Preparação e microinjeção de embriões Drosophila para Microscopia de Células Vivas Realizadas usando um Analisador automatizado de alto teor

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para microinjetar e simultaneamente imaginar múltiplos embriões de Drosophila durante o desenvolvimento embrionário usando um imager de alto teor baseado em placas.

Resumo

Abordagens modernas em imagens quantitativas de células vivas tornaram-se uma ferramenta essencial para explorar a biologia celular, permitindo o uso de estatísticas e modelagem computacional para classificar e comparar processos biológicos. Embora os sistemas de modelos de cultura celular sejam ótimos para imagens de alto conteúdo, estudos de alto rendimento da morfologia celular sugerem que culturas ex vivo são limitadas na recapitulação da complexidade morfológica encontrada nas células dentro de organismos vivos. Como tal, há a necessidade de um sistema de modelo de alto rendimento escalável para imagem de células vivas dentro de um organismo intacto. Descrito aqui é um protocolo para usar um analisador de imagem de alto conteúdo para adquirir simultaneamente vários vídeos de lapso de tempo do desenvolvimento embrionário de melanogaster Drosophila durante o estágio de blastoderm sinintital. O blastoderm sinintário tem servido tradicionalmente como um grande modelo in vivo para eventos biológicos de imagem; no entanto, a obtenção de um número significativo de réplicas experimentais para abordagens quantitativas e de alto rendimento tem sido trabalhosa intensiva e limitada pela imagem de um único embrião por repetição experimental. Apresentado aqui é um método para adaptar abordagens de imagem e microinjeção para se adequar a um sistema de imagem de alto conteúdo, ou qualquer microscópio invertido capaz de aquisição automatizada de vários pontos. Essa abordagem permite a aquisição simultânea de embriões de 6 a 12, dependendo dos fatores de aquisição desejados, dentro de uma única sessão de imagem.

Introdução

Nos últimos 30 anos, os avanços em tecnologias de imagem e sondas moleculares para imagens de células vivas avançaram nossa compreensão da complexidade e do funcionamento interno da célula. Acompanhar esse avanço na tecnologia é uma maior dependência do uso de modelos de cultura celular ex vivo para a aquisição de dados de imagem de alto rendimento. Os modelos de cultura celular oferecem diversas vantagens, incluindo o controle do microambiente através de sistemas microfluidos, e a capacidade de imagem múltiplas células simultaneamente, permitindo o uso de abordagens quantitativas necessárias para a triagem de alto rendimento^1,2. No entanto, há também desvantagens significativas associadas aos modelos de cultura celular no contexto de estudos morfológicos, como vidro bidimensional ou superfícies plásticas produzindo efeitos confusos sobre a morfologia celular e sua regulação^3,4,5. Esses efeitos podem fornecer dados falsos ou enganosos no que diz respeito ao estudo de processos biológicos que regulam a morfologia celular.

Embora a alternativa tenha sido estudar a morfologia celular no contexto de um organismo intacto^6,poucos organismos intactos adequados facilitam imagens de células vivas quantitativas de alto rendimento devido a dificuldades em manter organismos inteiros vivos através da imagem, e desafios associados à imagem dentro de um grande organismo multicelular. Como resultado, estudos biológicos de células em organismos intactos geralmente se concentraram em observar um único organismo ao longo do tempo, o que limita muito o tamanho da amostra. Além disso, essa limitação de um animal por vez torna a imagem ao vivo difícil e cara de empregar na forma de uma tela e restringe a capacidade de aplicar ferramentas analíticas quantitativas, uma vez que o número de amostras é geralmente muito pequeno. Assim, surge a necessidade de um organismo modelo multicelular que possa ser usado para abordagens quantitativas baseadas em alto conteúdo.

Este protocolo adapta o embrião Drosophila para imagens de alto conteúdo baseadas em placas para gerar tamanhos experimentais de amostra grande o suficiente para análise quantitativa. Drosophila melanogaster é comumente conhecido como o primeiro organismo modelo. Pesquisas utilizando Drosophila levaram a avanços na biologia celular e molecular, incluindo a transmissão de informações genéticas, identificação de vias de sinalização celular e requisitos genéticos de desenvolvimento embrionário^7,8,9. Além disso, o embrião Drosophila tem sido usado para explorar a dinâmica in vivo de microtúbulos durante a divisão celular^10,11,12. O uso de microinjeção para fornecer pequenas moléculas e sondas moleculares fornece controle temporal que torna o desenvolvimento embrionário de Drosophila particularmente poderoso para sondar processos celulares in vivo^13,14. No entanto, gerar um número significativo de repetições experimentais com uma abordagem de imagem tradicional é extremamente trabalhoso e tem uso limitado em telas de imagem de alto rendimento e análise quantitativa. Nossa abordagem faz uso de um analisador de alto teor tipicamente reservado para análise de células únicas e adapta a análise de imagem in vivo no sincronia do início de Drosophila embryo.

