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Artigo de método

Um modelo de imagem neonatal de sepse bacteriana gram-negativa

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DOI:

10.3791/61609

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12 de agosto de 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine, 2Vaccine Development Center at West Virginia University Health Sciences Center

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A infecção de camundongos neonatais com bioluminescente E. coli O1:K1:H7 resulta em uma infecção séptica com inflamação pulmonar significativa e patologia pulmonar. Aqui, descrevemos procedimentos para modelar e estudar mais a sepse neonatal utilizando imagens intravitais longitudinais em paralelo com a enumeração de cargas bacterianas sistêmicas, perfil inflamatório e histopatologia pulmonar.

Resumo

Os recém-nascidos têm um risco aumentado de sepse bacteriana devido ao perfil imunológico único que apresentam nos primeiros meses de vida. Estabelecemos um protocolo para estudar a patogênese de E. coli O1:K1:H7, um sorotipo responsável pelas altas taxas de mortalidade em recém-nascidos. Nosso método utiliza imagens intravitais de filhotes neonatais em diferentes momentos durante a progressão da infecção. Essa imagem, paralelamente pela medição de bactérias no sangue, perfil inflamatório e histopatologia tecidual, significa uma abordagem rigorosa para entender a dinâmica da infecção durante a sepse. No relatório atual, modelamos dois inóculos infecciosos para comparação de cargas bacterianas e gravidade da doença. Descobrimos que a infecção subescapular leva à infecção disseminada por 10h após a infecção. Às 24 horas, a infecção da E. coli luminescente era abundante no sangue, pulmões e outros tecidos periféricos. A expressão de citocinas inflamatórias nos pulmões é significativa às 24h, sendo seguida por infiltração celular e evidência de danos teciduais que aumentam com a dose infecciosa. A imagem intravital tem algumas limitações. Isso inclui um limiar de sinal luminescente e algumas complicações que podem surgir com recém-nascidos durante a anestesia. Apesar de algumas limitações, descobrimos que nosso modelo de infecção oferece uma visão para entender a dinâmica da infecção longitudinal durante a sepse murina neonatal, que não foi completamente examinada até o momento. Esperamos que este modelo também possa ser adaptado para estudar outras infecções bacterianas críticas durante o início da vida.

Introdução

A sepse bacteriana é uma preocupação significativa para os recém-nascidos que exibem um perfil imunológico único nos primeiros dias de vida que não fornece proteção adequada contra infecção1. A sepse neonatal continua a ser um problema significativo de saúde nos EUA, representando mais de 75.000 casos anualmente apenas nos EUA2. Para estudar essas infecções em profundidade, novos modelos animais que recapitulam aspectos da doença humana são necessários. Estabelecemos um modelo de infecção por camundongos neonatais usando Escherichia coli, O1:K1:H73. E. coli é a segunda principal causa de sepse neonatal nos EUA, mas responsável pela maioria da mortalidade associada à sepse4,5. No entanto, é a principal causa quando os bebês pré-termo e muito baixo peso ao nascer (VLBW) são considerados independentemente5. O sorotipo K1 é mais frequentemente associado com infecções invasivas da corrente sanguínea e meningite em recém-nascidos6,7. Atualmente, não há outras opções de tratamento além de antibióticos e cuidados de apoio. Enquanto isso, as taxas de resistência a antibióticos continuam a aumentar para muitas bactérias patogênicas, com algumas cepas de E. coli resistentes a uma infinidade de antibióticos comumente usados no tratamento8. Assim, é imprescindível que continuemos a gerar métodos para estudar os mecanismos da sepse e a resposta do hospedeiro em recém-nascidos. Esses resultados podem ajudar a melhorar os tratamentos atuais e os desfechos de infecção.

