Artigo de método

Modelo de cura da ferida excisional de Murine e Análise de Ferida Morfômica Histológica

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DOI:

10.3791/61616

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21 de agosto de 2020

 , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Iowa

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve como gerar feridas excisionais bilaterais e de espessura total em camundongos e como monitorar, colher e preparar as feridas para análise morfométrica. Incluído é uma descrição aprofundada de como usar seções histológicas seriais para definir, quantificar e detectar defeitos morfométricos.

Resumo

O modelo de ferida excisional de murina tem sido usado extensivamente para estudar cada uma das fases sequencialmente sobrepostas da cicatrização da ferida: inflamação, proliferação e remodelação. As feridas de Murina têm um leito de ferida histologicamente bem definido e facilmente reconhecível sobre o qual essas diferentes fases do processo de cura são mensuráveis. Dentro do campo, é comum o uso de um "meio" arbitrariamente definido da ferida para análises histológicas. No entanto, as feridas são uma entidade tridimensional e muitas vezes não histologicamente simétrica, apoiando a necessidade de um método bem definido e robusto de quantificação para detectar defeitos morfométricos com um pequeno tamanho de efeito. Neste protocolo, descrevemos o procedimento para a criação de feridas excisionais bilaterais e de espessura total em camundongos, bem como uma instrução detalhada sobre como medir parâmetros morfométricos usando um programa de processamento de imagem em seções seriais selecionadas. As medidas de duas dimensões do comprimento da ferida, comprimento epidérmico, área epidérmica e área da ferida são usadas em combinação com a distância conhecida entre as seções para extrapolar a área epidérmica de três dimensões que cobre a ferida, área geral da ferida, volume epidérmico e volume da ferida. Embora esta análise histológica detalhada seja mais demora e recursos do que as análises convencionais, seu rigor aumenta a probabilidade de detectar novos fenótipos em um processo de cicatrização de feridas inerentemente complexo.

Introdução

A cicatrização de feridas cutâneas é um processo biológico complexo com fases sequencialmente sobrepostas. Requer a coordenação de processos celulares e moleculares que são regulados temporal e espacialmente para restaurar a função de barreira do epitélio danificado. Na primeira fase, inflamações, neutrófilos e macrófagos migram para a ferida, mobilizando defesas locais e sistêmicas1. Seguir e sobrepor a fase inflamatória é o estágio de proliferação. Os fibroblastos começam a proliferar rapidamente e migrar para o tecido de granulação. Os queratinócitos para longe da borda principal proliferam direcionalmente em direção à ferida à medida que queratinócitos diferenciados na borda principal migram para re-epitelializar a ferida2. Finalmente, começa a fase de remodelação e maturação, durante a qual os fibroblastos no tecido de granulação começam a sintetizar e depositar colágeno. A remodelagem e organização da nova matriz pode durar até 1 ano após a lesão3. Devido à complexidade dos eventos sobrepostos envolvendo conversas cruzadas entre múltiplos tipos celulares, e apesar de anos de pesquisa, muitos dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes à cicatrização das feridas permanecem mal compreendidos.

O modelo de camundongos é o modelo predominante de mamíferos para investigar mecanismos de cicatrização de feridas devido à sua facilidade de uso, custo relativamente baixo e manipulabilidade genética1,4,5. Embora diferentes tipos de feridas tenham sido descritas no modelo murino, o mais comum é uma ferida excisional (seja um soco bilateral ou biópsia direta do soco), seguida pelos modelos de ferida incisional4. O modelo de ferida excisional tem uma vantagem distinta sobre o modelo incisional, pois inerentemente gera tecido de controle que não passou pelo processo de cicatrização. O tecido de biópsia de soco excisado como parte do protocolo cirúrgico pode ser processado da mesma forma que o tecido ferido e usado para estabelecer as condições homeostáticas para um critério desejado. O tecido de controle excisado também pode ser útil se avaliar os efeitos de um pré-tratamento da pele ou confirmar alteração genética bem sucedida no momento da lesão4.

