Explorando estrutura tecidual adiposa por limpeza de metilsalicylate e imagem 3D

Resumo

Aqui, descrevemos um método simples, barato e rápido de limpeza para resolver a estrutura 3D do tecido adiposo branco e camundongo usando uma combinação de marcadores para visualizar vasculatura, núcleos, células imunes, neurônios e proteínas de casaco de gotícula lipídica por imagem fluorescente.

Resumo

A obesidade é um grande problema de saúde pública mundial que aumenta o risco de desenvolver doenças cardiovasculares, diabetes tipo 2 e doenças hepáticas. A obesidade é caracterizada pelo aumento da massa do tecido adiposo (AT) devido à hiperplasia adipócito e/ou hipertrofia, levando à profunda remodelação de sua estrutura tridimensional. De fato, a capacidade máxima de expansão da AT durante a obesidade é fundamental para o desenvolvimento de patologias associadas à obesidade. Esta expansão AT é um importante mecanismo homeostático para permitir a adaptação a um excesso de ingestão de energia e evitar o derramamento de lipídio deletério para outros órgãos metabólicos, como músculo e fígado. Portanto, compreender a remodelagem estrutural que leva ao fracasso da expansão at é uma questão fundamental com alta aplicabilidade clínica. Neste artigo, descrevemos um método simples e rápido de limpeza que é usado rotineiramente em nosso laboratório para explorar a morfologia do tecido adiposo branco e camundongo por imagem fluorescente. Este método otimizado de limpeza AT é facilmente realizado em qualquer laboratório padrão equipado com uma capa química, um agitador orbital controlado pela temperatura e um microscópio fluorescente. Além disso, os compostos químicos utilizados estão prontamente disponíveis. É importante ressaltar que este método permite resolver a estrutura 3D AT, colorindo vários marcadores para visualizar especificamente os adipócitos, as redes neuronais e vasculares e a distribuição de células imunes inatas e adaptáveis.

Introdução

A obesidade é caracterizada pelo aumento da massa tecidual adiposa e tornou-se um grande problema de saúde pública mundial, uma vez que as pessoas com obesidade têm risco aumentado de desenvolver doenças cardiovasculares, diabetes tipo 2, doenças hepáticas e alguns cânceres.

Uma função fisiológica fundamental do tecido adiposo é modular a glicose do corpo inteiro e a homeostase lipídica^1,2. Durante o período de alimentação, os adipócitos (ou seja, as principais células do tecido adiposo) armazenam o excesso de glicose e lipídios fornecidos por uma refeição em triglicérides. Durante ....

Protocolo

Este protocolo foi testado e é validado para todos os depósitos de tecido adiposo branco e de rato e humano. Os tecidos adiposos humanos e de camundongos foram coletados de acordo com as leis europeias e aprovados pelos comitês de Ética francês e sueco.

1. Fixação de tecido adiposo branco e camundongo

1. Mergulhe o rato colhido ou os tecidos adiposos brancos humanos em pelo menos 10 mL de PBS contendo 4% de paraformaldeído (PFA) em um tubo plástico de 15 mL.
2. Agite o tubo de plástico à temperatura ambiente em uma placa de rolamento por 1h.
3. Deixe o tubo de plástico a 4 °C em uma placa de rolamento durante a noite, p....

Resultados

Utilizando o procedimento descrito aqui e resumido na Figura 1,conseguimos manchar e limpar oidualizado o tecido adiposo branco humano e camundongo, conforme apresentado na Figura 2A e Figura 2B, respectivamente. O tecido limpo foi transferido para a câmara de imagem metálica para realização de imagens confocal(Figura 3A). A clareira melhorou drasticamente a profundidade das imagens teciduais que pudemo.......

Discussão

As modificações que ocorrem dentro do tecido adiposo ao longo da progressão patológica, como a da obesidade, são fundamentais para a compreensão dos mecanismos por trás da patologia. Estudos pioneiros que revelaram tais mecanismos no tecido adiposo têm sido baseados em abordagens globais como proteômica de tecido adiposo inteiro^21,citometria de fluxo^22,,23e transcriômica^24,25. Além.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microtubos de 1,5 mL	Tubos Eppendorff - Dutscher	33528
Tubos de plástico de 15 mL Tubos	Falcon - Dutscher	352096
lamínula de vidro redonda de 18 mm	Mariendfeld	0117580
Frasco de vidro de 20 mL	Wheaton	986546
anticorpo conjugado com alexa647	Jackson ImmunoResearch	715-605-150	Diluição: 1/100
anticorpo conjugado com alexa647 Jackson	ImmunoResearch	711-605-152	Diluição: 1/100
BSA	Sigma-aldrich	A6003
CD301-PE anticorpo	Biolegend	BLE145703	Diluição: 1/100
anticorpo CD31	AbCam	ab215912	Diluição: 1/50
Software de análise 3D comercial - instrumento		IMARIS Oxford	com módulo celular
Microscópio confocal - Nikon A1R	Nikon
Dapi	ThermoFisher	D1306	Concentração de estoque: 5 mg/mL; diluição 1/1000
Desoxicolato	Sigma-aldrich	D6750
DMSO	Sigma-aldrich	D8418
Glut4 anticorpo	Santa Cruz	sc-53566	Diluição: 1/50
Glycine	Sigma-aldrich	G7126
Lectin-DyLight649	Vector Lab	DL-1178-1	Concentração de Estoque: 2 µ g/µ L; Injeção IV: 50 µ Câmara
de imagem metálica equipada com fundo de vidro - Câmara AttoFluor	Thermofisher	A7816
Salicilato de metila	Sigma-aldrich	M6752
Anticorpo perilipina	Progen	651156	Diluição: 1/50
Faloidina-alexa488	ThermoFisher	A12379	Diluição: 1/100
TCR-β-PB anticorpo	Biolegend	BLE109225	Diluição: 1/100
TH anticorpo	AbCam	ab112	Diluição: 1/50
Triton X100	Sigma-aldrich	X100
Tween-20	Sigma-aldrich	P416