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Artigo de método

Fotoimunoterapia infravermelha próxima para modelos de mouse de disseminação pleural

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DOI:

10.3791/61593

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9 de fevereiro de 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Respiratory Medicine, Nagoya University Graduate School of Medicine, 2Nagoya University Institute for Advanced Research, 3B3-Unit, Advanced Analytical and Diagnostic Imaging Center (AADIC)/Medical Engineering Unit (MEU), Nagoya University Institute for Advanced Research

Neste artigo

Resumo

A fotoimunoterapia quase infravermelha (NIR-PIT) é uma estratégia terapêutica emergente do câncer que utiliza um conjugado de anticorpos fotoabsorto (IR700Dye) e luz NIR para destruir células cancerosas. Aqui, apresentamos um método para avaliar o efeito antitumoral do NIR-PIT em um modelo de camundongo de câncer de pulmão disseminado pleural e mesotelioma pleural maligno usando bioluminescência por imagem.

Resumo

A eficácia da fotoimmunoterapia pode ser avaliada com mais precisão com um modelo de rato ortotópico do que com um subcutâneo. Um modelo de disseminação pleural pode ser utilizado para a avaliação de métodos de tratamento para doenças intratorácicas, como câncer de pulmão ou mesotelioma pleural maligno.

A fotoimuneterapia quase infravermelha (NIR-PIT) é uma estratégia de tratamento de câncer recentemente desenvolvida que combina a especificidade dos anticorpos alvo de tumores com toxicidade causada por um fotoabsorto (IR700Dye) após a exposição à luz NIR. A eficácia do NIR-PIT tem sido relatada usando vários anticorpos; no entanto, apenas alguns relatórios mostraram o efeito terapêutico dessa estratégia em um modelo ortotópico. No presente estudo, demonstramos um exemplo de avaliação da eficácia do modelo de câncer de pulmão disseminado pleural, que foi tratado utilizando NIR-PIT.

Introdução

O câncer continua sendo uma das principais causas de mortalidade, apesar de décadas de pesquisa. Uma das razões é que a radioterapia e a quimioterapia são técnicas altamente invasivas, o que pode limitar seus benefícios terapêuticos. Terapias de alvo celular ou molecular, que são técnicas menos invasivas, estão recebendo maior atenção. Fotoimmunoterapia é um método de tratamento que aumenta sinérgicamente o efeito terapêutico combinando imunoterapia e fototerapia. A imunoterapia aumenta a imunidade tumoral aumentando a imunogenicidade do microambiente tumoral e reduzindo a supressão imunoregulatória, resultando na destruição de tumores no corpo. A fototerapia destrói tumores primários com uma combinação de fotosensibilizadores e raios de luz, e antígenos específicos do tumor liberados das células tumorais aumentam a imunidade tumoral. Os tumores podem ser tratados seletivamente usando fotosensibilizadores, pois são específicos e seletivos para as células-alvo. A modalidade de fototerapia inclui terapia fotodinâmica (TT), terapia fototérmica (PTT) e terapias à base de fotoquímica1.

A fotoimuneterapia quase infravermelha (NIR-PIT) é um método recentemente desenvolvido de fototerapia antitumoral que combina terapia fotoquímica e imunoterapia1,2. NIR-PIT é uma terapia molecularmente direcionada que tem como alvo moléculas específicas da superfície celular através da conjugação de um corante de fttallocianina de silício quase infravermelho, IRdye 700DX (IR700), para um anticorpo monoclonal (mAb). A membrana celular da célula alvo é destruída após a irradiação com luz NIR (690 nm)3.

O conceito de usar terapia leve direcionada combinando fotosensibilizadores convencionais e anticorpos ou PDT direcionado tem mais de três décadasde idade 4,5. Estudos anteriores tentaram atingir agentes convencionais do PDT conjugando-os a anticorpos. No entanto, houve um sucesso limitado porque esses conjugados estavam presos no fígado, devido à hidroofobidade dos fotosensibilizadores6,7. Além disso, o mecanismo do NIR-PIT é completamente diferente do do PDT convencional. Fotosensibilizadores convencionais geram estresse oxidativo que resulta de uma conversão de energia que absorve energia leve, desloca para um estado animado, transita para o estado terrestre e causa apoptose. No entanto, o NIR-PIT causa necrose rápida ao destruir diretamente a membrana celular, agregando fotosensibilizadores na membrana através de uma reação fotoquímica8. NIR-PIT é superior ao PDT convencional de muitas maneiras. Fotosensibilizadores convencionais têm coeficientes de baixa extinção, exigindo a fixação de um grande número de fotosensibilizadores a uma única molécula de anticorpos, reduzindo potencialmente a afinidade vinculativa. A maioria dos fotosensibilizadores convencionais são hidrofóbicos, dificultando a vinculação dos fotosensibilizadores a anticorpos sem comprometer sua imunoreatividade ou acúmulo de alvos in vivo. Fotoensibilizadores convencionais normalmente absorvem luz na faixa visível, reduzindo a penetração de tecidos.