O estado imunológico dos recém-nascidos é caracterizado por diferenças fenotípicas e funcionais em comparação com os adultos. Por exemplo, níveis elevados de citocinas anti-inflamatórias e regulatórias, como a interleucina (IL)-10 e IL-27, mostraram-se produzidas por macrófagos derivados do sangue do cordão umbilical e estão presentes em níveis maiores no soro dos recém-nascidos murinos9,10,11. Isso é consistente com níveis mais baixos de IFN-α, IFN-ɣ, IL-12 e TNF-α que são frequentemente relatados a partir de células neonatais em comparação com as contrapartes adultas10. Além disso, o sistema imunológico neonatal é inclinado para uma resposta celular T Th2 e regulamentar em comparação com adultos12. Números elevados de neutrófilos, células T, células B, células NK e monócitos também estão presentes em recém-nascidos, mas com prejuízos funcionais significativos. Isso inclui defeitos na expressão de marcadores de superfície celular e apresentação de antígeno que sugerem imaturidade13,14,15. Além disso, os neutrófilos neonatais são significativamente deficientes em sua capacidade de migrar para fatores quimotacticos16. As células supressoras derivadas de meloides (MDSCs) também são encontradas em níveis elevados em recém-nascidos e recentemente mostradas como fonte de IL-2711. Os MDSCs são altamente supressivos em relação às célulasT 17. Coletivamente, esses dados demonstram limitações na imunidade neonatal que dão ao aumento da suscetibilidade à infecção.

Para estudar a progressão da carga bacteriana e dissecar as respostas imunes protetoras durante a sepse neonatal, desenvolvemos um novo modelo de infecção. Camundongos neonatais nos dias 3-4 da vida são difíceis de injetar no espaço intraperitoneal ou veia da cauda. Em nosso modelo, dia 3 ou 4 filhotes são administrados o inóculo bacteriano ou PBS subcutâneamente na região escárcula. Uma infecção sistêmica desenvolve-se e utilizando e. coli luminescente O1:K1:H7, podemos imagem longitudinalmente de camundongos neonatais individuais para seguir a carga bacteriana disseminada em tecidos periféricos. Este é o primeiro modelo relatado para utilizar imagens intravitais para entender a cinética da disseminação de bactérias durante a sepse em recém-nascidos murinos3.

Aqui, descrevemos um protocolo para induzir infecções sépticas de E. coli em camundongos neonatais3. Descrevemos como preparar o inóculo bacteriano para injeção, e como colher tecido para avaliação da patologia, medição de marcadores inflamatórios por análise de expressão genética e enumeração da carga bacteriana. Além disso, também é descrito o uso de E. coli luminescente para imagens intravitais de recém-nascidos infectados e quantificação da matança bacteriana por células imunes neonatais. Esses protocolos também podem ser adaptados para estudar outras infecções bacterianas importantes em recém-nascidos. Os dados aqui apresentados representam uma nova abordagem geral para a compreensão da dinâmica da infecção em um modelo de sepse neonatal traduzível.

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Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Atenção e Uso de Animais da Virgínia Ocidental e realizados de acordo com as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório pelo Conselho Nacional de Pesquisa18.