Os parâmetros de cura podem ser avaliados por muitas técnicas diferentes, incluindo planimetria ou histologia. No entanto, a planimetria só pode avaliar características visíveis da ferida, e devido à presença de uma cicatriz, muitas vezes não se correlaciona com medidas de cura que são visualizadas pela histologia, tornando a histologia o "padrão-ouro" da análise4. Apesar da análise histológica ser o padrão-ouro, é mais frequentemente realizada em um subconjunto arbitrário da ferida6,7. Por exemplo, cortar a ferida em "metade" antes de incorporar e seccionar a ferida é a prática comum para reduzir o tempo e os recursos gastos na seção de materiais e análise de dados. O método de análise morfométrica descrito neste protocolo foi desenvolvido para abranger todo o tecido da ferida, para refletir com precisão as características morfológicas da ferida, e para aumentar a probabilidade de detectar defeitos de cicatrização de feridas com um pequeno tamanho de efeito. Neste protocolo, detalhamos um método cirúrgico para a geração da ferida murina mais estudada, a ferida excisional de espessura total bilateral, bem como um método detalhado e rigoroso para análise histológica, como raramente é utilizado no campo.

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Protocolo

Todos os experimentos foram concluídos de acordo e o cumprimento das regulamentações federais e as políticas e procedimentos da Universidade de Iowa foram aprovados pela Universidade de Iowa IACUC.

1. Animais e criação

  1. Use camundongos adultos da linha de camundongos desejada com 8-10 semanas de idade quando o estágio do folículo piloso estiver em telogen.
  2. No dia da cirurgia, separe os ratos em gaiolas limpas e abriga individualmente para minimizar a interrupção da ferida.

2. Cirurgia

NOTA: É desnecessário manter as condições cirúrgicas estéreis. Enquanto deve-se tomar cuidado para manter a esterilidade entre os animais, a biópsia do soco em si é feita em uma superfície limpa, mas não estéril. A duração da cirurgia por animal é entre 10 e 15 minutos.

  1. Anesthetization
    1. Anestesiar o animal por 1-2 min em uma câmara de indução com o vaporizador isoflurane definido para uma taxa de fluxo de 4-5% e o medidor de fluxo de oxigênio definido em 1 litro por minuto. Consulte Discussão para opções alternativas de anestesia.
    2. Confirme a anestesia adequada antes de iniciar o procedimento. A profundidade da anestesia pode ser confirmada por uma beliscão firme do dedo do dedo do sol.
    3. Transfira o mouse do recipiente de indução para um cone de nariz e reduza a taxa de fluxo isoflurane para 1,5% e o medidor de fluxo de oxigênio para 0,5 L/min.
    4. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos, pois o procedimento excede 5 min.
    5. Mantenha a temperatura normal do corpo usando uma almofada térmica.
  2. Preparação do local da ferida
    1. Use um cortador de navalha elétrico em um movimento rostral caudal para remover a pele na parte de trás do mouse no nível do ombro. Remova o cabelo mais baixo nas costas, conforme necessário, se houver mais de duas feridas.
    2. Remova o cabelo restante usando uma lâmina de barbear em um movimento caudal rostral mantido a 20° da parte de trás do mouse para raspar de perto a área cortada(Figura 1A).
    3. Limpe a área raspada com um cotonete povidone-iodo.
    4. Limpe a pele com uma almofada de preparação de álcool isopropílico de 70% estéril para reduzir a irritação cutânea potencial do cotonete de iodo.
  3. Ferindo
    1. Aperte a pele entre as omoplatas ao longo da linha dorsal e puxe a dobra da pele sanduíche para longe do corpo(Figura 1B).
    2. Posicione o mouse de lado com a dobra cutânea em uma superfície plana coberta com uma toalha limpa à base de papel ou equivalente. Use uma folha de cera dentária sob a toalha para proteger a superfície subjacente de danos(Figura 1C).
    3. Coloque o soco de biópsia do tamanho desejado o mais próximo possível do corpo e deixe a pele relaxar. Não estique a pele, ou o tamanho da ferida será maior do que o tamanho do soco designado(Figura 1D).
    4. Soque a pele pressionando para baixo, um movimento de balanço pode ser usado para garantir que todas as camadas da pele em ambos os lados tenham sido penetradas(Figura 1E). Use um novo soco de biópsia para cada animal.
    5. Remova as biópsias de ponche das feridas(Figura 1F). Se ainda houver locais de fixação use tesouras estéreis e pinças para libertar o soco da pele circundante. Processe o tecido de controle da biópsia do soco conforme necessário com base em planos a jusante para análises de cicatrização de feridas (ver Discussão para sugestões).
    6. Tire fotografias macroscópicas de uma distância igual aos locais da ferida ou com uma régua no quadro, a fim de medir a área inicial da ferida e eliminar outliers da análise.
    7. Administre analgesia por um mínimo de 24h de acordo com um protocolo animal aprovado. Por exemplo: Buprenorfina SR-LAB, injetada como uma única dose subcutânea em 0,5-2 mg/kg para 48h de alívio da dor (ver Discussão para sugestões e considerações alternativas).
    8. Monitore o mouse quando ele sai da anestesia até que ele mantenha uma postura vertical e esteja andando normalmente ao redor da gaiola.