Vários estudos sobre nir-PIT direcionados a tumores intratoráculos, como câncer de pulmão e mesotelioma pleural maligno (MPM) foram relatados9,10,11,12,13,14,15,16,17. No entanto, apenas alguns relatórios descreveram a eficácia do NIR-PIT nos modelos de MPM disseminados pleural ou câncer de pulmão9,10,11,12. Os modelos de xenoenxerto tumor subcutâneo são considerados modelos de tumor padrão e atualmente são amplamente utilizados para avaliar os efeitos antitumorais das novas terapias18. No entanto, o microambiente tumoral subcutâneo não é permissivo para o desenvolvimento de uma estrutura tecidual adequada ou uma condição que recapitula adequadamente um verdadeiro fenótipo maligno19,20,21,22. Idealmente, os modelos de doenças ortotópicas devem ser estabelecidos para uma avaliação mais precisa dos efeitos antitumorais.

Aqui, demonstramos um método de avaliação de eficácia em um modelo de camundongo de câncer de pulmão disseminado pleural, que foi tratado usando NIR-PIT. Um modelo de camundongo de disseminação pleural é gerado pela injeção de células tumorais na cavidade torácica e confirmado usando luminescência de luciferase. O camundongo foi tratado com uma injeção intravenosa de mAb conjugada com irrasiagem IR700 e NIR no peito. O efeito terapêutico foi avaliado por luminescência de luciferase.

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Protocolo

Todos os experimentos in vivo foram realizados em conformidade com o Guia de Cuidado e Uso de Recursos Laboratoriais de Animais do Comitê de Cuidados e Uso animal da Universidade de Nagoya (aprovação nº 2017-29438, #2018-30096, #2019-31234, #2020-20104). Camundongos nus homozigotos de seis semanas foram comprados e mantidos no Centro Animal da Universidade de Nagoya. Ao realizar o procedimento em camundongos, foram anestesiados com isoflurane (introdução: 4-5%, manutenção 2-3%); a pata foi pressionada com pinças para confirmar a profundidade da anestesia.

1. Conjugação de IR700 com mAb

  1. Incubar mAb (1 mg, 6,8 nmol) com éster IR700 NHS (66,8 mgs, 34,2 nmol, 5 mmol/L em DMSO) em 0,1 mol/L Na2HPO4 (pH 8.6) a 15-25 °C para 1 h.
  2. Purifique a mistura usando uma coluna (por exemplo, Sephadex). Prepare e lave a coluna com PBS. Em seguida, aplique a mistura na coluna e colete a gota, que contém o anticorpo conjugado IR700 purificado. Este anticorpo conjugado IR700 é referido como o conjugado fotoensibilizador de anticorpos (APC).
  3. Meça a proteína e a concentração de IR700 no APC.
    1. Prepare as curvas de calibração para proteínas e IR700 usando um espectotômetro.
    2. Misture as concentrações padrão de albumina com um kit de ensaio de proteínas seguindo o protocolo do kit (ver Tabela de Materiais,Coomassie Brilliant Blue (CBB) coloração de proteínas). Meça a absorção da albumina em comprimento de onda de 595 nm e plote a curva de calibração (uma fórmula de aproximação linear) para a proteína usando a seguinte equação: y = ax + b (x: concentração, y: absorção).
    3. Obtenha curvas de calibração para IR700 com absorção a 690 nm usando o mesmo procedimento. A concentração padrão de IR700 é recomendada a 0,1-5 μM (0,1954-9,77 μg/mL).
    4. Meça a concentração de proteína e a concentração de IR700 no APC usando uma curva de calibração [x = (y-b)/a (x: concentração, y: absorvência)].
    5. Determine o número de corantes IR700 ligados por mAb com os resultados da concentração molar.
      NOTA: É importante determinar o número ideal de conjugação de moléculas de IR700 por molécula de mAb. Geralmente, aproximadamente três moléculas de IR700 ligadas a uma única molécula de mAb seriam eficazes tanto in vitro quanto in vivo. Muitos IR700 ligados por anticorpo (por exemplo, seis) torna mais fácil ficar preso no fígado durante experimentos in vivo. A razão de anticorpos ligados ao IR700 foi na faixa de 1:2-1:4. A proporção de IR700 foi reduzida, se necessário.
  4. Realize a eletroforese de gel de sulfato-poliacrilamida de sódio de sódio (SDS-PAGE) como confirmação para a formação de um APC. Imagem do gel a 700 nm usando um imager fluorescente, e manche a proteína no gel usando um kit de coloração de proteínas seguindo o protocolo do kit (ver Tabela de Materiais, Mancha de proteína CBB).

