Quantificando o microambique do tumor metastático cerebral usando um modelo 3D de chip de órgão, aprendizado de máquina e tomografia confocal

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para preparar e esculpir uma barreira cerebral sanguínea microambienta tumoral metastático e, em seguida, quantificar seu estado usando imagens confocal e inteligência artificial (machine learning).

Resumo

Metástases cerebrais são as lesões de câncer mais letais; 10-30% de todos os cânceres metástases no cérebro, com uma sobrevida mediana de apenas ~5-20 meses, dependendo do tipo de câncer. Para reduzir a carga do tumor metastático cerebral, as lacunas no conhecimento básico e translacional precisam ser abordadas. Os principais desafios incluem a escassez de modelos pré-clínicos reprodutíveis e ferramentas associadas. Modelos tridimensionais de metástase cerebral podem produzir os dados moleculares e fenotípicos relevantes usados para atender a essas necessidades quando combinados com ferramentas de análise dedicadas. Além disso, em comparação com os modelos de murina, modelos de células tumorais de pacientes que atravessam a barreira cerebral do sangue no microambiente cerebral geram resultados rapidamente e são mais interpretáveis com métodos quantitativos, assim, favoráveis a testes de alto rendimento. Aqui descrevemos e demonstramos o uso de uma nova plataforma de nicho cerebral microfluido 3D (μmBBN), onde múltiplos elementos do nicho podem ser cultivados por um longo período (vários dias), fluorescentemente imagens por microscopia confocal, e as imagens reconstruídas usando uma técnica inovadora de tomografia confocal; todos visavam compreender o desenvolvimento da micro metástase e mudanças no microambiente tumoral (TME) de forma repetível e quantitativa. Demonstramos como fabricar, sementes, imagem e analisar as células cancerígenas e componentes celulares e humorais TME, utilizando essa plataforma. Além disso, mostramos como a inteligência artificial (IA) é usada para identificar as diferenças fenotípicas intrínsecas das células cancerosas que são capazes de transitar através de um modelo μmBBN e atribuir-lhes um índice objetivo de potencial metastático cerebral. Os conjuntos de dados gerados por esse método podem ser utilizados para responder a questões básicas e translacionais sobre metástase, a eficácia das estratégias terapêuticas e o papel do TME em ambos.

Introdução

Metástases cerebrais são as lesões de câncer mais letais; 10-30% de todos os cânceres metástases no cérebro, com uma sobrevida mediana de apenas ~5-20 meses, dependendo do câncer tipo^1,2. Uma questão principal que surge ao estudar a metástase do câncer é como sub clones migram do ambiente humorístico da corrente sanguínea para um órgão como o cérebro^3,,4. Esta questão levou a muitas variações de ensaios migratórios, de invasão e extravasação. Todos esses métodos compartilham o passo crítico de contagem ou medição de propriedades de células que se movem....

Protocolo

1. Prepare o molde do nicho da barreira cerebral do sangue

NOTA: O dispositivo de cultivo usado nesta plataforma é um andaime baseado em PDMS que construímos um nicho de barreira cerebral de sangue celular. É feito de duas partes separadas por uma membrana porosa. Para preparar o nicho da barreira cerebral sanguínea são necessários dois moldes SU-8 feitos com fotolitografia^26,27. O protocolo será descrito para o molde de 100 μm de espessura primeiro e, em seguida, as notas serão dadas para o molde de 200 μm de espessura.

1. Para preparar o molde, limpe um wafer de silício de ....

Resultados

Utilizando essa técnica, analisamos tipos de células rotuladas com diferentes proteínas fluorescentes ou corantes. Demonstramos o uso desta abordagem com um chip μmBBN formulado com astrócitos hCMEC/D3-DsRed e não fluorescentes. As células endoteliais microvasculares cerebrais foram semeadas em uma membrana porosa (poros gravados por 5 μm de pista) e colocadas em uma incubadora³⁴ a 37 °C sob 5% de CO₂. Após três dias, a confluência da camada endotelial foi confirmada via microscopia e, .......

Discussão

Desenvolvemos e apresentamos um novo método que adapta ferramentas frequentemente utilizadas em análises de imagem clínica para medição de extravasação e migração de células cancerígenas através de uma barreira endotelial no tecido cerebral. Nós colocamos essa abordagem pode ser útil tanto para medições in vivo quanto in vitro; demonstramos seu uso em um sistema microfluido 3D recapitulando vasculatura cerebral. As medidas de células cancerígenas, incluindo distância extravasada, percentual extravasado por volume, esferi.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,25% de tripsina-EDTA com vermelho de fenol	Thermo Fisher Scientific	25200056
punção de biópsia de 1,5 mm com êmbolo	Integra LifeSciences Corporation	33-31A-P/25
10x MEM	Thermo Fisher Scientific	11430030 placas de
150 mm	Fisher Scientific	FB0875714
1x DPBS, sem Ca e Mg	Thermo Fisher Ponta	Scientific 14190144
200uL	Fisher Scientific	02-707-411
Wafer de silício de 4 polegadas	University Wafer	452
Fita de embalagem de 48 mm de largura	Fisher Scientific	19-072-097
Lâmina de vidro de 50 x 75 mm	Fisher Scientific	12-550C
A1	Nikon
acetona	Fisher Scientific	A9-20
antibiótico/antimicótico (penicilina/estreptomicina/anfotericina)	Gibco	15240062
lâmina de estilete	Fisher Scientific	NC1721575
tesoura de dissecação	Fisher Scientific	08-951-5
DMEM com 4,5 g/L de glicose	Thermo Fisher Scientific	11960-044
fita dupla face	Fisher Scientific	NC0879005
EGM-2	Lonza	CC-3162
Soro Bovino Fetal, Inativado por Calor	Corning	MT35011CV
Fiji software	ImageJ
frasco de vidro	Fisher Scientific	03-341-25D
glutamax	Thermo Fisher Scientific
hCMEC/D3	EMD Millipore	SCC066
Jupyter notebook	Anaconda
L-glutamina	Thermo Fisher Scientific	25030081
Matrigel - fator de crescimento reduzido com vermelho de fenol	Corning	CB-40230A
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26
MDA-MB-231-BR-GFP	Dra. Patricia Steeg, suplemento de crescimento NIH
N-2	Thermo Fisher Scientific	17502048
astrócitos humanos normais (NHA)	Lonza	CC-2565
Software laranja	Universidade de Ljubljana
Pipeta Pasteur	Fisher Scientific	13-711-9AM
Máscaras de fotolitografia	Photosciences Incorporated
pLL3.7-dsRed	University of Michigan Vector Core
pLL-EV-GFP	Universidade de Michigan Vector Core
pLOX-TERT-iresTK	Addgene	12245
pMD2.G	Addgene	12259
membrana de policarbonato, tamanho de poro de 5um	Millipore	TMTP04700
psPAX2	Addgene	12260
PureCol, 3 mg/mL	Advanced Biomatrix	5005
Bicarbonato de sódio	Thermo Fisher Scientific	25080094
piruvato de sódio	Thermo Fisher Scientific	11360070
Copo solo	Fisher Scientific	NC1416545
SU-8 2075	MicroChem Corporation	Y111074 0500L1GL
SU8 desenvolvedor	MicroChem Corporation	Y020100 4000L1PE
Sylgard 184	Ellsworth Adhesive Company	NC0162601
Tolueno	Sigma-Aldrich	179965-1L
Tricholoro perfluoro octil silano	Sigma-Aldrich	448931-10G

Petri de de pipeta Microscópio confocal 35050061 de colágeno bovino tipo I