1. Preparação do Inóculo Bacteriano

  1. Listrar uma placa de ágar de soja tripptic (TSA) com um laço inoculante para isolamento de uma única colônia de um estoque congelador de E. coli O1:K1:H7-lux que expressa a luciferase e carrega resistência à kanamicina3. Incubar durante a noite a 37 °C.
  2. No dia seguinte, permita que o caldo de Luria (LB) chegue à temperatura ambiente (25 °C) em um armário de biossegurança.
  3. Sob um capuz de armário de biossegurança, identifique uma única colônia a partir da placa listrada e inocula-a em 3 mL de LB complementada com kanamicina (30 μg/mL). Incubar durante a noite a 37 °C com agitação (220 rpm). Esta é a cultura inicial.
  4. Diluir a cultura inicial 1:100 em um fresco 3 mL de LB sob um capô de armário de biossegurança e devolvê-lo à incubadora por 2-3 h a 37 °C com agitação (220 rpm). Esta é a cultura das ações.
  5. Leia a densidade óptica (OD) da cultura em branco e do estoque a 600 nm usando um espectrômetro. Adicione 100 μL de LB (sem bactérias) em um poço de uma placa de ensaio inferior bem plana; este é o vazio. Em seguida, adicione 100 μL da cultura de estoque a um poço separado. Repita para duas réplicas adicionais. A absorvência é lida usando um leitor de placas.
  6. Subtraia a absorvância em branco do valor de absorção da cultura de estoque (o valor de OD) e compare a uma curva de crescimento previamente gerada e validada para determinar uma aproximação da densidade bacteriana na cultura do estoque para a preparação de dose infecciosa.
  7. Gerar inóculos de alvo dependendo da questão da pesquisa. Foram utilizadas para este estudo inóculo-alvo de 2 x10 6 (baixo) e 7 x 106 (alta) unidades formadoras de colônias (CFUs) por rato (/mouse).
    1. Divida a dose alvo por camundongo (DoseT) pela concentração estimada de bactérias na cultura do estoque (Estoque) para obter o volume de bactérias necessárias do tubo de estoque (VS).
    2. Multiplique VS pelo número de camundongos (NM) que precisam ser infectados junto com o suficiente para 5-10 extras para a quantidade total de bactérias necessárias para a infecção mais 5-10 doses adicionais. Remova este volume do tubo de estoque e adicione-o a um novo tubo de centrífuga.
    3. Use a equação abaixo:
      DoseT/Estoque = VS x NM = volume total (VT) de bactérias a serem removidas do tubo de estoque.
  1. Centrifugar a bactéria a 2.000 x g por 5 min a 4 °C e resuspensar a pelota bacteriana em 50 μL de PBS (pH 7.2-7.6) por rato a ser infectado (por exemplo, para 10 doses de 2 x 106 bactérias cada dose, a pelota de 2 x 107 bactérias seria resuspendida em 500 μL PBS). Mais uma vez, recomenda-se preparar mais inóculo do que o necessário. Prepare um volume igual de PBS apenas para inoculações de controle. Mantenha o controle infeccioso de inóculo e PBS no gelo até a infecção.
  2. Realize sete diluições de série dez vezes em PBS em uma placa de diluição de fundo de plástico de 96 poços, e placa 25 μL das diluições em duplicação em placas TSA quadrantes suplementadas com kanamicina (30 μg/mL) para enumerar a quantidade real de bactérias administradas. Incubar a 37 °C durante a noite para formação de colônias antes da enumeração.

2. Identificação animal

  1. Organize um número suficiente de pares de reprodução de modo que as ninhadas possam ser sincronizadas para filhotes com correspondência etária. A variabilidade etária de ± 1 dia é aceitável.
  2. Identifique um camundongo fêmea C57BL/6 grávida e monitore para o nascimento da ninhada antes do experimento planejado para determinar com precisão a idade.
  3. Para distinguir entre controle e filhotes infectados de 3 ou 4 dias, use um par de tesouras de íris pequenas, de ponta fina para cortar as extremidades das caudas apenas dos filhotes de controle. Os filhotes infectados não recebem cortes de cauda. Antes de cortar a cauda, desinfete a pele com uma bola de algodão torcida em 70% de etanol. Aplique pressão na extremidade da cauda com uma bola de algodão ou gaze conforme necessário.
    NOTA: Este procedimento é realizado sob um capô de armário de biossegurança. Um corte de cauda de aproximadamente 1/8 de polegada é suficiente.
  4. Para identificar filhotes dentro dos grupos de controle e infectados, use uma seringa de insulina de 1 mL com uma agulha permanente de 28 G x 1/2'' para tatuar as caudas dos filhotes. Antes de tatuar, desinfete a pele com uma bola de algodão torcida em 70% de etanol. Este procedimento é realizado sob um capuz de armário de biossegurança.
  5. Para tatuar a cauda, aplique tinta de tatuagem animal na ponta da agulha. Em seguida, contenha cuidadosamente o filhote com uma mão, com a cauda totalmente exposta. Insira suavemente a agulha sob a pele, mantendo um nível superficial de profundidade, e mova a agulha paralelamente com a pele alguns milímetros até que uma pequena marcação, ou ponto, tenha sido criada. Espere alguns segundos antes de remover lentamente a agulha debaixo da pele, para evitar o excesso de tinta liberada sob a pele.
  6. Aplique pressão na ferida com uma bola de algodão ou gaze conforme necessário. Remova o excesso de tinta de tatuagem na superfície da pele com 70% de etanol.
  7. Repita este processo com camundongos subsequentes nos grupos infectados e de controle, enquanto adiciona um ponto adicional a cada filhote sucessivo tatuado (por exemplo, o filhote 1 terá 1 ponto na cauda, o filhote 2 terá dois pontos na cauda, etc.).
    NOTA: Para uma camada adicional de identificação, recomenda-se usar cores separadas de tinta de tatuagem animal para o controle e grupos infectados.