2. Geração de um modelo de disseminação pleural

  1. Prepare células-alvo que expressam a luciferase e suspenda 1,0 × 106 células-alvo em 100 μL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS)
    NOTA: Células cancerígenas intratorácicas, como câncer de pulmão e MPM, são adequadas como células-alvo. As células expressas da luciferase foram preparadas por transfecção genética da luciferase, e a alta expressão da luciferase foi confirmada após > 10 passagens celulares. As células foram cultivadas em meio suplementado com soro bovino fetal 10% e penicilina (100 UI/mL) e estreptomicina (100 mg/mL). O número de células foi ajustado de acordo com a taxa de crescimento do tumor e o tempo de tratamento (1,0. × 105-6,0 × 106 células/peso corporal).
  2. Prepare camundongos nus homozigotos femininos de 8-12 semanas de idade, com um peso corporal preferível de 19-21 g.
  3. Camundongos anestesiado durante o procedimento com isoflurane (introdução: 4-5%, manutenção 2-3%); pressione a cauda com pinças para confirmar que não há reação.
  4. Faça uma rolha com espuma de poliestireno e conecte a rolha à agulha de 30 G para que a ponta permaneça em 5 mm para evitar lesões pulmonares. Dobre a ponta da agulha com fórceps limpos ou pressionando-a contra um objeto duro limpo com 70% de EtOH para evitar pneumotórax(Figura 1).
    ATENÇÃO: Tenha cuidado para não se perfurar. Use fórceps para dobrar a agulha. Não segure a rolha ao anexá-la à agulha. É mais seguro enfiar a rolha antes de encher as células na seringa.
  5. Encha uma seringa (1 mL) com células-alvo e conecte uma agulha 30G com uma rolha.
  6. Desinfete o baú do animal com 70% de EtOH antes do procedimento.
  7. Fure uma agulha no peito do rato através do espaço intercostal. Devido à resistência ao bater contra as costelas naquele momento, a ponta da agulha se moveu para cima e para baixo. Após passar pelo espaço intercostal, pressione a seringa contra o mouse e injete 100 μL de células-alvo(Figura 2).
    NOTA: O rato respira profundamente quando a agulha entra corretamente na cavidade torácica. Com a dobra da ponta da agulha, pneumotórax e injeção inadequada de células no pulmão poderiam ser evitados.
    NOTA: Recomenda-se a punção na parede torácica direita para evitar o risco de punção cardíaca na parede.
  8. Enrole o mouse 2-3 vezes para espalhar as células por toda a cavidade torácica.
  9. Volte o mouse para uma gaiola limpa e quente e monitore até ambulatorial. Após o procedimento, o rato acordará da anestesia e se comportará normalmente.

3. Medição da bioluminescência

NOTA: O software utilizado para aquisição de dados está listado na Tabela de Materiais.