Este protocolo foi utilizado para coletar, encenar e microinjetar embriões de Drosophila para explorar os mecanismos que impulsionam alterações morfológicas no Istúlumo Endoplasmático (ER) durante a mitose¹⁵. Embora muitos estudos tenham delineado a natureza dinâmica do ER durante o ciclo celular^16,17,18,19, tem sido difícil comparar os efeitos de múltiplas perturbações ao longo do tempo na morfologia er. Para identificar os componentes que impulsionam mudanças na morfologia do ER entre a divisão celular, os métodos listados neste protocolo foram usados para sondar o papel de microtúbulos e outros fatores citoesqueléticos na reorganização do ER mitótico usando a divisão síntial cortical no embrião Drosophila primitivo. Em conjunto, a disponibilidade de perturbação genética dentro da comunidade de Drosophila, a capacidade de microinjetar drogas e sondas moleculares em momentos precisos durante o desenvolvimento, e o custo barato de trabalhar com Drosophila torna essa abordagem altamente favorável à triagem baseada em imagens de alto rendimento. Os métodos descritos aqui são aplicáveis para estudar uma ampla variedade de processos celulares e de desenvolvimento in vivo utilizando o embrião Drosophila ²⁰. Especificamente, este protocolo é bem adaptado para estudar eventos biológicos que ocorrem por um longo período e dentro de 100 mícrons do córtex de embrião Drosophila.

Protocolo

NOTA: Consulte a Tabela 1 para receitas de mídia e solução.

1. Configuração e manutenção de uma gaiola de coleta de embriões para análise ao vivo²¹

1. Poe uma gaiola de coleta de embriões fresco com moscas frescas.
   NOTA: Embora sejam recomendadas gaiolas de coleta disponíveis comercialmente, as gaiolas de coleta podem ser facilmente construídas a partir de garrafas de mosca vazias²¹.
   1. Descarte ou transfira moscas adultas de garrafas quando muitas pupas começarem a escurecer no estágio p14; a 20 °C ocorre aproximadamente 14 dias após a colocação dos ovos²².
   2. Deixe a pupae chocar e povoar as garrafas por 12-24 h.
   3. Transfira moscas frescas para uma pequena gaiola de coleta usando um pequeno funil sobre a abertura da gaiola de coleta para evitar que as moscas escapem. Combine até 3 garrafas para produzir uma gaiola densamente povoada contendo 200 a 500 moscas.
   4. Transfira moscas para a gaiola de coleta tocando uma garrafa de mosca contra uma superfície dura repetidamente (para atordoar as moscas). Em seguida, abra e inverta a garrafa de mosca sobre o funil da gaiola de coleta. Toque a garrafa aberta na gaiola de coleta algumas vezes para jogar moscas na gaiola de coleta.
   5. Feche a garrafa de mosca aberta colocando-a rapidamente no plugue. Ao transferir a garrafa de mosca aberta do funil para o seu plugue, certifique-se de que a garrafa abrindo pontos para baixo à medida que as moscas tendem a rastejar para longe da fonte do toque.
   6. Pressione o funil contra a abertura da gaiola de moscas e toque a gaiola repetidamente em uma superfície dura para atordoar as moscas dentro. Remova imediatamente o funil e fixe uma placa de uva fresca na abertura da gaiola de mosca. Use fita de rotulagem para fixar a placa de uva. Repita este processo para combinar até 3 garrafas para produzir uma gaiola de coleta densamente povoada.
      NOTA: Alternativamente, as moscas podem ser anestesiadas usando CO₂ ou outros agentes de sono de mosca; no entanto, isso aumentará o período de aclimatação na etapa 1.2.
2. Aclimatar a nova gaiola de coleta para 24-48 h. Se for utilizado CO₂ ou qualquer outro agente adormecido, aclimatar a gaiola de coleta por pelo menos 48 h.
   1. Substitua a placa de uva na gaiola de coleta por uma fresca contendo pasta de levedura duas vezes ao dia, 8-10 h de distância.
3. Montar uma gaiola de coleta a cada 5 dias.