3. Inoculação subscapular

NOTA: Para este estudo, foram realizados 2 experimentos com um grupo de baixa dose e alta dose designado para cada experimento. No primeiro experimento, 7 filhotes receberam a baixa dose inóculo (4 filhotes foram usados como controles), e 5 filhotes de uma ninhada separada receberam a alta dose (3 filhotes foram usados como controles). Os filhotes do experimento 1 forneceram dados para apenas o ponto de tempo de 24 horas. No segundo experimento, 8 filhotes receberam a baixa dose inóculo (2 filhotes foram usados como controles), e 6 filhotes receberam a alta dose de inóculo (2 filhotes foram usados como controles). Filhotes do experimento 2 forneceram dados para os pontos de tempo de 0, 10 e 24 horas.

  1. Filhotes de idade ≤ 1 dia. Atribua cada ninhada como uma dose baixa ou uma ninhada de alta dose. Dentro de uma ninhada aleatoriamente atribui filhotes como um controle ou filhote infectado.
  2. No dia 3 ou 4 pós-natal, regiscões recordes de todos os filhotes antes da inoculação com E. coli-lux ou controle PBS. Separe a represa dos filhotes durante este tempo para garantir que eles não sejam movidos durante a infecção.
  3. Dentro de um armário de biossegurança usando uma agulha de insulina, aspirar pbs ou o E. coli-lux inóculo. Para este trabalho foram utilizados inóculos de 2 x 106 e 7 x 106 CFUs por mouse. Mantenha tanto o inóculo infeccioso quanto o PBS no gelo até a administração através da injeção subescapular.
  4. Coloque o recém-nascido em uma superfície limpa na capa do armário de biossegurança e levante a pele na nuca como se para esfolar o filhote.
  5. No espaço agora criado entre a pele e o músculo do animal, insira a agulha, bisbida para cima, logo abaixo da pele e injete 50 μL de PBS ou E. coli-lux. Solte simultaneamente a porção beliscada da pele para evitar o fluxo de injeção.
  6. Remova a agulha lentamente e com cuidado. Coloque os filhotes de volta com barragens depois que as injeções estiverem terminadas.
    NOTA: Devido ao seu estágio anatômico em desenvolvimento, é tecnicamente desafiador administrar uma veia da cauda ou injeção intraperitoneal para filhotes neonatais no dia 3-4. Assim, a rota de infecção subscapular foi escolhida para este estudo devido à facilidade de execução.

4. Avaliação dos critérios de doença e endpoint

  1. Monitore os filhotes duas vezes ao dia durante a duração da infecção. Note qualquer anormalidade na aparência.
  2. Recorde de pesos como medida objetiva de morbidade.
  3. Além das mudanças de peso, teste a capacidade dos filhotes de se corrigirem posicionando o recém-nascido no lado dorsal. Animais doentes não poderão se virar para o lado ventral e para os pés ou completarão esta ação com dificuldade.
  4. Verifique a seguir para marcar os animais próximos aos critérios de ponto final: menos de 85% do peso corporal normal; diminuição do movimento e incapacidade de se corrigir; descoloração da pele e uma aparência mais cinza ou transparente em oposição ao rosa; sentindo-se frio ao toque, indicativo de diminuição da temperatura corporal e hematomas hemorrágicos ao longo dos lados, também indicativo de doença avançada.
    NOTA: Se os recém-nascidos não conseguiram ganhar peso ao longo de dois dias e se encaixam em qualquer uma das descrições nas etapas 4.4, eles atenderam aos critérios de ponto final. Os filhotes que recebem a alta dose geralmente atendem aos critérios de ponto final até 24 horas. Os filhotes de controle dentro das ninhadas de baixa e alta dose serão eutanizados ao mesmo tempo para permitir a análise comparativa entre o controle e os grupos experimentais. Vá para a seção de eutanásia abaixo.