  1. Para confirmar a geração do modelo de disseminação pleural, avalie as imagens de bioluminescência todos os dias após injetar as células na cavidade torácica.
  2. Camundongos anestesiadores (passo 2.3) e injetam intraperitoneal com D-luciferina (15 mg/mL, 200 μL).
  3. Certifique-se de que o mouse está respirando normalmente antes e depois da imagem. Use um aquecedor, se necessário, para evitar hipotermia durante a anestesia.
  4. Dez minutos após a injeção, coloque o mouse no equipamento de medição de bioluminescência (BLI). Para aquisição de imagens, abra o Painel de Controle de Aquisição do software. Selecione Luminescent, Fotografiae Sobreposição (Figura 3).
  5. Definir o tempo de exposição como Auto. Coloque Binning como pequeno.
  6. Definir f/stop como 1 para luminescente e 8 para fotografia; f/stop controla a quantidade de luz recebida pelo detector de dispositivos acoplado por carregada.
  7. Defina o Campo de Visão como C.
  8. Uma vez que a amostra do mouse esteja pronta para a imagem, clique em Adquirir para aquisição de imagens. Foram selecionados camundongos com atividade luciferase suficiente para estudos posteriores.
    NOTA: Um modelo adequado de disseminação pleural mostra forte luminescência no local difuso no peito quando visto do lado ventral. Se as imagens bli não forem difundidas no tórax, e apenas no local da injeção, o tumor pode ser transplantado subcutâneamente.
  9. Depois de exibir a imagem, defina o formato de exibição como Radiance. Abra o painel Paleta de ferramentas (Figura 4A).
  10. Selecione ferramentas de ROI. Recomendamos usar o Círculo para variar a área bioluminescente em imagens.
  11. Clique em Medir ROIs para medir a intensidade bioluminescente da superfície(Figura 4B).
  12. Use configurar medição no canto esquerdo do painel de medição do ROI para selecionar os valores/informações necessários. Exporte esta tabela de dados como um arquivo .csv(Figura 4C).
  13. Use os valores do Fluxo Total (p/s) como quantificação de intensidade bioluminescente no arquivo .csv.

4. Tomografia difusa de imagem de luminescência (DLIT)

NOTA: O software utilizado para aquisição de dados está listado na Tabela de Materiais.

  1. Ligue o botão de raio-X armado.
  2. Anestesiar os camundongos (passo 2.3) e, em seguida, injetar D-luciferin (15 mg/mL, 200 μL) intraperitoneally nos camundongos. Para filmar o DLIT continuamente de 3,2 para 3,7, pule esta etapa.
  3. Dez minutos após a injeção, coloque o mouse no equipamento BLI.
  4. Abra o Painel de Controle de Aquisição do software. Selecione Luminescent, Fotografia, CT, Mouse Padrão-Ume Sobreposição. Outras configurações foram as mesmas de 3.4-3.6 (Figura 5A).
  5. Selecione o assistente de imagem no painel de controle de aquisição.
  6. Selecione Bioluminescência e, em seguida, DLIT (Figura 5B).
  7. Selecione Firefly como o comprimento de onda para medir(Figura 5C).
  8. Defina o sujeito de imagem como mouse,parâmetros de exposição como configurações automáticas,campo de visão como C-13,4 cme Altura do Sujeito como 1,5 cm (Figura 5D).
  9. Empurrar os raios-X será produzido quando energizado. Adquirir.
  10. Abra os dados de imagem sequencial do CT.
  11. Topografia de superfície aberta na paleta de ferramentas. Selecione Show (Figura 6A).
  12. Ajuste o limiar, pois o visor roxo mostra apenas a superfície do corpo(Figura 6B). Em seguida, selecione o Mouse De Assunto Nu e clique na Superfície de Gerar. Certifique-se de que o contorno do mouse está desenhado com precisão(Figura 6C).
  13. Abra a paleta de ferramentas,a guia Propriedades de Reconstrução 3D DLIT. Selecione propriedades de tecido como tecido do mouse e espectro de origem como Firefly (Figura 6D). Em seguida, abra a guia Analisar e confirme os dados de cada dado de comprimento de onda selecionado. Por fim, clique no botão Reconstruir (Figura 6E).
  14. Confirme a presença de BLI na cavidade torácica na imagem DLIT configurada.