3. Monitoramento de feridas pós

  1. Monitore os ratos diariamente para pontos finais experimentais conforme determinado pelo investigador e de acordo com o cumprimento dos protocolos institucionais. Exemplos incluem: infecção, perda de peso visível ou uma postura curvada.
  2. Tire fotos macroscópicas diárias de forma controlada, como foi feito após a cirurgia inicial.

4. Feridas de colheita

  1. Eutanize camundongos no ponto de tempo desejado após a ferida de acordo com um protocolo animal aprovado.
  2. Tire fotografias macroscópicas dos locais da ferida de forma controlada consistente com a aquisição prévia de fotografias(Figura 2A,C).
  3. Corte um retângulo largo ao redor dos locais da ferida usando um bisturi(Figura 2D,E).
  4. Liberte o pedaço retangular do tecido usando tesouras e pinças para descascar e cortar a pele do tecido subjacente(Figura 2F). Coloque em uma placa de Petri(Figura 2G).
  5. Colhe as feridas. Apare até 2 mm de tecido não enrolado em torno de todos os lados da ferida em uma forma retangular(Figura 2H,I). Consulte Discussão para obter opções alternativas para colher a ferida.
  6. Processe as feridas conforme necessário para estudos subsequentes. Reserve pelo menos uma ferida por rato para incorporação de parafina e análise histológica.

5. Fixação e incorporação de feridas

  1. Conserte a ferida.
    1. Fixar o tecido da ferida em uma solução de paraformaldeído de 4% recém preparada8 por 3 h à temperatura ambiente e depois transfira para 4 °C durante a noite. Microscopia eletrônica (EM) grau paraformaldeído e filtragem de solução não é necessário.
    2. Lave as feridas duas vezes por 30 minutos em 1x PBS.
    3. Substitua o PBS por 70% de ETOH e armazene a 4 °C até incorporar. Processe tecidos dentro de 24-48 h para evitar a perda de antígeno ou dentro de 1-2 semanas se apenas avaliar características histológicas.
  2. Processar e incorporar a ferida
    1. Transfira cada ferida para um de incorporação. Rotular a incorporação de a lápis, pois o processo removerá tintas.
    2. Processe o tecido manualmente ou usando um processador automatizado desidratando o tecido com percentuais de etanol aumentados, limpando com xileno e, em seguida, infiltrando o tecido com cera de parafina(Tabela 1).
    3. Incorporar a ferida 90° ("pé") da superfície horizontal do molde de incorporação(Figura 3A,B).

6. Análise da área da ferida do dia 0

  1. Baixe o software livre NIH-Image J ou NIH-Fiji (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
  2. Abra um arquivo com uma foto das feridas do 0º dia.
  3. Verifique a caixa para "Área" em Analisar | Medidas de conjunto.
  4. Selecione "Escala definida" em Analisar. Digite a distância em pixels, a distância correspondente conhecida e a unidade da distância (= unidade de comprimento) se as medidas macroscópicas fizerem parte do estudo ou pularem esta etapa se forem necessárias apenas medidas relativas.
  5. Selecione"Seleções à mãolivre " na barra de ferramentas fiji.
  6. Delineie o perímetro da ferida.
  7. Clique em Analisar .
  8. Crie uma planilha para acompanhar as medidas por animal por ferida.
  9. Copie a medição da área da ferida na planilha.
  10. Calcule a área média e o desvio padrão de todas as feridas para um determinado experimento.
  11. Exclua quaisquer feridas fora de dois desvios padrão da média da análise histológica.

