Gerando Bibliotecas de Inserção Transposon em bactérias gram-negativas para sequenciamento de alto rendimento

Resumo

Descrevemos um método para gerar bibliotecas mutantes transposon saturadas em bactérias Gram-negativas e preparação subsequente de bibliotecas de amplicon de DNA para sequenciamento de alto rendimento. Como exemplo, focamos no patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii,mas este protocolo é agradável para uma ampla gama de organismos Gram-negativos.

Resumo

O sequenciamento transposon (Tn-seq) é um método poderoso que combina mutagênese transposon e sequenciamento paralelo maciço para identificar genes e caminhos que contribuem para a aptidão bacteriana sob uma ampla gama de condições ambientais. As aplicações tn-seq são extensas e não só permitiram o exame das relações genótipo-fenótipo a nível de organismo, mas também nos níveis populacional, comunitário e de sistemas. As bactérias gram-negativas estão altamente associadas com fenótipos de resistência antimicrobiana, o que aumentou os incidentes de falha no tratamento de antibióticos. A resistência antimicrobiana é definida como crescimento bacteriano na presença de antibióticos letais de outra forma. A colistina antimicrobiana de "última linha" é usada para tratar infecções bacterianas gram-negativas. No entanto, vários patógenos Gram-negativos, incluindo Acinetobacter baumannii podem desenvolver resistência à colistina através de uma série de mecanismos moleculares, alguns dos quais foram caracterizados usando Tn-seq. Além disso, as vias de transdução de sinais que regulam a resistência à colistina variam dentro das bactérias Gram-negativas. Aqui propomos um método eficiente de mutagênese transposon em A. baumannii que agiliza a geração de uma biblioteca de inserção transposon saturada e construção de biblioteca de amplicon, eliminando a necessidade de enzimas de restrição, ligadura adaptadora e purificação de gel. Os métodos aqui descritos permitirão uma análise aprofundada dos determinantes moleculares que contribuem para a aptidão de A. baumannii quando desafiados com colistina. O protocolo também é aplicável a outros patógenos ESKAPE gram negativos, que estão principalmente associados a infecções hospitalares resistentes amedicamentos.

Introdução

A descoberta de antibióticos é, sem dúvida, um dos eventos mais impactantes relacionados à saúde do século^XX. Os antibióticos não só resolvem rapidamente infecções bacterianas graves, como também desempenham um papel fundamental na medicina moderna. Cirurgias de grande porte, transplantes e avanços em medicina neonatal e quimioterapia deixam pacientes suscetíveis a infecções que ameaçam a vida e essas terapias não seriam possíveis sem antibióticos^1,,2. No entanto, o rápido desenvolvimento e disseminação da resistência a antibióticos entre patógenos humanos diminuiu significativamente a eficácia de t....

Protocolo

1. Preparação de cepas bacterianas

1. Listrar a cepa "doador"(E. coli MFD DAP^-/pJNW684, Tabela de Materiais) para colônias isoladas no ágar Luria-Bertani suplementado com ácido diaminopimelic de 600 μM (DAP), 100 mg/L de ampicillina e 25 mg/L de kanamicina. Incubar durante a noite a 37 °C. Utilizando uma única colônia isolada, inocular 50 mL de caldo de Luria (LB) suplementado com 600 μM DAP, 100 mg/L de ampicillina e 25 mg/L de kanamicina em um frasco erlenmeyer de 250 mL e rotulá-lo como "doador".
2. Listrar a cepa "receptora"(A. baumannii cep ATCC 17978, Tabela de Materiais) para colônias....

Resultados

Os métodos descritos descrevem a geração de uma biblioteca transposon de alta densidade em A. baumannii cep ATCC 17978 através de conjugação bacteriana utilizando E. coli MFD DAP^-, que replica o plasmídeo pJNW684 (Figura 4B). O protocolo detalhado utiliza a conjugação bacteriana bi-parental para transferência de pJNW684 da cepa E. coli λpir+ doador para a cepa receptora A. baumannii. Este é um método eficiente e barato para gerar bibl.......

