um prato de fundo de vidro de 35 mm na mídia cultural. Para investigações intercelulares, use densidades celulares mais altas (500.000 células por prato). Para o acoplamento intercelular entre CMs e MFs, co-cultura os híbridos com CMs recém-isolados.
  3. Permitir que as células se conectem durante a noite antes de realizar experimentos de estimulação óptica. Para investigações intercelulares, permita 48 h a 37 °C para que as células expressem junções intercelulares antes que o experimento seja realizado.
  4. Prepare a solução de estoque de corante sensível ao cálcio (pode ser mantida em -20 °C) adicionando 50 μL de DMSO a 50 μg Fluo-4 AM. Prepare a solução de coloração diluindo 1 μL de corante em 1 mL de DMEM.
  5. Aspire o meio de cultura das células e adicione 1 mL de solução de coloração. Deixe o corante internalizar nas células por 20-30 min a 37 °C. Aspire o corante e enxágue duas vezes com PBS estéril.
  6. Por fim, adicione 1 mL de DMEM Media livre de fenol-vermelho pré-aquecido e permita que o Fluo-4 intracelular se submeta à desestificação por 30 minutos em 37 °C.
  7. Transferir células para microscópio para imagem e estimulação.

3. Imagem óptica e estimulação

  1. Pré-aqueça um microincubador umidificado a 37 °C e a mistura de ar-CO2 bolha (95:5).
  2. Use um microscópio com uma linha laser colidida acoplada no caminho da luz para imagem de cálcio e estimulação óptica.
    NOTA: Um microscópio confocal de digitalização é a opção mais simples devido às suas capacidades de estimulação de ponto. No entanto, este procedimento pode ser feito usando qualquer microscópio de floresnce padrão acoplando um raio laser colidido no espaço infinito do caminho de luz usando um divisor de feixe. Qualquer objetivo de microscópio é projetado para que um laser colidido passou por ele será focado em um ponto laser limitado de difração no plano focal. O comprimento de onda laser deve estar próximo da luz de excitação, por isso será refletido pelo espelhodicróico e passado pelo filtro de excitação.
  3. Visualize os SiNWs e determine o local de estimulação usando microscopia de campo brilhante, luz transmitida ou luz reflexiva. Em seguida, reconfigure o caminho da luz para o modo fluorescência, mantendo o ponto de estimulação na localização predefinida do SiNW.
  4. Validar o poder de estimulação ideal e o comprimento do pulso para cada tamanho sinw e tipo de célula, para minimizar danos fototérmicos às células estimuladas. Para um protocolo típico de estimulação, realize um registro de linha de base de 2-10 da atividade de cálcio intracelular. Em seguida, aplique um único pulso laser de 1-10 mW de potência e 1-10 ms de duração (correspondente a 30-300 kW/mm2) para estimular o SiNW, e registrar a onda de cálcio resultante para outros 2-10 s.
    NOTA: É essencial otimizar a potência óptica e o comprimento do pulso para cada tamanho e células do SiNW. Isso é necessário para minimizar os danos fototérmicos às células estimuladas.
  5. Transfira os filmes gravados da estimulação óptica, se necessário, para análise posterior.

4. Processamento de vídeo

  1. Visualize alterações na fluorescência fluo-4 usando o macro "dF over F"17 disponível para ImageJ18, que calcula a mudança na contagem de fluorescência para cada pixel, e normaliza pelo valor médio da linha de base de repouso. Converta a saída (formato de ponto flutuante) em 8 bits para posterior processamento.
  2. Processe o filme dF/F ainda mais usando o filtro mediano seletivo "Remove outliers" disponível no ImageJ. Defina parâmetros para remover pixels onde seu valor é mais de 10 acima do valor médio em um raio de 2 pixels e substitua esse valor de pixel pela mediana.
  3. Calcule o fluxo óptico em cada quadro através do algoritmo Lucas-Kanade, conforme implementado na caixa de ferramentas Matlab Computer Vision. A saída desta função foi um campo vetorial contendo os componentes x e y do fluxo óptico em cada ponto de cada imagem (o código está disponível no Arquivo Suplementar 1).
    NOTA: O fluxo óptico médio dentro de uma célula, <ν>, corresponde ao desenvolvimento do fluxo de cálcio dentro de uma célula. O diferencial do fluxo óptico, Δ<ν> fornece o ponto de tempo em que a sinalização de cálcio foi ativada, identificando onde o sinal foi maximizado. Além disso, a magnitude de Δ<ν> no seu máximo está correlacionada com a taxa em que a frente de onda de cálcio progride através da célula.
  4. Calcule a velocidade intercelular da transmissão de cálcio de acordo com a seguinte equação.
    vCa2+ = rij / ( tmax,j − tmax,i ),
    onde tmax,j e tmax,i são os tempos de ativação para células j e i, respectivamente, e rij é a distância entre os centroides das células.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