2. Coleta e preparação de embriões para imagem

1. Obtenção de embriões com desenvolvimento sincronizado
   1. Troque a placa de uva na gaiola de coleta com uma fresca contendo uma dab de pasta de levedura no centro. Permita que as moscas coloquem embriões por 1h. Jogar o prato de uva velho.
      NOTA: As moscas podem fertilizar embriões antes de colocá-los. A primeira placa de coleta conterá muitos desses embriões pré-desenvolvidos. Permitir que moscas despejem embriões velhos primeiro melhorará a sincronização do desenvolvimento entre embriões.
   2. Troque a placa de uva por uma fresca contendo uma barra de pasta de levedura no centro e deixe as moscas colocarem embriões por 10 minutos. Jogar o prato de uva velho.
      NOTA: Para evitar retardar o desenvolvimento embrionário em placas frias, aqueça a placa de uva e a pasta de levedura à temperatura ambiente antes do uso.
   3. Troque a placa de uva com uma fresca (sem pasta de levedura) e salve a placa de uva velha, tem os embriões para imagem. Se necessário, continue coletando embriões desta gaiola repetindo a etapa 2.1.2 e 2.1.3.
2. Idade coleta embriões por 30-45 min para divisões sincicial de imagem²³.
   NOTA: Para imaginar o estágio de blastoderm siníntial no desenvolvimento embrionário, os embriões devem ser montados e no microscópio dentro de 90 minutos de coleta. Ao tentar este protocolo pela primeira vez, os embriões de idade 10-20 min na etapa 2.2 para fornecer tempo extra para configurar entre as etapas.
3. Embriões descorrionatos com 50% de alvejante em água DI.
   1. Transfira embriões envelhecidos da etapa 2.2 para uma peneira de 140 nm preenchendo a placa de uva com água DI, deslocando suavemente os embriões com uma escova de tinta, e despejando a água com embriões na peneira de 140 nm(Figura 1A).
      NOTA: Isso pode ser feito sobre uma pia ou 1.000 mL béquer.
   2. Enxágüe vigorosamente embriões com uma água DI usando uma garrafa de esguicho. Embriões secos manchando a peneira em uma toalha de papel seco. Borre a peneira até parar de deixar marcas de água na toalha de papel(Figura 1B).
      NOTA: Remova todas as pastas de leveduras dos embriões, pois pode tornar o tratamento alvejante ineficaz na próxima etapa.
   3. Encha uma placa vazia de 10 cm com alvejante recém-preparado diluído com água DI (alvejante 1:1: água DI). Mergulhe a peneira em 50% de alvejante por 2 min 45 s. Inicie um cronômetro assim que a peneira tocar o alvejante de 50%. Borricar a peneira dentro e fora do alvejante de 50% 3-4x nos primeiros 15 s para separar aglomerados de embriões(Figura 1C).
   4. Enxágue vigorosamente embriões com água DI usando uma garrafa de esguicho. Seque os embriões manchando a peneira em uma toalha de papel seco. Repita o processo de lavagem vigorosa e secagem de manchas por 5x (Figura 1D).
      NOTA: Este é o passo mais importante para remover a esquerda sobre o acorde. Use uma garrafa de esguicho DI completa e use metade da garrafa nesta etapa.
   5. Transfira os embriões secos da peneira para uma placa de uva de 10 cm usando uma escova de tinta²¹ (Figura 1E)
      NOTA: A diclorização manual pode ser usada como alternativa à decorina alvejante²⁴.

Figura 1: Descorionação embrionária. (A) Os embriões foram coletados utilizando uma garrafa de esguicho DI H20, pincel de tinta e peneira de 140 nm. (B) Os embriões foram enxaguados vigorosamente usando uma garrafa de esguicho DI H20 e mancha seca sobre uma toalha de papel. (C) A descorção dos embriões foi realizada em 50% de alvejante durante 2 min e 45 s. (D) Os embriões foram enxaguados vigorosamente usando uma garrafa de esguicho DI H20 e mancha seca sobre uma toalha de papel. Isso foi repetido 4 vezes para remover o excesso de chorion. (E) Os embriões foram então transferidos para placa de uva de 10 cm usando uma escova de tinta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Montagem de embriões para tampas

1. Sob um estereótipo equipado com iluminação de pescoço de ganso, organize duas fileiras de 15-20 embriões em uma seção limpa de placa de uva usando uma ferramenta de colhedor de ovos. Alinhe os embriões em seu lado ventral na mesma orientação em relação às extremidades anterior e posterior. Para fazer os colhedores de ovos dobrarem pinças de aço inoxidável finas até ângulo de 45°. Para revisar a orientação dos embriões D/V, consulte Campos-Ortega et al.²⁰.
   NOTA: É importante que a superfície ventral se sente sobre a placa de uva, pois os embriões serão pressionados sobre um deslizamento de cobertura na etapa 3.5, expondo a superfície dorsal para a imagem. Uma vez que a superfície dorsal é muito mais plana do que a superfície ventral, a imagem da superfície dorsal do lado aumenta o número de núcleos presentes dentro de um único plano Z.
2. Prepare a tampa do espaçador de silicone de 75 mm x 25 mm.
   NOTA: Isso pode ser preparado com antecedência. Prepare várias tampas e armazene-as em uma caixa de slides para mantê-las limpas.
   1. Rastreie o contorno de uma tampa de 75 mm x 25 mm em uma folha espaçadora de silicone de 1,6 mm de espessura e corte o espaçador de silicone usando uma tesoura(Figura 2A).
   2. Usando uma lâmina de barbear, corte um inconjunto de 40 mm x 15 mm do espaçador(Figura 2A).
   3. Adere ao espaçador na tampa e faixa de 10 μL de cola heptana pelo injunto de vidro de deslizamento de tampa exposto(Figura 2A).
      NOTA: Colocar para baixo e até mesmo raia garantirá embriões de imagem no mesmo plano z.
3. Enquanto a cola heptana da etapa 3.2.3 seca, recorra uma seção retangular da placa de uva contendo os embriões da etapa 3.1.
   1. Use uma lâmina de barbear para cortar um retângulo (menor que 40 mm x 15 mm) ao redor das duas fileiras de embriões. Não remova o retângulo ainda.
   2. Corte um segundo retângulo ao lado do primeiro. Remova o segundo retângulo usando o lado da borda reta de uma espátula de aço inoxidável.
   3. Deslize cuidadosamente a borda reta de uma espátula de aço inoxidável sob o primeiro retângulo e remova-a(Figura 2B).
4. Coloque o recorte da placa de uva com embriões no lado externo de um prato de 3,5 cm(Figura 2C).
5. Sob um estereótipo, abaixe uma mancha de cobertura preparada sobre os embriões e pressione suavemente as duas fileiras de embriões sobre a cola(Figura 2D).
6. Se microinjetar embriões, pule para a etapa 4.1. Se não a microinjeção continuar a passo 3.7.
7. Cubra os embriões preenchendo o espaçador de silicone (a meio caminho do topo) com 1:1 - óleo de halocarbono 700: óleo de halocarboneto 27.
8. Forque as bordas inferiores de um adaptador de placa de 4 slides com fita dupla face para evitar que o deslizamento da tampa se mova, mas certifique-se de não colocar a fita no caminho da lente objetiva. Esta fita é crítica. Se o deslizamento de cobertura estiver apenas sentado no adaptador, ele se moverá durante toda a aquisição. Monte o deslizamento de tampa no adaptador de placa de 4 slides.

