Artigo de método

Explorando estrutura tecidual adiposa por limpeza de metilsalicylate e imagem 3D

DOI:

10.3791/61640

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19 de agosto de 2020

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1Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Cellular and Molecular Pathophysiology of Obesity", Nice, France, 2Integrated Cardio Metabolic Center, Department of Medicine, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden, 3Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Haematometabolism in Diseases", Nice, France, 4Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), Université de Toulouse, CNRS, UPS, Toulouse, France

Neste artigo

Resumo

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Aqui, descrevemos um método simples, barato e rápido de limpeza para resolver a estrutura 3D do tecido adiposo branco e camundongo usando uma combinação de marcadores para visualizar vasculatura, núcleos, células imunes, neurônios e proteínas de casaco de gotícula lipídica por imagem fluorescente.

Resumo

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A obesidade é um grande problema de saúde pública mundial que aumenta o risco de desenvolver doenças cardiovasculares, diabetes tipo 2 e doenças hepáticas. A obesidade é caracterizada pelo aumento da massa do tecido adiposo (AT) devido à hiperplasia adipócito e/ou hipertrofia, levando à profunda remodelação de sua estrutura tridimensional. De fato, a capacidade máxima de expansão da AT durante a obesidade é fundamental para o desenvolvimento de patologias associadas à obesidade. Esta expansão AT é um importante mecanismo homeostático para permitir a adaptação a um excesso de ingestão de energia e evitar o derramamento de lipídio deletério para outros órgãos metabólicos, como músculo e fígado. Portanto, compreender a remodelagem estrutural que leva ao fracasso da expansão at é uma questão fundamental com alta aplicabilidade clínica. Neste artigo, descrevemos um método simples e rápido de limpeza que é usado rotineiramente em nosso laboratório para explorar a morfologia do tecido adiposo branco e camundongo por imagem fluorescente. Este método otimizado de limpeza AT é facilmente realizado em qualquer laboratório padrão equipado com uma capa química, um agitador orbital controlado pela temperatura e um microscópio fluorescente. Além disso, os compostos químicos utilizados estão prontamente disponíveis. É importante ressaltar que este método permite resolver a estrutura 3D AT, colorindo vários marcadores para visualizar especificamente os adipócitos, as redes neuronais e vasculares e a distribuição de células imunes inatas e adaptáveis.

Introdução

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A obesidade é caracterizada pelo aumento da massa tecidual adiposa e tornou-se um grande problema de saúde pública mundial, uma vez que as pessoas com obesidade têm risco aumentado de desenvolver doenças cardiovasculares, diabetes tipo 2, doenças hepáticas e alguns cânceres.

Uma função fisiológica fundamental do tecido adiposo é modular a glicose do corpo inteiro e a homeostase lipídica1,2. Durante o período de alimentação, os adipócitos (ou seja, as principais células do tecido adiposo) armazenam o excesso de glicose e lipídios fornecidos por uma refeição em triglicérides. Durante o jejum, os adipócitos dividem os triglicérides em ácidos graxos não esterificados e glicerol para sustentar a demanda energética do corpo. Durante o desenvolvimento da obesidade, o tecido adiposo expande-se aumentando o tamanho (hipertrophia) e/ou o número (hiperplasia) dos adipócitos1, para aumentar sua capacidade de armazenamento. Quando a expansão do tecido adiposo atinge seu limite, uma constante altamente variável entre os pacientes, os lipídios restantes se acumulam em outros órgãos metabólicos, incluindo músculos e fígado3,,4, levando à sua falha funcional e iniciando complicações cardio-metabólicas relacionadas à obesidade1,,5. Portanto, identificar os mecanismos que regem a expansão do tecido adiposo é um desafio clínico fundamental.