5. NIR-PIT para modelo de disseminação pleural in vivo

  1. Meça a dose leve de laser de comprimento de onda de 690 nm (NIR) com um medidor de potência e ajuste a saída para 100 mW/cm2.
    NOTA: A luz laser é coerente com um tamanho preciso da bobina; assim, a energia leve dificilmente muda independentemente da distância dentro de 50 cm. Se houver muitos eventos adversos, como queimaduras, reduza a saída dentro da faixa de 40 mW/cm2.
  2. Limpe a cauda com 70% de EtOH e injete por via intravenosa APC (100 μg) através da veia da cauda 24 h antes da irradiação NIR. Aplique pressão no local da injeção para controlar o sangramento.
    NOTA: Ajuste o volume de APC para 50-200 μL para injeção.
  3. Anestesiar os ratos (passo 2.3), e colocá-los de costas. Para evitar a irradiação do NIR para o local não-alvo, proteja outros locais com papel alumínio(Figura 7A). Irradiar com luz NIR com laser de 100 J/cm2; se o tumor for disseminado de volta à barriga, a dose de irradiação nir-light pode ser dividida em múltiplas direções(Figura 7B).
    NOTA: Ajuste a dose em 30-150 J/cm2, dependendo dos resultados in vitro e eventos adversos, como queimaduras.
  4. Quando a irradiação NIR estiver completa e o mouse estiver acordado, devolva-o para a gaiola.
  5. Observe a BLI e meça o ROI ao longo do tempo (todos os dias) (Ver 3.2-3.12).
  6. Para imagens ex vivo, eutanize camundongos com dióxido de carbono 24 h após a injeção de APC, imediatamente antes da irradiação NIR.
    1. Para observar o interior do baú do rato, remova o tórax e corte as costelas e o esterno. Capture a imagem de fluorescência (700 nm) ao lado do controle sem administração APC. Em seguida, aplique D-luciferina (150 μg/mL) sobre o tórax exposto, e a BLI foi tomada (ver 3.2-3.7).

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Resultados

Anticorpo anti-podoplanina NZ-1 foi conjugado com IR700 para gerar NZ-1-IR700. Confirmamos a vinculação de NZ-1 e IR700 em um SDS-PAGE(Figura 8). A luciferase-expressing H2373 (H2373-luc) foi preparada por células de mesotelioma malignas transfecionantes (H2373) com um gene luciferase10.

Nós anestesiamos camundongos nus homozigote atímicos de 8-12 semanas de idade e injetamos 1 × 10 células H2373-luc na cavidade torácica. O dia d...

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Discussão

Neste estudo, demonstramos um método de medição do efeito terapêutico do NIR-PIT no modelo de disseminação pleural do MPM. A matança celular altamente seletiva foi realizada com NIR-PIT; assim, o tecido normal quase não foi danificado23,24,25. Com este tipo de matança celular seletiva, o NIR-PIT demonstrou ser seguro nos modelos disseminados9,2...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,25 w / v% Tripsina-1mmol / l EDTA 4Na Solução com Fenol VermelhoWako209-016941para cultura de células
Seringa de 1 mLTERUMOSS-01Tpara experimento em camundongos
Agulha 30GNipro1907613para experimento em camundongos
BALB/cSlc-nu/nuJapão SLC
Kit de coloração azul colidalInvitrogenLC6025uso para coloração de proteína em gel
Coomassie (bradford) Plus ensaio de proteínaThermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, EUA)PI-23200para medir a concentração de APC
Dimetilsulfóxido (DMSO)Wako043-07216uso para conjugação de IR700
D-Luciferina (sal de potássio)Cayman Chemical14681para imagens de bioluminescência e DLIT
GraphPad Prism7Software GraphPadpara análise estatística
imagem bioluminescente e DLIT
Living ImagePerkinElmerpara análise de imagem bioluminescente e DLIT
Na2HPO4SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, EUA)S9763uso para conjugação de IR700
NIR LaserChangchun New Industries Optoelectronics TechnologyMRL-III-690Rpara irradiação NIR
Novex WedgeWell 4 a 20%, Tris-Glicina, 1,0 mm, Mini Gel de Proteína, 12 poçosInvitrogenXP04202BOXuso para SDS-PAGE
NuPAGE LDS Sample Buffer (x4)InvitrogenNP0007uso para SDS-PAGE
Medidor de potência ópticaThorlabs (Newton, NJ, EUA)PM100para medir a saída do laser NIR 
PBS(-)Wako166-23555
Sistema de imagem Pearl TrilogyLi-Cor Biosciencespara captura de imagem fluorecente de 700 nm
Solução de penicilina-estreptomicina (x100)Wako168-23191para cultura de células
Cloridrato de puromicinaThermoFisherA1113803para transfecção de luciferase
RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral PrticlesPerkinElmerCLS960002para transfecção de luciferase
RPMI-1640 com L-glutamina e Vermelho de FenolWako189-02025para cultura de células
Sephadex G25 column (PD-10) GE Healthcare (Piscataway, NJ, EUA)17-0851-01uso para conjugação de IR700
UV-1900iShimadzupara medir a concentração de APC
Image Studio Li-Cor Biosciences para análise de imagem fluorescente de 700 nm IRDye 700DX Ester Infrared Dye LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, EUA)929-70011 isoflurano Wako 095-06573 para camundongos anestesia IVIS Spectrum CT PerkinElmer para captura

Referências

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