Figura 2: Preparação e montagem do deslizamento de cobertura. (A) Um contorno de cobertura de 75 mm x 25 mm foi traçado em uma folha de silicone de 1,6 mm de espessura. Use uma tesoura para cortar o contorno. O inset de 40 mm x 15 mm foi cortado do espaçador de silicone e, em seguida, montado no deslizamento de tampas. Listrado 15 μL para baixo no centro do inset. (B) Duas fileiras de 15-20 embriões foram organizadas em uma placa de uva em uma área menor que 40 mm x 15 mm, então essa área foi cortada usando uma lâmina de barbear e espátula de aço inoxidável. (C) A placa de uva cortada foi colocada no topo de um prato vazio de 3,5 cm. (D) Sob um estereómico, a mancha de cobertura de (A) foi baixada e os embriões ficaram presos na raia da cola. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Dessecação e microinjeção de embriões

1. Coloque o deslizamento com embriões sobre um slide para evitar que a parte inferior da tampa fique suja durante a dessecação e microinjeção.
   NOTA: O deslizamento da tampa será imageado sem um slide ligado a ele. Portanto, um microscópio invertido é necessário para a imagem.
2. Dessecado embriões por 5-10 minutos, dependendo da temperatura da sala. Os embriões utilizados para a imagem nos resultados representativos foram dessecados por 7 min a 20 °C em uma câmara contendo uma camada de 1:1 de contas de gel de sílica sobre um agente de secagem(Figura 3A).
3. Imediatamente após a proficação, cubra embriões com 1:1 - óleo de halocarboneto 700: óleo de halocarboneto 27. Encha o espaçador de silicone a meio caminho do topo.
   NOTA: É importante misturar um óleo de halocarboneto de alta viscosidade com um óleo de halocarbono de baixa viscosidade. O óleo de halocarboneto puro 700 (alta viscosidade) retarda a progressão dos ciclos celulares 30 min após a aplicação. Uma mistura de 1:1 de óleo de halocarboneto 700 e óleo de halocarbono 27 consertou este artefato.
4. Carregue agulhas de microinjeção com injetor, em seguida, monte uma no microinjetor e corte-a sob pressão.
   NOTA: Pratique o passo 4.4 algumas vezes antes de realizar o ensaio completo com quaisquer reagentes valiosos. Este é o passo mais difícil no processo de microinjeção.
   1. Carregar agulhas de microinjeção com 2 μL de injetor usando uma ponta de carregamento estendida. Apenas uma agulha de microinjeção é necessária, mas é bom ter agulhas carregadas de reposição por perto para preparar 2 ou 3 agulhas.
      NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter especificações sobre dicas de carregamento estendidas. Agulhas de microinjeção não podem ser carregadas sem pontas de carregamento estendidas devido à natureza única de nossa técnica de microinjeção, que depende da construção da pressão de ar dentro de uma agulha selada e carregada antes de abrir sua ponta.
   2. Coloque uma agulha no microinjetor e deprima o êmbolo a meio caminho da ponta. O objetivo é aumentar a pressão do ar dentro do capilar de vidro(Figura 4A).
      NOTA: Use um microinjetor à base de óleo mineral do êmbolo sem óleo mineral. Em vez de aumentar a pressão com óleo mineral, use o êmbolo para aumentar a pressão do ar.
   3. Abaixe a agulha de vidro em uma lâmina de vidro e corte a ponta da agulha aberta usando uma nova #9 lâmina. Corte a agulha em um ângulo de 45° para produzir uma ponta aberta afiada. O injetor deve fluir até o fundo da ponta sem fluir para fora da agulha. Adicione cuidadosamente 20 μL de óleo de halocarboneto sobre a ponta da agulha e corte-o lentamente a 45°. O injetor deve começar a fluir rapidamente.
   4. Reduza imediatamente a pressão do ar retraindo o êmbolo, mas garanta manter uma taxa de fluxo contínua para evitar que a agulha entupi com membrana de embrião entre as injeções. (Figura 4B).
      NOTA: Se o injetor estiver claro, veja a taxa de fluxo de injeção levantando a agulha de microinjeção dentro e fora do óleo de halocarboneto e observando a taxa de formação de gotículas injetáveis sob um estereoscópio. Ajuste a pressão do ar deprimindo o êmbolo alguns cliques de cada vez, em seguida, mergulhe a ponta de microinjeção dentro e fora do óleo de halocarbono para ver a taxa de formação para novas gotículas após o ajuste.
   5. Use o micromanipulador para posicionar a agulha no centro do campo de visão, em seguida, levante a agulha usando o micromanipulador e remova o slide de vidro debaixo dela. A agulha está agora calibrada para injeção.