5. Imagem in vivo de carga bacteriana

  1. Use um imager microCT e um software para imagens e análises subsequentes.
    NOTA: A cor da pele do filhote não afeta a qualidade da imagem.
  2. Coloque a gaiola com camundongos neonatais infectados por E. coli-luxe a barragem em uma coifa de fluxo de nível BSL-2. Remova os ratos para serem imagens e coloque em uma câmara de isoflurane transparente dentro do capô. Recomenda-se começar com controles não infectados para medir a quantidade de isoflurane necessário.
  3. Abra o software no computador conectado ao microCT. Inicialize o sistema e aguarde que a temperatura do CCD seque a -90 °C.
  4. Ligue o vaporizador isoflurane e ajuste o mostrador para 5% de fluxo isoflurane. Mantenha os ratos na câmara com esta mistura de isoflurane por 20-30 s até que eles parem de se mover; podem ser necessários tempos de exposição de anestesia mais longos ou mais curtos para alguns camundongos. Uma vez que os ratos param de se mover, eles são suficientemente anestesiados, e podem ser imagens.
  5. Mova os ratos para a câmara de imagem microCT e coloque-os na caixa de imagem na posição propensa, com narizes voltados perpendiculares para cones do nariz. Use cera dentária para conter suavemente os pés na caixa de imagem para limitar qualquer movimento. Até 4 camundongos neonatais podem ser imagens por vez.
  6. Abaixe o vaporizador isoflurane para 2-4% de fluxo para manter os ratos anestesiados durante a imagem. Feche a porta da câmara de imagem microCT. Verifique os ratos alguns segundos depois. Se eles começarem a se mover, desistam de uma bola de algodão em isoflurane e segure-a no nariz do animal movendo-se por 5 segundos para anestesiar. Mantenha a bola de algodão perto dos animais durante a imagem. Tenha cuidado para não anestesiar demais e acabar com os ratos.
  7. Usando o software, escolha a opção Luminescent para imagem. Use um filtro de excitação definido para bloquear e o filtro de emissão definido para abrir, 500 nm, 520 nm, 560 nm, 580 nm, 600 nm e 620 nm. Haverá sete filtros totais de emissão definidos para luminescência.
  8. Imagem dos ratos em cada ponto de tempo (0, 10 e 24 h pós-infecção [hpi]) e salve todas as imagens em uma pasta para cada ponto de tempo. Devolva os filhotes para a gaiola com a represa e verifique se todos os filhotes se recuperaram da anestesia.
  9. Para analisar imagens 2D, abra imagens no software. Mudar unidades para Radiance (fótons); isso se transformará no Fluxo Total (fótons/segundo).
  10. Apenas analise um conjunto de imagens com seus múltiplos filtros de emissão por vez. A partir de cada conjunto de imagens, anote os valores mínimos e máximos de brilho localizados no canto inferior direito de cada imagem (por exemplo, se houver 7 filtros de emissão, haverá 7 imagens, e 7 valores mínimos e máximos). Repita para cada conjunto de imagens a ser comparado.
  11. Para determinar uma escala que englobará os valores e a luminescência de todas as imagens, localize o menor valor mínimo e o maior valor máximo para cada conjunto de imagens. Para este estudo, as imagens do filtro Aberto foram utilizadas como representativas.
    1. Destaque e abra a imagem escolhida para alterar a escala. Na Paleta de ferramentas,clique na guia Ajustar a imagem e altere a Escala de cores para os menores valores mínimos e mais altos máximos identificados anteriormente. Salve cada conjunto de imagens como um TIFF. Analise individualmente cada ponto de tempo desta maneira para garantir que a escala correta seja exibida.
  12. Para quantificar o fluxo total (quantidade de sinal luminescente por mouse) para cada mouse individual, abra uma imagem como descrito anteriormente na etapa 5.9-5.10. Abra a guia Ferramentas do ROI na Paleta de ferramentas e selecione a ferramenta círculo. Escolha 1 círculo se analisar uma área de luminescência.
  13. Mova o ROI para sobreposição na área de luminescência. Ajuste o tamanho do ROI, se necessário.
    NOTA: Se for necessário o ajuste, ajuste os ROIs em outras imagens comparativamente para manter a consistência. Escolha A medida ROIs. A janela de medições do ROI abrirá exibindo Fluxo Total (p/s), Radiance médio (p/s/cm2/sr), Desvio Padrão de Radiance, Radiance Mínimo e Radiance Máxima.
  14. Regissão total do fluxo para cada conjunto de imagens. Este número é a quantidade quantificada de luminescência no mouse em imagens 2D.
  15. Para fazer imagens microCT reconstruídas em 3D, abra o painel de reconstrução 3D DLIT na Paleta de ferramentas e verifique todos os comprimentos de onda a serem incluídos na guia Analisar. Selecione Reconstruir.