As modificações morfológicas documentadas dentro dos tecidos adiposos durante a obesidade estão ligadas à sua disfunção patológica. Vários procedimentos de coloração têm sido utilizados para descrever a organização tecidual do tecido adiposo, incluindo actin6, marcadores vasculares7,marcadores lipídes-gotículas8, e marcadores de células imunes específicas9,,10. No entanto, devido ao enorme diâmetro dos adipócitos (50 a 200 μm)11, é essencial analisar grande parte de todo o tecido em três dimensões, a fim de analisar com precisão as dramáticas mudanças estruturais de AT observadas durante a obesidade. No entanto, como a luz não penetra em um tecido opaco, não é possível imagens em 3D dentro de uma grande amostra de tecido usando microscopia de fluorescência. Métodos de limpeza tecidual para torná-los transparentes têm sido relatados na literatura (para uma revisão, ver12) permitindo que se limpe tecidos e realize microscopia de fluorescência tecidual. Esses métodos oferecem oportunidades sem precedentes para avaliar a organização celular 3D em tecido saudável e doente. Cada um dos métodos descritos tem vantagens e desvantagens e, portanto, precisa ser cuidadosamente selecionado dependendo do tecido estudado (para uma revisão, veja13). De fato, algumas abordagens requerem um longo período de incubação e/ou o uso de materiais ou compostos que sejam caros, tóxicos ou difíceis de obter14,15,16,17,,18,19. Aproveitando um dos primeiros compostos usados há um século por Werner Spalteholz para limpar tecidos20,criamos um protocolo fácil de usar e barato que é muito bem adaptado para a limpeza de todos os depósitos de tecido adiposo humano e camundongos em qualquer laboratório com equipamento típico, incluindo um capuz químico, um agitador orbital controlado pela temperatura e um microscópio confocal.

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Protocolo

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Este protocolo foi testado e é validado para todos os depósitos de tecido adiposo branco e de rato e humano. Os tecidos adiposos humanos e de camundongos foram coletados de acordo com as leis europeias e aprovados pelos comitês de Ética francês e sueco.

1. Fixação de tecido adiposo branco e camundongo

  1. Mergulhe o rato colhido ou os tecidos adiposos brancos humanos em pelo menos 10 mL de PBS contendo 4% de paraformaldeído (PFA) em um tubo plástico de 15 mL.
  2. Agite o tubo de plástico à temperatura ambiente em uma placa de rolamento por 1h.
  3. Deixe o tubo de plástico a 4 °C em uma placa de rolamento durante a noite, para completar a fixação.
    NOTA: Este protocolo é adaptado para grandes amostras de tecido adiposo, como almofadas de gordura epidídica inteiras obtidas de camundongos alimentados com uma dieta normal (≈250 mgs - ≈0,6 cm3). Para amostras maiores, como almofadas de gordura epidídica obtidas de camundongos, alimentaram uma dieta rica em gordura (≈1,5 g - ≈4 cm3) ou amostras de tecido adiposo humano, embora o protocolo de compensação deva funcionar perfeitamente para toda a amostra (escalando o PFA e as misturas de anticorpos), em geral, cortamos pedaços de tecido em torno de 1 g (≈2,5 cm3) para reservar as amostras restantes, seja para coloração adicional ou aplicações. Para o PFA (etapa 1.1.) recomendamos o uso de aproximadamente 10 vezes o volume do tecido. Para as misturas de anticorpos (passos 3.1. e 3.4.), aumente o volume para imergir completamente o tecido e use um tubo plástico de 15 mL (ver Tabela de Materiais) se o tecido for muito grande para um microtubo plástico de 1,5 mL (ver Tabela de Materiais).

2. Permeabilização e saturação de tecido adiposo branco e camundongo

  1. Enxágüe o tecido adiposo branco fixo em 10 mL de PBS por 5 minutos à temperatura ambiente para remover todos os traços de PFA.
  2. Mergulhe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de PBS suplementado com 0,3% de glicina (ver Tabela de Materiais) e agite o tubo à temperatura ambiente em um agitador orbital por 1h a 100 revoluções por minuto (rpm) para saciar os restantes grupos de aldeídos livres restantes.
  3. Mergulhe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de PBS suplementado com Triton X-100 (ver Tabela de Materiais) e agite o tubo a 37 °C em um agitador orbital controlado pela temperatura por 2h a 100 rpm.
  4. Mergulhe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de PBS suplementado com 0,2% Triton X-100 e 20% DMSO (ver Tabela de Materiais) e agite o tubo a 37 °C em um agitador orbital controlado pela temperatura a 100 rpm durante a noite.
  5. Mergulhe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de PBS suplementado com 0,1% Tween-20 (ver Tabela de Materiais),0,1% Triton X-100, 0,1% desoxicolato (ver Tabela de Materiais) e 20% DMSO e agitar o tubo a 37 °C em um agitador orbital controlado pela temperatura a 100 rpm por pelo menos 24 h.
  6. Enxágüe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de PBS suplementado com Triton X-100 de 0,2% e agite o tubo à temperatura ambiente em um agitador orbital a 100 rpm por 1 h.
  7. Mergulhe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de PBS suplementado com 0,2% Triton X-100, 10% DMSO e 3% BSA (ver Tabela de Materiais) e agitar o tubo a 37 °C em um agitador orbital controlado pela temperatura a 100 rpm por 12 h, para saturar quaisquer locais que possam não especificamente ligar anticorpos.
    NOTA: Na etapa 2.7, a BSA pode ser substituída pelo soro sanguíneo da espécie do anticorpo secundário utilizado.