Figura 3: Diagrama da câmara de dessecação. Esteé um diagrama de uma câmara de dessecação. A câmara consiste em uma camada de 1:1 de contas de gel de sílica sobre uma camada de secador. Para realizar a dessecação, os embriões foram colocados em cima de uma única tampa de placa de poço. A câmara de dessecação foi fechada 7 min. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Embriões microinjetos
   1. Coloque os embriões no estágio estereomicroscópio sob agulha de microinjeção, mas não baixe a agulha.
   2. Concentre-se em embriões na ampliação de 50x.
   3. Abaixe a agulha até que ela entre no mesmo plano de foco que os embriões. Movendo o slide com uma mão e operando o microinjetor com a outra, injete uma linha de embriões.
   4. Levante a agulha e gire o slide 180° para expor a segunda fileira de embriões à agulha de microinjeção. Abaixe a agulha e injete a segunda fileira de embriões.
      NOTA: Tente fazer isso em menos de 10 minutos. Deixe alguns embriões não injetados para serem usados como controles.

Figura 4: Preparação da agulha de microinjeção. (A) Nestailustração, a intensidade da magenta na agulha é representativa para a pressão do ar. Uma agulha carregada foi montada no microinjetor e o êmbolo foi estendido em 50% para aumentar a pressão de ar dentro da agulha. Certifique-se de que o êmbolo está extremamente retraído antes da montagem. (B) A ponta da agulha foi cortada sob pressão e o êmbolo foi retraído para diminuir a pressão do ar e a vazão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Imagem em um analisador de alto teor

1. Antes de executar este ensaio crie um mapa de placa para um adaptador de slides. Use o editor titular da placa encontrado no menu Gerenciador de Mapas de placas para inserir a dimensão de um adaptador de placa personalizado.
   NOTA: Foi feito um mapa de placas personalizado para o adaptador de placas comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais). O mapa da placa contém as seguintes configurações; Espessura do slide: 1000 μm, Altura inferior: 1,607 mm, variabilidade da altura inferior: 100 μm, material substrato: vidro, espessura do deslizamento de tampas: 150 μm, posição de deslizamento: inferior – linhas: 1 – espaçamento: 56.987 mm, colunas: 4 – espaçamento 28.391, tamanho e forma: retângulo, largura 23,00 mm, altura: 73,00 mm, offset para A1 21,29 mm – 42,74 mm)
2. Carregue o adaptador de slides no microscópio e use o recurso Preview para azulejo uma imagem de 10x brightfield do deslizamento de tampas.
3. Selecione um embrião na parte superior ou inferior de uma linha e selecione Objetivo e mude para 60x (NA 0,95). Determine uma exposição adequada para o canal de fluorescência desejado.
   NOTA: Mantenha a intensidade do laser abaixo de 25% para imagens de células vivas.
4. No painel principal, use o recurso Preview para azular uma imagem fluorescente de 60x contendo ambas as fileiras de embriões.
5. No painel principal, selecione o menu de queda binning e defina o binning para 1 x 1 para uma resolução ideal.
6. Use a guia z Stack Setup para definir parâmetros para pilhas z.
   1. Na guia z Stack Setup, use as setas para cima e para baixo para encontrar, em seguida, definir os limites de pilha z superior e inferior. Uma vez definidos os limites superior e inferior, selecione o ícone do lápis verde para salvar a posição da pilha z. Observe a posição da pilha z, pois será usada na etapa 5.6.5.
   2. Na guia z Stack Setup, use a caixa de entrada z Passo definir espaçamento entre fatias z.
      NOTA: O número total de fatias é determinado pela modulação da etapa 5.6.1 e 5.6.2.
   3. No painel principal, clique com o botão direito do mouse no Canal Fluorescente e use o menu drop down do Modo de Imagem para definir o modo de imagem como 3D.
   4. No painel principal, selecione a Caixa de Foco Automático a Laser para desativar o foco automático.
   5. No painel principal, defina o Foco Inicial com a posição z-stack a partir da etapa 5.6.1 e selecione a Caixa de Foco Inicial para desativar o recurso "Refoco em cada Ponto de Tempo".
7. Na guia Campos, use o menu suspenso de colocação de campo para ativar pontos personalizadose use as setas para selecionar pontos para imagem.
   NOTA: O intervalo de tempo entre as aquisições (etapa 5.8) determinará quantos pontos personalizados podem ser retratados simultaneamente.
8. Na guia Série Time, selecione a caixa 'Série Tempo' para habilitar o recurso série temporal e, em seguida, defina o número total de pontos de tempo.
   NOTA: 6 pontos personalizados x 5 z fatias x 80 pilhas = 2.400 imagens, 2.400 imagens x 8,2 MB por imagem = 19,68 GB de espaço em disco.
9. No painel principal, use a Caixa de Entrada de Nomes para nomear as configurações de aquisição e selecione Arquivo e Salvar para salvar as configurações de aquisição.
10. No painel principal, selecione o botão Digitalizar para executar a aquisição.