6. Eutanásia

  1. Preparar e rotular tubos para tecidos/órgãos de interesse para necropsia e aplicações adequadas a jusante.
  2. Separe os recém-nascidos da represa em um armário de biossegurança.
  3. Mergulhe uma bola de algodão em isoflurane de grau veterinário e coloque dentro de uma câmara de contenção transparente.
  4. Se coletar sangue, prepare uma micropipette P200 com uma ponta e tenha um tubo de 1,5 mL com 10 μL de 5 mM EDTA como anticoagulante. Um volume de 50-200 μL de sangue é esperado.
  5. Coloque um recém-nascido na câmara e monitore o filhote até que ele fique imóvel.
  6. Rapidamente, remova o recém-nascido e decapite com uma tesoura. Se for permitido respirar ar fresco por um período prolongado, o filhote pode recuperar a consciência. Os recém-nascidos reduziram a capacidade pulmonar em relação aos camundongos adultos e, portanto, não respiram profundamente o suficiente para a eutanásia apenas por isoflurane.
  7. Coletar sangue do tronco na base da cabeça usando uma micropipette P200. Para maximizar a quantidade de sangue coletada, realize esta etapa o mais rápido possível após a decapitação. Enumerar bactérias no sangue por diluição serial e contagem de placas padrão, conforme descrito na etapa 1.9.
  8. Esterilize todo o recém-nascido com 70% de etanol antes da excisão de amostras de tecido.

7. Colheita de tecidos

  1. Dentro de um armário de biossegurança, douque o recém-nascido com 70% de etanol para evitar contaminação. Coloque o animal do lado direito.
  2. Usando fórceps, segure a pele em um ponto entre o abdômen e a perna esquerda traseira e faça uma incisão com uma tesoura cirúrgica de ponta fina. Continue a cortar a pele para cima em direção às costas. Progresso até que todo o baço seja exposto.
  3. Use os fórceps para agarrar o baço e removê-lo do abdômen, usando uma tesoura para desconectar o tecido conjuntivo. Coloque o baço na solução apropriada para sua aplicação a jusante.
  4. Para obter os pulmões, retire completamente a pele do peito.
  5. Entrando na base do esterno com a tesoura presa verticalmente, corte para cima até que a caixa torácica seja dividida.
  6. Use fórceps para agarrar os pulmões direito e esquerdo individualmente e removê-los da cavidade torácica. Remova o coração do tecido pulmonar cortando com uma tesoura.
  7. Coloque o pulmão na solução apropriada para sua aplicação a jusante. Para isolamento de RNA, use 500 μL de guanidine tiocianato/fenol (GTCP). Para histopatologia, use 5 mL de formalina tamponada neutra de 10%.

8. Isolamento de RNA do tecido pulmonar para expressão genética

  1. Pré-esfrie a microcentrifuagem a 4 °C.
  2. Pique o tecido pulmonar em GTCP com uma tesoura. Em seguida, homogeneize o tecido com um homogeneizador alimentado por bateria. Continue até que a solução seja o mais uniforme possível. Incubar em temperatura ambiente por 3-5 min.
  3. Usando pontas filtradas de pipeta, adicione 100 μL de clorofórmio. Inverta o tubo para 15 s e incubar 3-5 min em temperatura ambiente.
  4. Centrífuga por 15 min a 12.000 x g.
  5. Durante o giro, prepare tubos de 1,5 mL com 500 μL de 70% de etanol. Monte e rotule as colunas e tubos de coleta do kit de isolamento do RNA.
  6. Remova cuidadosamente a camada superior e aquosa sem perturbar a camada interfásica que se formou durante a centrifugação. Coloque a camada aquosa nos tubos contendo 70% de etanol.
  7. Mova o etanol e a mistura de lise para a coluna no tubo de coleta.
  8. A partir deste ponto, siga o protocolo de produto comercial do kit de isolamento RNA até a eluição final do RNA.
  9. Analise o RNA para obter pureza e quantidade. Use imediatamente ou armazene a -80 °C até que use mais.