7. Secção serial

  1. Esfrie os blocos de feridas embutidos na parafina a 4 °C durante a noite.
  2. Insira o bloco de parafina no suporte do bloco do microtome e oriente para que a lâmina corte em linha reta através do bloco. Oriente o bloco de tal forma que o tecido "fique" a 90° permitindo a seção simultânea da epiderme e derme(Figura 3C,D).
  3. Faça 2-4 fitas de 20-30 seções de parafina de 7 μm cada.
  4. Use uma escova de tinta seca e uma agulha de dissecção para transferir cada fita para uma superfície firme, mas manipuladora, como uma folha de plástico preta firme.
  5. Retire a parte superior de cada fita com uma lâmina de barbear e coloque em um slide de microscópio.
  6. Observe as seções não manchadas sob um microscópio de campo brilhante para determinar quais contêm tecido ferido, que pode ser identificado pela ausência de folículo piloso, alterações no aparecimento do tecido conjuntivo ou epiderme, e/ou a presença de uma cicatriz(Figura 4A,B).
  7. Descarte seções não enroladas até 20 seções antes do início da ferida.
  8. Seção através da ferida repetindo as etapas 7.3 e 7.4 até que nenhuma ferida seja detectada em seções não manchadas.

8. Montagem de seções de parafina

  1. Seções de parafina separadas a cada 5 seções com uma lâmina de barbear, começando com a primeira fita(Figura 3E).
  2. Rotular slides de microscópio com o número de slides e todos os números da seção.
  3. Pegue o grupo de 5 seções com uma escova de tinta molhada e flutue-as na superfície da água de um banho de água quente (40-45 °C) para achatá-las.
  4. Escolha o grupo de 5 seções fora do banho de água usando um dos slides de microscópio rotulado(Figura 3F) e coloque em um conjunto mais quente de slides a 37 °C por até 24 horas.
  5. Armazene os slides eretos em uma caixa de slides.

9. Coloração histológica

  1. Transfira cada slidede microscópio 8 (equivalente a cada 40seção de parafina) para um rack de coloração e colorindo com hematoxilina e eosina.

10. Imagem microscópica

  1. Adquira imagens usando um microscópio de campo brilhante equipado com um objetivo de 4x e recursos de aquisição digital. Regisso da escala em que a imagem é tirada.
  2. Imagem toda a ferida da parte superior de cada slide manchado e certifique-se de incluir algum tecido não enrolado em ambos os lados. Tire várias fotos sobrepostas se a ferida for maior que a moldura de uma única imagem.
  3. Salve o arquivo, incluindo o número da seção para análise morfométrica. Use o número da seção seguido de a, b, c, etc. para imagens sobrepostas da mesma ferida.

11. Análise morfométrica

NOTA: Quando a ferida abrange várias imagens, soma as medidas tiradas das imagens individuais para obter um valor por métrica por seção de ferida para registrar na planilha.