3. Procedimento de coloração para tecido adiposo branco e de camundongos e humanos

  1. Transfira o tecido em um microtubo plástico de 1,5 mL contendo 300 μL de PBS suplementado com 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA e os anticorpos primários (10x mais concentrados do que para a coloração da criosecção, mas a concentração ideal de anticorpos devem ser avaliados para cada anticorpo). Proteja o tubo da luz cobrindo com papel alumínio e agite o tubo a 37 °C em um agitador orbital controlado pela temperatura a 100 rpm por pelo menos dois dias (veja a nota na etapa 1.1 e passo 3.7.1).
  2. Enxágüe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de PBS suplementado com 0,2% Triton X-100, 10% DMSO e 3% BSA e agite o tubo protegido da luz a 37 °C em um agitador orbital controlado pela temperatura a 100 rpm por 5 h. Faça esta etapa duas vezes.
  3. Enxágüe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de PBS suplementado com 0,2% Triton X-100, 10% DMSO e 3% BSA e agite o tubo, protegido da luz, a 37 °C em um agitador orbital controlado pela temperatura a 100 rpm por uma noite a dois dias.
  4. Transfira o tecido para um microtubo plástico de 1,5 mL contendo 300 μL de PBS suplementado com 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA e anticorpos secundários (10x mais concentrados do que para a coloração da criosecção). Proteja o tubo da luz cobrindo com papel alumínio e agite o tubo a 37 °C em um agitador orbital controlado pela temperatura a 100 rpm por pelo menos dois dias (veja a nota na etapa 1.1 e passo 3.7.1).
  5. Enxágüe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de PBS suplementado com 0,2% Triton X-100, 10% DMSO e 3% BSA e agite o tubo, protegido da luz, a 37 °C em um agitador orbital controlado pela temperatura a 100 rpm por 5 h. Faça esta etapa duas vezes.
  6. Enxágüe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de PBS suplementado com 0,2% Triton X-100, 10% DMSO e 3% BSA e agite o tubo, protegido da luz, a 37 °C em um agitador orbital controlado pela temperatura a 100 rpm por uma noite a dois dias.
  7. Enxágüe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de PBS e agite o tubo, protegido da luz, a 37 °C em um agitador orbital controlado pela temperatura a 100 rpm por 2 h.
    NOTA: Para a rotulagem de estruturas específicas como núcleos ou actina, adicione 4′,6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI ou equivalente) e/ou a faloidóide fluorescentemente rotulada deve ser adicionada na etapa 3.1. quando apenas anticorpos primários fluorescentes rotulados são usados, ou na etapa 3.4. quando anticorpos secundários são usados.
    NOTA: Para o procedimento de coloração, podem ser utilizados anticorpos primários já conjugados com fluorochromes (como os utilizados para citometria de fluxo) e recomendamos-no para o ganho de tempo e especificidade. De fato, mesmo que os anticorpos primários do rato possam ser usados seguidos por anticorpos anti-camundongos secundários, como demonstramos aqui, muitas vezes observamos manchas não específicas de vasos sanguíneos devido à imunoglobulina circulante. Portanto, para evitar esse problema, os anticorpos primários que já estão rotulados são altamente recomendados e aqui fornecemos evidências de que os anticorpos utilizados na citometria de fluxo são compatíveis com o nosso procedimento. No entanto, no caso específico de um antígeno expresso em níveis baixos, uma etapa de amplificação de sinal via anticorpos secundários é obrigatória; quando o único anticorpo primário disponível é feito em camundongos, uma perfusão cardíaca dos camundongos com PBS por pelo menos 5 minutos no sacrifício pode remover uma grande proporção de imunoglobulina circulante e, portanto, a coloração não específica.