Discussão

A. baumannii é uma ameaça emergente à saúde pública global devido à rápida aquisição da AMR contra terapêuticas de "última linha", como colistina^{10,,11,12,,23,,24,,30,,31}. Nas últimas décadas, tn-seq tem desempenhado um papel crítico na elucidação das interações genótipo-fenótipo em.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10 mM ddCTP, 2',3'-Dideoxicitidina-5'-Trifosfato	Affymetrix	77112
100 mM dCTP 2'-Desoxicitidina-5'-Trifosfato	Invitrogen	10217-016
100bp Marcador de Peso Molecular de Escada de DNA	Promega	PR-G2101
100mm x 15mm Placas	de Petri Corning	351029
Placas de Petri de 150 mm x 15 mm	Corning	351058
1X B& W	N/A	N/A	Diluir 2X B& W pela metade para obter 1X P&B.
O ácido 2,6-diaminopimélico	Alfa Aesar	B2239103	usado a 600 µ M
2X B& W	N/A	N/A Adicionar	2 M de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA (pH 7,5) em água. Usado com contas de Streptavidin. As soluções mantêm-se à temperatura ambiente.
Tubos de Centrífuga Cônicos Estéreis de Polipropileno 50mL	Fisher Scientific	12-565-271
9,5 mM dCTP/0,5 mM ddCTP	N/	A N/A	9,5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85,5 ml de água. Armazene a -20 graus C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polimerase	Invitrogen	12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978	ATCC	N/A	AmpS, KanS
Ampicilina (100 mg/L)	Fisher Scientific	BP1760	usado a 100 mg/L
Sistema de purificação de PCR AMPure XP	BECKMAN COULTER	A63881
BioAnalyzer	Agilent	G2939B
Bioanalisador Análise de DNA de Alta Sensibilidade	Agilent	5067-4626
Mistura de Solução de Desoxinucleotídeo (dNTP)	New England Biolabs (NEB)	N0447L
DynaMag-2 Rack magnético	Invitrogen	12321D
E.coli MFD Dap-N	/ A	N / A	DAP Auxotrófico, requer 600 mM de DAP adicionado exogenamente para crescer. Contém maquinário RP4 para transferência de plasmídeo. Transportadora para JNW68 (36).
Etanol	Fisher Scientific	A4094
Frascos criogênicos com rosca externa	Corning	09-761-71
Contas de vidro	Corning	72684
Glicerol	Fisher Scientific	G33
Alças de inoculação	Fisher Scientific	22-363-602	Ferramenta de raspagem
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906	usado em ágar LB de 25 mg/L
, caldo Miller	Fisher Scientific	BP1425
LB, Miller	Fisher Scientific	BP1426
LoTE	N/A	N/A	Adicione 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) em água. Usado com contas de Streptavidin. As soluções mantêm-se à temperatura ambiente.
Tampão de lise	N/A	N/A	Tampão-TE de 9,34 mL; 600 ml de SDS a 10%; 60 ml de proteinase K (20 mg/mL)
Fenol/Clorofórmio/Álcool Isoamílico (Mistura 25:24:1, pH 6,7/8,0, Liq.)	Fisher Scientific	BP1752I
Phosphate Buffered Saline, Solução 10X	Fisher Scientific	BP39920	Diluído para 1X
Qubit 4 Fluorômetro	Thermo Fisher	Q33238
Qubit Tubos de Ensaio Qubit	Thermo Fisher	Q32856
Qubit dsDNA HS Kit de Ensaio	Thermo Fisher	Q32851
Sonicator com refrigerado Sonicadores	Qsonica em	Q2000FCE
Grânulos Magnéticos de Estreptavidina	New England Biolabs (NEB)	S1420S
TE tampão	N/A	N/A	10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Desoxinucleotidil Transferase (rTdt)	Promega	PR-M1875

banho-maria