  1. Na Imagem J, abra um arquivo digital de uma imagem manchada. Não use fotos costuradas para análise. Execute medições em imagens sobrepostas com zoom, encontrando pontos de referência para deixar de fora e captar medidas de imagem em imagem.
  2. Defina as preferências de escala e medição.
    1. Selecione "Escala definida" em Analisar. Digite a distância em pixels, a distância correspondente conhecida e a unidade da distância (= unidade de comprimento). A escala deve aparecer na janela e deve corresponder à escala em que a imagem foi adquirida.
    2. Verifique a caixa "Global" para manter a escala a mesma para cada imagem aberta.
    3. Repita as etapas 11.2.1 a 11.2.2 toda vez que a imagem J for fechada e reaberta.
    4. Verifique a caixa para "Área" em Analisar | Medidas de conjunto.
  3. Meça o comprimento da ferida
    1. Selecione"Seleções à mãolivre " na barra de ferramentas fiji.
    2. Medida a partir do último folículo piloso do tecido ileso de um lado da ferida até o primeiro folículo piloso do tecido ileso do outro lado da ferida(Figura 4A,B).
    3. Rastreie ao longo da junção dermo-epidérmica para alcançar esses dois marcos. Se a epiderme não cobrir toda a ferida, siga a junção dermo-epidérmica de um lado da ferida e onde a língua migratória termina continue seguindo o aspecto superior do tecido de granulação ou a junção entre o tecido de granulação e a cicatriz até chegar à língua migratória e, finalmente, o primeiro folículo piloso do tecido ileso do outro lado(Figura 4E,F).
    4. Em Analisar, clique em Medir. O comprimento da medição aparecerá nas mesmas unidades definidas na escala.
    5. Crie uma planilha para acompanhar as medidas (Tabela Suplementar 1).
    6. Copie o comprimento da ferida na planilha.
  4. Meça o comprimento epidérmico
    1. Se a epiderme cobrir toda a ferida, o comprimento epidérmico é o mesmo que o comprimento da ferida.
      1. Copie a medição do "comprimento da ferida" na coluna "comprimento epidérmico" na planilha Excel e pule para a etapa 11.5.
    2. Se a epiderme não cobrir toda a ferida, selecione as "seleções à mão livre" e meça a distância entre cada borda epidérmica seguindo o aspecto superior do tecido de granulação ou a junção entre o tecido de granulação e a cicatriz ao primeiro folículo piloso(Figura 4C,D).
      1. Em Analisar, clique em Medir.
      2. Subtraia esta medição do comprimento da ferida e registre o número em "comprimento epidérmico" na planilha Excel.
  5. Meça a área da ferida
    1. Selecione"Seleções à mãolivre " na barra de ferramentas fiji.
    2. Medida a partir do último folículo piloso do tecido ileso de um lado da ferida até o primeiro folículo piloso do tecido ileso do outro lado da ferida(Figura 4A,B,E,F).
    3. Rastreie ao longo do aspecto superior da epiderme (não inclua a cicatriz) ou o aspecto superior do tecido de granulação se a ferida não estiver totalmente coberta pela epiderme.
    4. Continue a traçar verticalmente ao longo do folículo piloso no tecido de granulação uma vez que o folículo piloso oposto seja atingido e até que o tecido adiposo ou o músculo seja atingido. Siga a borda inferior do tecido de granulação até o lado oposto da ferida e junte-se ao ponto de partida ao longo do folículo piloso para fechar a área(Figura 4E,F).
    5. Em Analisar, clique em Medir.
    6. Copie a área da ferida na planilha em "área de ferida medida".
  6. Meça a área epidérmica
    1. Selecione"Seleções à mãolivre " na barra de ferramentas fiji.
    2. Se a ferida estiver totalmente epitelializada:
      1. Traçar ao longo do aspecto superior da epiderme até que o folículo piloso oposto seja alcançado e complete a área "retornando" ao ponto de partida após a junção dermo-epidérmica entre a epiderme e a derme(Figura 4D).
      2. Em Analisar, clique em Medir.
      3. Copie a área epidérmica na planilha Excel em "área epidérmica medida" e pule para a etapa 11.7.
    3. Se a ferida não estiver totalmente epitelializada:
      1. Rastreie ao longo do aspecto superior da epiderme até a borda superior e retorne ao ponto de partida após a junção dermo-epidérmica(Figura 4C).
      2. Em Analisar, clique em Medir.
      3. Repita o passo 11.6.3.1 e 11.6.3.2 no lado oposto da ferida.
      4. Em Analisar, clique em Medir.
      5. Somam os dois números obtidos nas etapas 11.6.3.2 e 11.6.3.4 e digitem o resultado em "área epidérmica medida" na planilha.
  7. Repita as etapas 11.3 a 11.6 em cada seção 40(cada 8º slide).
  8. Calcule a área epidérmica de toda a ferida.
    1. Crie uma nova coluna na planilha "área epidérmica calculada" ao lado do "comprimento epidérmico".
    2. Multiplique o número para "comprimento epidérmico" por 280 para cada seção, exceto o último (seção de 7 μm de espessura x 40 seções).
    3. Multiplique o número para "comprimento epidérmico" por 7 para a última seção (espessura da seção).
    4. Soma o valor da "área epidérmica calculada" para cada seção obter a área epidérmica de toda a ferida.
  9. Calcule a área da ferida inteira.
    1. Repita as etapas 11.8.1 a 11.8.4 usando as medidas de comprimento da ferida.
  10. Calcule o volume epidérmico de toda a ferida.
    1. Repetir as etapas 11.8.1 a 11.8.4 usando as medidas "área epidérmica medida".
  11. Calcule o volume da ferida inteira.
    1. Repetir as etapas 11.8.1 a 11.8.4 usando as medidas "área de ferida medida".
  12. Calcule a porcentagem de volume epidérmico na ferida.
    1. Divida o volume epidérmico total pelo volume total da ferida e multiplique por 100 para obter a porcentagem (não faça essa razão para cada seção).
  13. Calcule a porcentagem de área epidérmica entre a área da ferida.
    1. Divida a área epidérmica total pela área total da ferida e multiplique por 100 para obter o percentual. Se uma ferida for totalmente epitelializada, este número deve ser de 100.