A capacidade dessa metodologia de permitir o acesso direto ao citosol intracelular depende da internalização espontânea do SiNW nas células. Embora os SiNWs sejam submetidos à internalização espontânea em muitos tipos de células15, algumas células, como cardiomiócitos e neurônios, precisarão que os SiNWs sejam tratados para permitir sua internalização19. Neste protocolo descrevemos o processo de internalização de P-i-n SiNWs com 200-300 nm de diâmetro e ~1-3 μm de comprimen...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Nós demonstramos aqui uma maneira simples de realizar estimulação elétrica intracelular das células. Nesta demonstração, usamos MFs que foram pré-fabricados com SiNWs, depois co-cultivados com CMs. Em geral, a maioria das células que proliferam tem a tendência de internalizar SiNWs, o que permite o uso dessa metodologia com muitos outros tipos de células. Além disso, enquanto demonstramos a estimulação intracelular das células, os mesmos princípios podem ser usados para realizar estimulação extracelular das células. Isso...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado pelo Escritório de Pesquisa Científica da Força Aérea (AFOSR FA9550-18-1-0503).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
35 mm Pratos de fundo de vidroCellvisD35-10-0-N
3i Marianas Spinning Disk Confocal3i
Calcein-AMInvitrogenC1430
CellMask Laranja Membrana de plasma ManchaInvitrogenC10045
Collagen I, rabo de ratoGibcoA1048301
Deluxe Diamond Scribing PenTed Pella54468
DMEM, glicose alta, piruvato, sem glutaminaGibco10313039
DMSO, Placas deAnidro InvitrogenD12345
Falcon Falcon08-772E
Soro Fetal Bovino, certificado, inativado por calor,Gibco10082147
Fibronectina Proteína Humana, PlasmaGibco33016015
Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic CleanerFisher ScientificFB11201
Fluo-4, AM, célula permeávelInvitrogenF14201
FluoroBrite DMEM MediaGibcoA1896701
L-Glutamina (200 mM)Gibco25030081
OKO câmara de controle ambiental completa (constante temperatura, umidade e CO2)OKO
PBS, pH 7,4Gibco10010023
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)Gibco15140122
Pierce Kit de Isolamento de CardiomiócitosPrimários Thermo Scientific88281
Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenolGibco25200056
Cultura de Tecidos Padrão

Referências

  1. Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle. Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).
  2. Dantzer, R. Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa. Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).
  3. Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression. Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497(2016).
  4. Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis. Nature Immunology. 18 (2), 116(2017).
  5. Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).
  6. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
  7. Jayant, K., et al. Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes. Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).
  8. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
  9. Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation. Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).
  10. Robinson, J. T., et al. Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits. Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).
  11. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).
  12. Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).
  13. Rotenberg, M. Y., et al. Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution. Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).
  14. Rotenberg, M. Y., et al. Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).
  15. Zimmerman, J. F., et al. Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires. Science Advances. 2 (12), 1601039(2016).
  16. Jiang, Y., et al. Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials. Nature protocols. 14 (5), 1339(2019).
  17. Ackman, J. dFoFmovie-CatFullAutoSave.java. , Available from: https://gist.github.com/ackman678/11155761 (2020).
  18. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229(2017).
  19. Lee, J. -H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons. Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).
  20. Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., García-Rivas, G. Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we. Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).
  21. Lozano, O., et al. Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091(2019).
  22. Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin. Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).
  23. Klesen, A., et al. Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology. Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).
  24. He, K., et al. Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes. Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).
  25. Carvalho-de-Souza, J. L., et al. Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles. Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).
  26. Wang, S. -H., Lee, C. -W., Chiou, A., Wei, P. -K. Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images. Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33(2010).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Isolamento de MiofibroblastosImagem de CálcioMicroscopia ConfocalEstimulação a LaserAnálise de Junções ComunicantesCocultura CelularAplicações Bioeletrônicas
Nanofios de Silício e Estimulação Óptica para Investigações de Acoplamento Elétrico Intra e Intercelular
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.