6. Pós-processamento de imagem

1. Arraste e solte o arquivo xdce em Fiji para abrir a série de imagens como um hipersepilado multidimensional.
2. Salve o hiperseto como um arquivo tif.
3. Crie projeções de intensidade máxima e salve-as como arquivos tif.
4. Monte uma biblioteca de projeções de intensidade máxima e construa um pipeline para extração e análise de dados.

Resultados

A abordagem apresentada neste protocolo foi utilizada para examinar o papel dos microtúbulos na reorganização do Ritúlume Endoplasmico (ER) durante a mitose no embrião Drosophila ¹⁵. Durante a mitose, a estrutura do ER exibe uma reorganização dramática, no entanto, as forças que conduzem essas mudanças são mal compreendidas. Recentemente, uma família de proteínas de formação de ER mostrou-se para promover a formação do túbulo^{ER 25,26,27,28}, que são conhecidos por sua proximidade com microtúbulos²⁸. Para estudar o rolo de microtúbulos sobre a morfologia do ER, os métodos fornecidos no protocolo foram utilizados para gerar dados para comparar quantitativamente os efeitos de vários tratamentos medicamentosos microinjetados na reorganização do ER durante a mitose. A colchicina, que previne a nova polimerização de microtúbulos, foi encontrada para reduzir drasticamente a reorganização do ER durante a mitose, como mostrado nas Figuras 5 e Figura 6. Além disso, a abordagem aqui descrita possibilitou a produção de dados de imagem de voltas de tempo para 32 embriões. Medições médias e de intensidade máxima foram produzidas a partir de 12.800 regiões de interesse usando um script MATLAB personalizado, o que também gerou estatísticas descritivas e inferenciais vitais para fazer comparações entre tratamentos medicamentosos. Devido à disponibilidade de sondas moleculares e à facilidade das microinjeções, os métodos descritos aqui são facilmente adaptáveis para estudar uma variedade de processos biológicos através da quantificação da intensidade da fluorescência.

Figura 5: Imagens representativas do enriquecimento rtnl1-GFP e ReepB-GFP nos polos de fuso durante a mitose. (A) campo de visão de 60x de ReepB-GFP durante a mitose no ciclo celular 10. O quadrado azul representa o campo de visão usado para painéis B-E. O painel A é processado com um filtro binário limiar. Este filtro não foi aplicado aos painéis B-E, pois exclui dados de pixels abaixo do limite definido. (B,D) ReepB-GFP no controle, e em colchicina. (C,E) RTNL1-GFP no controle, e em colchicina. Este número foi modificado a partir de Diaz et al.¹⁵. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Quantitação do enriquecimento rtnl1-GFP e ReepB-GFP nos polos de fuso durante a mitose. Foram analisados 20 fusos e 20 ROIs de citoplasma em 10 quadros para 32 embriões nas seguintes condições. (A) Injeções de controle de 10% DMSO para os embriões de controle Rtnl1-GFP. mostraram um aumento de 0,1 vezes no enriquecimento (p<0,001 para todas as amostras em T210) em comparação com amostras não injetadas (p < 0,001 para todas as amostras em T210). (B) Embriões ReepB-GFP injetados com DMSO de 10% para servir de controle. Os embriões de controle apresentaram um aumento de 0,1 vezes no enriquecimento (p<0,001 para todas as amostras em T210) em comparação com amostras não injetadas(Figura 1E; p < 0,001 para todas as amostras em T210). (C) Embriões rtnl1-GFP injetados com 5 μM colchicine. Aqui medimos uma redução no enriquecimento Rtnl1-GFP para fusos (p < 0,001 para todas as amostras em T210) em comparação com controles (A) (p < 0,001 para todas as amostras em T210). (D) Embriões ReepB-GFP injetados com 5 μM colchicine. Medimos uma redução no enriquecimento ReepB-GFP para eixos (p<0,001 para todas as amostras em T210) em comparação com controles (B) (p<0,001 para todas as amostras em T210). Este número foi modificado a partir de Diaz et al.¹⁵. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Pasta de Levedura21	2. Placas de Uva21	3. Cola heptana24
1.1 Adicione 7 gramas de levedura seca ativa a um cônico de 50 ml. Adicione 9 mililitros de água DI e misture até mesmo a constância com uma espátula metálica.	2.1 Faça solução a: Adicione 6 gramas de ágar a 140ml de água DI em um frasco de 250ml e autoclave-o.	3.1 Encha um frasco de cintilação de vidro com 50 polegadas de fita dupla face.
1.1 Adicione 7 gramas de levedura seca ativa a um cônico de 50 ml. Adicione 9 mililitros de água DI e misture até mesmo a constância com uma espátula metálica.	2.2 Faça a solução b: Misture 0,1 gramas de parabeno de metila em 2ml de etanol, em seguida, adicione esta solução a 60ml de concentrado de suco de toranja.	3.2 Adicione 20 ml de heptano e frasco de cintilação de vidro de vedação com parafilm. Gire durante a noite em temperatura ambiente.
	2.3 Imediatamente após a solução de autoclaving a, misture a solução b e despeje a mistura em pratos perti de 10 x 35mm. (faz 35 pratos de uva)	3.3 Remova os detritos de fita plástica transferindo cola para tubos cônicos de 2 15 ml e centrifugando a 3000 RPM por 15 minutos.
	2.4 Deixe as placas de uva fixar em temperatura ambiente durante a noite com tampas de placa desligadas. Cubra as placas com tampas e armazene em 4C° depois de definidas.	3.4 Transfira a cola sobrenatante em tubos de microcentrifuuge de 1,5 ml para armazenamento.

