Este protocolo fornece métodos para visualização de células bacterianas e polissacarídeos do lócus de síntese de polissacarídeos (Psl) no escarro de pacientes com fibrose cística.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Visualização de Pseudomonas aeruginosa no Escarro de Pacientes com Fibrose Cística
Neste artigo
Resumo
Resumo
A detecção precoce e a erradicação de Pseudomonas aeruginosa nos pulmões de pacientes com fibrose cística podem reduzir a chance de desenvolver infecção crônica. O desenvolvimento de infecções crônicas por P. aeruginosa está associado a um declínio na função pulmonar e aumento da morbidade. Portanto, há um grande interesse em elucidar as razões para a falha na erradicação da P. aeruginosa com antibioticoterapia, que ocorre em aproximadamente 10-40% dos pacientes pediátricos. Um dos muitos fatores que podem afetar a depuração de P. aeruginosa e a suscetibilidade a antibióticos pelo hospedeiro são variações na organização espacial (como agregação ou formação de biofilme) e produção de polissacarídeos. Portanto, estávamos interessados em visualizar as características in situ da P. aeruginosa no escarro de pacientes com FC. Uma técnica de limpeza tecidual foi aplicada às amostras de escarro após a incorporação das amostras em uma matriz de hidrogel para reter as estruturas 3D em relação às células hospedeiras. Após a limpeza do tecido, etiquetas fluorescentes e corantes foram adicionados para permitir a visualização. Hibridização in situ fluorescente foi realizada para a visualização das células bacterianas, ligação de anticorpos anti-Psl marcados fluorescentemente para a visualização do exopolissacarídeo e coloração DAPI para corar células hospedeiras para obter insight estrutural. Esses métodos permitiram a obtenção de imagens de alta resolução da P. aeruginosa no escarro de pacientes com FC por meio de microscopia confocal de varredura a laser.
Introdução
Neste estudo, experimentos foram delineados para visualizar a estrutura in vivo de Pseudomonas aeruginosa no escarro de pacientes pediátricos com fibrose cística (FC). As infecções por P. aeruginosa tornam-se crônicas em 30-40% da população pediátrica com FC; Uma vez estabelecidas, as infecções crônicas são quase impossíveis de serem eliminadas1. Isolados de P. aeruginosa de pacientes com infecção precoce são geralmente mais suscetíveis aos antimicrobianos, portanto, estes são tratados com antibióticos anti-pseudomonas para prevenir o estabelecimento de infecção crônica2. Infelizmente, nem todo....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
A aprovação do Conselho de Ética em Pesquisa (CEP) é necessária para coletar e armazenar amostras de escarro de seres humanos. Os estudos aqui apresentados foram aprovados pelo Hospital for Sick Children REB#1000058579.
1. Coleta de Escarro
- Armazenar o escarro expectorado em um copo de coleta estéril e armazenar imediatamente a 4 °C por um máximo de 24 h antes da fixação.
NOTA: Deixar o escarro demasiado tempo a 4 °C sem fixação pode levar à degradação celular, particularmente degradação dos glóbulos brancos. A fixação o mais rápido possível é preferível. - Transferir as amostras de escarro para um tubo estéril de 15 mL....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
O planejamento geral do experimento está resumido na Figura 1 e na Figura 2. A Figura 1 apresenta um resumo dos protocolos de processamento e desobstrução de escarro. O processamento e a depuração do escarro podem levar até 17 dias. No entanto, o protocolo pode ser interrompido, e as amostras podem ser armazenadas após a fixação com PFA (dia 2) ou após a limpeza do tecido (dias 5-17, dependendo do tempo de clareamento). Na
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O objetivo deste protocolo é permitir vislumbrar a organização in situ das células de P. aeruginosa no escarro de pacientes com FC. As amostras de escarro devem ser armazenadas a 4 °C até serem processadas, se não puderem ser imediatamente fixadas. Foi demonstrado que o número de células de P. aeruginosa no escarro não muda significativamente se processado em 1 h, 24 h ou 48 h, quando armazenado a 4 °C, embora se deixado a 25 °C por 24 ou 48 h, a contagem de células bacterianas aumentará significativame.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer à Cystic Fibrosis Foundation que forneceu financiamento para esta pesquisa e à MedImmune por sua generosa doação de anticorpos anti-Psl0096. Para este estudo, as imagens foram realizadas no centro de imagens CAMiLoD da Universidade de Toronto.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 29:1 acrilamida bisacrilamida, solução a 30% | BioRad | 161-0146 | |
| Tampa de vidro com 8 câmaras Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
| Anaerogen2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
| Câmaras de perfusão | Coverwell Electron Microscopry Sciences | 70326 -12/-14 | |
| HistoDenz | Sigma | D2158 | |
| Protect RNA Rnase Inhibitor | Sigma | R7387 | |
| PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | Detalhes do pedido: Produto: DNA Oligo modificado; Nome: PseaerA; Sequência: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Síntese: 50 nmol; Purificação: HPLC; Estado do navio: Rendimento total (seco) | |
| Psl0096-Texas Red | Medimmune | Os anticorpos vermelhos Psl0096-Texas foram um presente gentilmente fornecido pela Medimmune e a empresa deve ser contatada para consultas de pedidos. | |
| VA-044 Endurecedor | Wako | 27776-21-21 |
Referências
- Banerjee, D., Stableforth, D. The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way. Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).
- Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