4. Procedimento de limpeza para tecido adiposo branco e rato e humano

  1. Mergulhe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de 50% de etanol e agite o tubo, protegido da luz, à temperatura ambiente em um agitador orbital a 100 rpm por 2 h.
  2. Mergulhe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de 70% de etanol e agite o tubo, protegido da luz, à temperatura ambiente em um agitador orbital a 100 rpm por 2 h.
  3. Mergulhe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de 95% de etanol e agite o tubo, protegido da luz, à temperatura ambiente em um agitador orbital a 100 rpm por 2 h.
  4. Mergulhe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de 100% de etanol e agite o tubo, protegido da luz, à temperatura ambiente em um agitador orbital a 100 rpm por 2h.
  5. Mergulhe o tecido em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de 100% de etanol e agite o tubo, protegido da luz, à temperatura ambiente em um agitador orbital a 100 rpm durante a noite.
  6. Mergulhe o tecido em uma garrafa de vidro de 20 mL com uma tampa plástica (ver tabela de materiais) contendo 5 mL de salicilato de metila (ver Tabela de Materiais) sob uma capa química e agite o recipiente de vidro, protegido da luz, à temperatura ambiente em um agitador orbital a 100 rpm por pelo menos 2 h.
    NOTA: O procedimento de compensação pode ser significativamente acelerado (se necessário) evitando as etapas 4.3. e 4,5., embora a qualidade final de compensação seria ligeiramente reduzida.

5.3D-confocal imagem de tecido adiposo branco limpo

  1. Transfira o tecido para uma câmara de imagem metálica equipada com um fundo de vidro (ver Tabela de Materiais) sob uma capa química e encha a câmara com salicilato de metila fresco.
    NOTA: Para fixar o tecido no lugar e, assim, evitar que ele flutua ou se mova para os lados na câmara, aplique várias tampas de vidro redondos de 18 mm (ver Tabela de Materiais) em cima do tecido ao montá-lo na câmara.
  2. Coloque a câmara de imagem em um microscópio confocal invertido.
  3. Imagem do tecido usando um objetivo de baixa ampliação (por exemplo, objetivo 4x) para gerar alguns cm3d mapas de todo o tecido adiposo ou da amostra de tecido humano.
  4. Selecione várias áreas para a amostragem de tecidos em maior ampliação. Normalmente, use um objetivo aéreo de longa distância de 20x que forneça uma boa relação entre resolução e profundidade. Adquirimos grandes imagens de mosaico com pilhas z entre 600 e 2000 μm de profundidade.
    NOTA: Use um objetivo de longa distância para se aprofundar mais no tecido.

6. Extração de resultados quantitativos das imagens de tecido adiposo 3D

NOTA: A segmentação das diferentes estruturas e a subsequente extração das informações quantitativas da pilha de imagem 3D gerada no ponto 5 podem ser realizadas usando qualquer uma das muitas opções de software de análise de imagem existentes, comercial ou freeware. Nos pontos a seguir, descrevemos uma estratégia que é rotineiramente utilizada em nosso laboratório para extrair informações quantitativas de imagens de tecido adiposo 3D usando software comercial (ver Tabela de Materiais).

  1. Converta as pilhas 3D no formato de software para liberar espaço de memória.
  2. Segmentar as células.
    1. Abra o módulo Cell do software.
    2. Alterar a configuração de detecção celular para coloração da membrana plasmática.
    3. Escolha o canal fluorescente do marcador usado para delinear a periferia celular (phalloidina que rotula actina cortical ou marcadores de membrana plasmática como F4/80 para macrófago, TCR-β para células T, ou aglomerado de proteínas de CD diferenciadas específicas para subtipos de células imunes).
    4. Configure os limites e forneça uma gama de tamanho de célula esperado (ou seja, de 1 a 200 μm para detecção celular).
    5. Executar a segmentação. Um volume correspondente à pilha z será gerado com as células segmentadas codificadas por cores com uma cor diferente para cada uma das células vizinhas.
    6. Aplique filtros estatísticos (tamanho, arredondamento, circularidade, etc.) na guia estatística para excluir artefatos de segmentação e/ou refinar as células segmentadas à célula de interesse com base em seu tamanho (ou seja, 20-200 μm para adipócitos; 5-25 μm para macrófagos; 1-3 μm para linfocitos).
    7. Extrair medições e dados quantitativos (volume, número, tamanho, diâmetro, etc.) da guia estatística.
  3. Segmentar componentes celulares (núcleos, vesículas, etc.) ou vasos como estrutura.
    NOTA: Embora a segmentação de filamentos seja muito útil para estudar a conectividade dos vasos, utilizamos a segmentação do módulo de superfície para extrair dados sobre o tamanho, volume e diâmetros dos vasos. De fato, a quantificação dos tamanhos dos vasos é perdida ao usar o módulo de filamentos.
    1. Abra o módulo Surface do software.
    2. Selecione o canal fluorescente do marcador usado para rotular especificamente o componente subcelular para reconstruí-lo em 3D.
    3. Configure os limiares e forneça uma faixa do tamanho de diâmetro esperado da estrutura (ou seja, 0,5-5 μm para núcleos; 0-100 μm para vasos; etc.).
    4. Executar a segmentação. Um volume com a estrutura celular segmentada será gerado. Medições e dados quantitativos (volume, número, tamanho, diâmetro, etc.) podem ser extraídos da guia estatística.
  4. Segmentar os vasos como um contínuo tubular.
    NOTA: Embora a segmentação de filamentos seja muito útil para estudar a conectividade dos vasos, utilizamos a segmentação do módulo de superfície para extrair dados sobre o tamanho, volume e diâmetros dos vasos. De fato, a quantificação dos tamanhos dos vasos é perdida ao usar o módulo de filamentos.
    1. Abra o módulo Filamentos do software.
    2. Selecione o canal fluorescente correspondente à coloração do vaso.
    3. Configure os limiares para a intensidade da fluorescência e selecione o número apropriado de nódulos de conexão esperados.
    4. Executar a segmentação. Filamentos representando a rede de navios serão gerados em 3D. As medições podem ser extraídas da guia estatística, permitindo obter dados quantitativos, incluindo comprimento do vaso, número de ramificações de embarcações, etc.