Tabela 1: Receitas de mídia e soluções.

Discussão

O protocolo descrito aqui é altamente versátil e facilmente adaptável para o estudo de eventos biológicos em uma variedade de estágios no desenvolvimento embrionário de Drosophila. Este protocolo é adequado para estudar processos biológicos que ocorrem por longos períodos de tempo. Por exemplo, estudos de celularização^29,30 ou a formação de domínios heterocromatinas em Drosophila^31,32 poderiam se beneficiar da utilização dos métodos descritos neste protocolo, uma vez que esses processos ocorrem por um longo período de tempo. Além disso, o tamanho da amostra pode ser aumentado diminuindo a ampliação para estudar questões que requerem menos resolução óptica, como o tempo entre as divisões sincicial³³ ou a duração da gastrulação³⁴.  Da mesma forma, um objetivo de 20x permite que dois embriões sejam imagens dentro de um plano de imagem. Os métodos deste protocolo fornecem uma plataforma dinâmica para fazer perguntas biológicas usando o desenvolvimento embrionário como um sistema modelo para análise quantitativa.

Há 3 passos críticos neste protocolo. Pós-descorção em 50% de alvejante é imperativo que os embriões sejam enxaguados e secos vigorosamente 5 vezes (2,3,4). Esta etapa remove quaisquer restos de pequenos pedaços de chorão. O acorde restante obstruirá o campo de visão ao fotografar o embrião. Ao montar os embriões na tampa de vidro (3.5), é importante pressionar os embriões sobre a cola com pressão uniforme. Isso colocará os embriões no mesmo plano z. Ao cortar a agulha de microinjeção, é importante retrair o êmbolo imediatamente para ajustar a taxa de fluxo da agulha ou você perderá todo o seu injetor.

Nosso estudo foi limitado por dois fatores. O primeiro fator foi não ter um processo automatizado de segmentação. No entanto, projetamos um script de segmentação manual usando o MATLAB; com um marcador de fuso geneticamente codificado este processo poderia ser automatizado. No futuro, gostaríamos de produzir CNN-RFP²¹, Rtln1-GFP e CNN-RFP; Linhas transgênicas ReepB-GFP para permitir a segmentação automatizada do eixo. Para obter mais informações sobre nosso pipeline de script e análise MATLAB, consulte materiais suplementares de Diaz et al.¹⁵. Em segundo lugar, também fomos limitados pelo nosso intervalo de aquisição de 35 s, o que só nos permitiu imaginar 6 embriões simultaneamente. Um intervalo de aquisição mais longo nos permitiria imaginar mais embriões simultaneamente. Embora a produção de medicamentos possa ser aumentada substituindo a microinjeção por uma etapa de permeação, achamos que isso é desnecessário, uma vez que nosso tamanho amostral já estava limitado pelo intervalo de aquisição.

Embora este protocolo tenha sido usado para a imagem do desenvolvimento embrionário de Drosophila, a abordagem global é adaptável para estudar o desenvolvimento embrionário em outros sistemas de modelos multicelulares, como C. elegans,Ouriços do Mar e Xenopus. Os embriões são extremamente úteis para a análise quantitativa, uma vez que são facilmente sincronizados através da coleta ou fertilização. Além disso, os embriões não se movem ou nadam para longe de um campo de visão, permitindo o uso de um simples software capaz de aquisição de vários pontos para produzir múltiplos vídeos de lapso de tempo para análise quantitativa. Embora tenhamos usado um analisador de alto teor em nosso estudo, qualquer sistema de microscópio invertido capaz de aquisição de vários pontos pode ser emparelhado com os métodos aqui referidos.

