Este protocolo descreve o uso de nanofios de silício para bio modulação óptica intracelular de células em um método simples e fácil de executar. A técnica é altamente adaptável a diversos tipos de células e pode ser usada para aplicações in vitro e in vivo.
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Artigo de método
Nanofios de Silício e Estimulação Óptica para Investigações de Acoplamento Elétrico Intra e Intercelular
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Myofibroblasts pode internalizar espontaneamente nanofios de silício (SiNWs), tornando-os um alvo atraente para aplicações bioeletrônicas. Esses híbridos de silício celular oferecem capacidades de modulação óptica sem chumbo com perturbação mínima ao comportamento celular normal. As capacidades ópticas são obtidas pelas propriedades fototérmicas e fotoelétricas dos SiNWs. Esses híbridos podem ser colhidos usando técnicas padrão de cultura tecidual e, em seguida, aplicados a diferentes cenários biológicos. Demonstramos aqui como esses híbridos podem ser usados para estudar o acoplamento elétrico das células cardíacas e comparar como os miofibroblasts se casam uns com os outros ou com cardiomiócitos. Este processo pode ser realizado sem equipamento especial além de um microscópio fluorescente com linha laser acoplada. Também é mostrado o uso de uma rotina MATLAB personalizada que permite a quantificação da propagação de cálcio dentro e entre as diferentes células da cultura. Myofibroblasts são mostrados ter uma resposta elétrica mais lenta do que a de cardiomiócitos. Além disso, a propagação intercelular myofibroblast mostra velocidades ligeiramente mais lentas, embora comparáveis às suas velocidades intracelulares, sugerindo propagação passiva através de junções de lacunas ou nanotubos. Essa técnica é altamente adaptável e pode ser facilmente aplicada a outras arenas celulares, tanto para investigações in vitro quanto in vivo ou ex vivo.
Introdução
Todos os organismos biológicos usam eletricidade, na forma de íons, para regular o comportamento celular. As membranas celulares contêm vários tipos de canais de íons específicos permitindo o transporte passivo e ativo de íons. Esses íons regem as funções das células excitáveis, como atividade neuronal e contratude muscular esquelética e cardíaca. No entanto, a bioeletricidade também desempenha um papel importante em células não excitáveis, regendo muitas funções celulares como a proliferação celular1, neuroimunidade2,3,4, e diferenciação de células-tr....
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Protocolo
Para garantir o cumprimento das normas éticas, todos os procedimentos animais relacionados à isolação de cardiomiócitos de corações de roedores foram aprovados pela Primeira Vez pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Chicago (IACUC). Além disso, todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com a orientação da Universidade de Chicago IACUC.
1. Preparação de híbridos de Células SiNWs
- Isole os cardiomiócitos primários (CMs) utilizando um kit comercial seguindo as diretrizes do fabricante.
- Prepare dMEM completo para isolamento celular primário suplementado com soro bovino fetal i....
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Resultados
A capacidade dessa metodologia de permitir o acesso direto ao citosol intracelular depende da internalização espontânea do SiNW nas células. Embora os SiNWs sejam submetidos à internalização espontânea em muitos tipos de células15, algumas células, como cardiomiócitos e neurônios, precisarão que os SiNWs sejam tratados para permitir sua internalização19. Neste protocolo descrevemos o processo de internalização de P-i-n SiNWs com 200-300 nm de diâmetro e ~1-3 μm de comprimen.......
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Discussão
Nós demonstramos aqui uma maneira simples de realizar estimulação elétrica intracelular das células. Nesta demonstração, usamos MFs que foram pré-fabricados com SiNWs, depois co-cultivados com CMs. Em geral, a maioria das células que proliferam tem a tendência de internalizar SiNWs, o que permite o uso dessa metodologia com muitos outros tipos de células. Além disso, enquanto demonstramos a estimulação intracelular das células, os mesmos princípios podem ser usados para realizar estimulação extracelular das células. Isso.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado pelo Escritório de Pesquisa Científica da Força Aérea (AFOSR FA9550-18-1-0503).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 35 mm Pratos de fundo de vidro | Cellvis | D35-10-0-N | |
| 3i Marianas Spinning Disk Confocal | 3i | ||
| Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
| CellMask Laranja Membrana de plasma Mancha | Invitrogen | C10045 | |
| Collagen I, rabo de rato | Gibco | A1048301 | |
| Deluxe Diamond Scribing Pen | Ted Pella | 54468 | |
| DMEM, glicose alta, piruvato, sem glutamina | Gibco | 10313039 | |
| DMSO, Placas de | Anidro Invitrogen | D12345 | |
| Falcon Falcon | 08-772E | ||
| Soro Fetal Bovino, certificado, inativado por calor, | Gibco | 10082147 | |
| Fibronectina Proteína Humana, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FB11201 | |
| Fluo-4, AM, célula permeável | Invitrogen | F14201 | |
| FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
| L-Glutamina (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| OKO câmara de controle ambiental completa (constante temperatura, umidade e CO2) | OKO | ||
| PBS, pH 7,4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Pierce Kit de Isolamento de Cardiomiócitos | Primários Thermo Scientific | 88281 | |
| Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol | Gibco | 25200056 |
Referências
- Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle. Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).
- Dantzer, R. Neuroimmune interactions: from the brain t....
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Reimpressões e permissões