9. síntese cDNA

  1. Rotule os tubos PCR e reserve.
  2. Adicione 1 μg de RNA à mistura de reação cDNA para cada amostra.
  3. Adicione os reagentes e o modelo ao tubo PCR conforme descrito no protocolo cDNA. Adicione a enzima à mistura por último.
  4. Coloque os tubos PCR em um termociclador com as seguintes configurações de execução: 5 min a 25 °C, 40 min a 42 °C, 15 min a 85 °C e 4 °C de espera final.
  5. Remova os tubos PCR do termociclador e use imediatamente ou armazene a -20 °C até que use mais.

10. Ciclo quantitativo de PCR (qPCR) em tempo real

  1. Prepare um coquetel de mistura de reação para cada um dos genes a serem analisados. Cada reação pcr de 15 μL requer 7,5 μL de mistura de reagente de 2x, 0,75 μL de primer/sonda específica de genes com 5'-FAM e 3,75 μL de água sem nuclease. Os amplicons normalmente variam de 60-120 bp.
  2. Adicione 3 μL de modelo cDNA para cada grupo experimental aos poços apropriados.
  3. Adicione 12 μL do coquetel de mistura de reação específico do gene aos poços apropriados.
  4. Cubra a placa com película adesiva óptica e centrífuga por 1 min a 1.000 x g para remover quaisquer bolhas que possam ter se formado nos poços.
  5. Coloque a placa PCR em um termociclizador PCR em tempo real.
  6. Defina o método de execução da seguinte forma: 3 min a 95 °C, 40 ciclos de 95 °C para 15 s seguido de 60 °C para 1 min.
  7. Analise os dados normalizando o gene de interesse para um controle interno e expresse dados de amostras infectadas em relação a amostras de controle não infectadas usando a fórmula 2-ΔΔCt e uma transformação do log2 dos números.

11. Histopatologia pulmonar

  1. Remova os pulmões do filhote neonatal como descrito acima.
  2. Coloque o tecido em um volume de formalina tamponada neutra de 10% para que a razão da solução para o tecido seja de aproximadamente 20:1 por 3-7 dias.
  3. Coordene com um serviço de histologia apropriado para incorporação de parafina, secção e hematoxilina e eosina (H&E) coloração. Para este trabalho, foi utilizado o Núcleo de Histopatologia da Universidade da Virgínia Ocidental. Alternativamente, siga os protocolos descritos anteriormente19.

12. Ensaio de morte bacteriana in vitro

  1. Remova o baço do filhote neonatal não infectado como descrito acima e coloque-o em uma cesta de nylon de 40 μm dentro de uma placa de Petri estéril de 60 mm. Repita isso e o baço da piscina em um tubo a ser colhido e homogeneizado juntos.
  2. Adicione 5 mL de PBS suplementado com 10% de FBS.
  3. Desagregar o tecido usando um êmbolo de seringa estéril de 3 mL até que uma única suspensão celular seja criada.
  4. Colete a suspensão unicelular fora da cesta de nylon, transfira para um tubo de centrífuga de 15 mL e células de pelota a 350 x g por 5 min.
  5. Suspenda as células no tampão de lise de glóbulos vermelhos (2 mL para até 7-8 baços) e deixe-o ficar por 5 minutos à temperatura ambiente para eliminar os eritrócitos.
  6. Lave os esplenócitos com PBS e pelotas como acima.
  7. Suspender os esplenócitos em 0,25 mL de PBS suplementados com 0,5% de BSA e 2 mM EDTA de acordo com o rendimento celular esperado.
  8. Conte os esplenócitos usando um hemócito ou outra aplicação apropriada.
  9. Isolar células Ly6B.2+ (população mieloide de granulócitos/monócitos inflamatórios) com contas imunomagnéticas de acordo com o protocolo do fabricante.
  10. Semente Ly6B.2+ células a uma densidade de 1 x 105 células por poço em uma placa preta ou branca de 96 poços em um volume de 0,1 mL de DMEM que contém 10% FBS, 2 mM de glutamina e 25 mM HEPES (meio completo).
  11. Enumerate bioluminescente E. coli como descrito na seção 1 e preparar o inóculo bacteriano na multiplicidade desejada de infecção (MOI) em um volume final de 0,1 mL. Isso é melhor feito fazendo o que é necessário para todos os poços em um MOI comum em lote.
  12. Adicione 0,1 mL de inóculo bacteriano ou meio completo sozinho como controle. Incubar a placa multi-poço a 37 °C e 5% de CO2 por 1 h.
  13. Substitua a mídia por 0,2 mL de mídia completa fresca que contém gentamicina (100 μg/mL) removendo suavemente a mídia com uma pipeta e adicionando mídia fresca com uma nova ponta de pipeta. Devolva a cultura à incubação por mais 2h.
  14. Às 3h pós-infecção, meça a luminescência em cada poço da placa de cultura tampada a partir do fundo usando um leitor de placas e, em seguida, devolva a cultura à incubação.
  15. Repita as medidas de luminescência em outros pontos de tempo desejados.