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Resultados

A Figura 5 retrata a faixa em valores medidos e calculados obtidos pela realização de análise morfométrica em feridas do tipo selvagem geradas em diferentes cepas de camundongos por vários cirurgiões e analisadas por diferentes indivíduos. Camundongos do tipo selvagem de diferentes cepas podem apresentar diferenças estatísticas como descrito tanto em nossos estudos quanto na literatura9,10. Com base nesses resultados representativos,...

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Discussão

O modelo bilateral de ferida excisional é um procedimento altamente personalizável que pode ser usado para estudar muitos aspectos diferentes da cicatrização de feridas. Antes de iniciar um projeto de cicatrização de feridas, os investigadores devem realizar uma análise de energia para determinar o número de feridas necessárias para detectar um defeito de um determinado tamanho de efeito. Existem inconsistências na literatura sobre se camundongos individuais ou feridas devem ser usados como réplicas biológicas, no entant...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Somos gratos a todos os membros do Laboratório Dunnwald que contribuíram para a otimização deste protocolo ao longo dos anos, e a Gina Schatteman cuja persistência em promover o uso de seção serial para análise de feridas tornou sua criação possível. Este trabalho foi apoiado por financiamento do NIH/NIAMS para Martine Dunnwald (AR067739).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
100% etanol
70% etanol
80% etanol
95% etanol
Preparação de álcoolNOVAPLUSV910070% Álcool isopropílico,
hidróxido de amônio
biópsiaCellpath22-222-012
de plástico pretaAlgo firme, mas manipulável, do tamanho de uma folha de papel
MicroscópioCom capacidades de aquisição digital e uma objetiva 4X
Aplicadores
Lamínulas22 x 60 #1
Folhas
de cera dentalCâmeraInclui uma régua para escala, se aplicável
Agulha de dissecção (reta)
de embutir22 x 22 x 12
Anéis de embutirSimport Scientific Inc.M460
Eosin Y
Ácido
Máquina de cortar
Almofada de aquecimentoConairAlmofada de aquecimento seca úmida
Micrótomo
hematoxilina
Lâminas de micrótomo
Pincéis
Parafina Tipo 6
Paraformaldeído
Permount
Solução tampão de fosfato (PBS)
Povidona-iodoAplicare82-255
de processamentoSimport Scientific Inc.M490-2
Lâminas de barbearASR.009Lâminas
bisturi de serviço regular # 10
bisturi
Tesouraestéril para cirurgia
PunçõesTamanho conforme determinado pelo pesquisador
Caixas
Aquecedores de
Lâminas de microscópio superfrostedFisher Scientific22 037 246
Banho-maria
Estaçãode incorporação de tecidos Mínimo de um dispensador de parafina e uma placa fria
Processadorde tecidos Mínimo de um forno com bomba de vácuo
Antibiótico triplo pinças de pomada
, pontaestéril para pinças
cirúrgicas, pontaestéril para cirurgia
WypAll X60Kimberly-Clark34865
estéril Almofadas de Folha de campo claro com ponta de algodão digital Moldes acético glacialcabelo de de Cabo de cirúrgica afiada de biópsia de pele de slideslâminascom controle de temperaturaoftálmica curva cônica

Referências

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