Resultados semelhantes podem ser obtidos por meio de um microscópio confocífilo invertido de aquisição multiponto; no entanto, as vantagens de um analisador de alto teor emergem à medida que se aumenta o tamanho da amostra para estudar questões que requerem menos resolução no tempo. Uma vantagem óbvia para usar um analisador de alto conteúdo é a capacidade de imagem de 4 slides separados simultaneamente em comparação com 1 slide em sistemas tradicionais. Com um conjunto completo de 4 slides e 40 embriões em cada slide, 160 embriões podem ser imagens ao longo de várias horas, desde que o intervalo de aquisição seja de pelo menos 15 minutos entre os quadros. Outra vantagem importante para o uso de um analisador de alto teor é que as amostras são completamente seladas de quaisquer fontes de luz externas, o que é necessário para medições baseadas em intensidade de fluorescência. Por fim, o analisador de alto teor usado em nosso estudo tem uma câmera CMOS de 5,5 megapixels que fornece um generoso campo de visão de 221,87 μm na ampliação de 60x. Esse campo de visão maior nos permitiu imaginar metade de um embrião por ponto de aquisição.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Micro Prato 10 x 35mm	VWR	Cat #: 10799-192	N/A
100% concentrado de suco de uva	Welch's, 100% concentrado de suco de uva	N/A	Compre no supermercado
250ml Erlenmeyer Frascos, Boca Estreita	VWR	Cat #: 10536-914	N/A
Peneira Não Metálica de 3" No. 140	Gilson Company	SV-165 #140	N/A
4 Slide Imaging Bandeja	Grace Biolabs	SKU: 400104	N/A
ACROS Organics , n-Heptano, 99+%, para espectroscopia	Fisher Scientific	Cat #: AC411255000	N/A
Acros Organics, Etanol, 99,5%, reagente ACS, absoluto, 200 provas	Fisher Scientific	Cat# : AC615095000	N/A
Acros Organics, Metil 4-hidroxibenzoato, 99% . (metil parabeno)	Fisher Scientific	Cat#: AC126961000	N/A
Cover Slip, Retangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass	Fisher Scientific	Cat #: 50-143-782	N/A
Material da Folha de Silicone do Poço de Cultura - 1.6mm	de espessura Grace Biolabs	SKU: 664273	N/A
DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Frascos de Cintilação Líquida Fisher	Scientific	Cat #: 03-341-71A	N/A
Gaiola de Coleta de Embriões-Mini	Genesee Scientific	Cat #: 59-105	N/A
Eppendorf Microloader Pipeta Tips	Código do Produto	Fisher Scientific	N/A
Centrífuga Cônica Falcon 15mL	Fisher Scientific	Cat #: 05-527-90	N/A
Falcon 50mL Tubos de Centrífuga Cônica	Fisher Scientific	Cat #: 14-432-22	N/A
Fleischmann's, Fermento Seco Ativo	Fleischmann's	N/A	Compra em Mercearia
Pratos de Uva	REFFERIR-SE À PREPARAÇÃO DA RECEITA	N/A	N/A
Óleo Halocarbon 27	Genesee Scientific	Cat #: 59-133	N/A
Óleo Halocarbon 700	Genesee Scientific	Cat #: 59-131	N/A
Cola de Heptano	REFIRA À PREPARAÇÃO DA RECEITA	N/A	N/A
Lâminas de Barbear Industriais (Aço Carbono Cirúrgico) Único Gume No. 9	VWR	Cat #: 55411-050	N/A
Filme de Vedação de Laboratório Parafilm M, Rolo de 4 polegadas x 250 pés Fisher	Scientific	Cat #: 50-998-944	N/A
Fita Dupla Face Scotch com Dispensador, Largura Estreita, Projetada para Colagem, 1/2" x 7 yds., 3/Pack Caddy	Fisher Scientific	Cat #: NC0879005	N/A
Contas de gel de sílica, dessecante ~ 2 - 5 mm	Millipore Sigma	SKU: 1077351000	N/A
Colher/Espátula de Aço Inoxidável	VWR	Cat #: 470149-044	N/A
W.A. Hammond Drierite Indicando Absorventes Fisher	Scientific	Cat #: 23-116582	N/A
Pasta de Levedura	REFIRA À PREPARAÇÃO DE RECEITA	N/A	N/
AEQUIPMENT
Allegra X-12 Bancada, Centrífuga	Beckman Coulter	N/A	Você precisará de acesso a inserções centrífugas cônicas de 15 ml.
Autoclave	N/A	N/A	Qualquer autoclave serve.
Microinjetor Drummond Nanoject II.	Drummond Scientific	N/A	Este é um sistema de injeção à base de óleo mineral.
Analisador de células GE Healthcare IN 6000.	GE healthcare	N/A	Um microscópio confocal rápido capaz de aquisição multiponto pode ser substituído.
Geladeira (4C°)	N/A	N/A	O meio de mosca e a pasta de levedura devem ser armazenados a (4C°).
Microscópio Estéreo Zies Stemi 508 com base Transillumination 300 e iluminação de pescoço de ganso suspenso.	Zeiss Microscopia	N/A	A base de transiluminação e a iluminação gooseneck são necessárias.