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Resultados

Este protocolo induziu a sepse bacteriana em camundongos neonatais, e utilizamos imagens intravitais longitudinais, enumeração de bactérias no sangue, avaliações histológicas da patologia e perfis inflamatórios de expressão de citocinas para estudar o curso da doença. Foram observados sinais de morbidade em filhotes neonatais infectados com inóculos baixos (~2 x 106 CFUs) e altos (~7 x 106 UFC) de E.coli ao longo do tempo. Os filhotes que receberam o maior inóculo apresentaram sinais mais p...

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Discussão

Nosso modelo de infecção subscapular para induzir a sepse bacteriana em camundongos neonatais é um novo método para estudar a disseminação longitudinal de patógenos bacterianos em tempo real. A imagem intravital oferece a oportunidade de explorar a disseminação bacteriana em tempo real em recém-nascidos. Isso é fundamental para entender a cinética da disseminação bacteriana e estudar melhor a resposta e os danos do hospedeiro na fase apropriada da doença. Filhotes de rato são administrados uma injeção subcutânea e subsca...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por fundos institucionais para c.M.R.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 mL de seringa de insulinaCoviden1188128012Inóculo ou injeção de PBS
10% de formalina tamponada neutraVWR89370-094Histopatologia
ACK Lise BufferGibcoLSA1049201Ensaio de depuração bacteriana
Pasta de tinta de tatuagem animalKetchumKI1482039Identificação de animais
Tinta de tatuagem animal Pasta verdeKetchumKI1471039Identificação animal
Anti-Ly-6B.2 MicroesferasMiltenyi Biotec130-100-781Isolamento celular
Escherichia coli O1:K1:H7ATCC11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expressa luciferase)N/AN/AConstruído internamente na WVU
E.Z.N.A. HP Kit de RNA de Extração TotalOmega Bio-tekR6812Extração de
RNA DPBS, 1XCorning21-031-CV
Difco Ágar Tripta de SojaBecton, Dickinson and Company236950Crescimento bacteriano
IL-1 beta Primer/Sonda (Mm00434228)Thermo Fisher Scientific4331182Expressão de citocinas qPCR
IL-6 Primer/Sonda (Mm00446190)Thermo Fisher Scientific4331182Expressão de citocinas qPCR
iQ SupermixBio-Rad1708860PCR quantitativo em tempo real
Kit de síntese de cDNA iScriptBio-Rad1708891síntese de cDNA
Tampão de isolamentoMiltenyi BiotecN/AEnsaio de depuração bacteriana
IVIS Spectrum CT e Living Image 4.5 SoftwarePerkin ElmerN/AIntravital imaging
LB Broth, LennoxFisher BioReagentsBP1427-500Crescimento bacteriano
EASYstrainer (Nylon Basket)Greiner Bio-one542 040Cell strainer
SpectraMax iD3Molecular DevicesN/ALeitor de placas
Pellet Pestle MotorGrainger6HAZ6Homogeneização de tecidos
Pellet de polipropileno PestlesGrainger6HAY5Homogeneização de tecidos
Prime Thermal CyclerTechne3PRIMEBASE/02síntese de cDNA
TNF-alfa Primer/Sonda (Mm00443258)Thermo Fisher Scientific4331182Expressão de citocinas qPCR
TriReagent (GTCP)Centro de Pesquisa MolecularTR 118Extração de RNA

Referências

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Etiquetas

Modelo de Sepse NeonatalImagem IntravitalDisseminação BacterianaE. coli O1:K1:H7Rastreamento de Bactérias LuminescentesImagem por Micro-CTExpressão de Citocinas InflamatóriasAnálise Histopatológica de TecidosMedição da Carga BacterianaResposta Imune do Hospedeiro
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