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Resultados

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Utilizando o procedimento descrito aqui e resumido na Figura 1,conseguimos manchar e limpar oidualizado o tecido adiposo branco humano e camundongo, conforme apresentado na Figura 2A e Figura 2B, respectivamente. O tecido limpo foi transferido para a câmara de imagem metálica para realização de imagens confocal(Figura 3A). A clareira melhorou drasticamente a profundidade das imagens teciduais que pudemo...

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Discussão

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As modificações que ocorrem dentro do tecido adiposo ao longo da progressão patológica, como a da obesidade, são fundamentais para a compreensão dos mecanismos por trás da patologia. Estudos pioneiros que revelaram tais mecanismos no tecido adiposo têm sido baseados em abordagens globais como proteômica de tecido adiposo inteiro21,citometria de fluxo22,,23e transcriômica24,25. Além...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos para revelar.

Agradecimentos

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Este trabalho contou com o apoio da INSERM, Université Côte d'Azur, e por subsídios da Agência Nacional de Pesquisa francesa (ANR) através dos Investimentos para o Futuro Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), o programa UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) via Academy 2 "Systèmes Complexes " e Academy 4 "Complexité et diversité du vivant", Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587), e o Programa Jovem Investigador para J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Agradecemos também a Instalação núcleo de imagem do C3M financiada pelo Conseil Départemental des Alpes-Maritimes e pelo Région PACA, e que também conta com o apoio da Plataforma de Microscopia e Imagem IBISA Côte d'Azur (MICA). Agradecemos a Marion Dussot por ajuda técnica na preparação de tecidos. Agradecemos a Abby Cuttriss, visibilidade científica internacional da UCA, pela leitura do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microtubos de 1,5 mLTubos Eppendorff - Dutscher33528
Tubos de plástico de 15 mL TubosFalcon - Dutscher352096
lamínula de vidro redonda de 18 mmMariendfeld0117580
Frasco de vidro de 20 mLWheaton986546
anticorpo conjugado com alexa647Jackson ImmunoResearch715-605-150Diluição: 1/100
anticorpo conjugado com alexa647 JacksonImmunoResearch711-605-152Diluição: 1/100
BSASigma-aldrichA6003
CD301-PE anticorpoBiolegendBLE145703Diluição: 1/100
anticorpo CD31AbCamab215912Diluição: 1/50
Software de análise 3D comercial - instrumentoIMARIS Oxfordcom módulo celular
Microscópio confocal - Nikon A1RNikon
DapiThermoFisherD1306Concentração de estoque: 5 mg/mL; diluição 1/1000
DesoxicolatoSigma-aldrichD6750
DMSOSigma-aldrichD8418
Glut4 anticorpoSanta Cruzsc-53566Diluição: 1/50
GlycineSigma-aldrichG7126
Lectin-DyLight649Vector LabDL-1178-1Concentração de Estoque: 2 µ g/µ L; Injeção IV: 50 µ Câmara
de imagem metálica equipada com fundo de vidro - Câmara AttoFluorThermofisherA7816
Salicilato de metilaSigma-aldrichM6752
Anticorpo perilipinaProgen651156Diluição: 1/50
Faloidina-alexa488ThermoFisherA12379Diluição: 1/100
TCR-β-PB anticorpoBiolegendBLE109225Diluição: 1/100
TH anticorpoAbCamab112Diluição: 1/50
Triton X100Sigma-aldrichX100
Tween-20Sigma-aldrichP416

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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