Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor eencellige elektroporatie dat genen kan leveren in zowel excitatory als remmende neuronen in een reeks in vitro hippocampale slice-cultuurleeftijden. Onze aanpak zorgt voor een nauwkeurige en efficiënte expressie van genen in individuele cellen, die kunnen worden gebruikt om cel-autonome en intercellulaire functies te onderzoeken.
Abstract
Elektroporatie heeft zich gevestigd als een kritische methode voor het overbrengen van specifieke genen in cellen om hun functie te begrijpen. Hier beschrijven we een eencellige elektroporatietechniek die de efficiëntie (~ 80%) van in vitro gentransfectie in excitatory en klassespecifieke remmende neuronen in muis organotypische hippocampale slice-cultuur maximaliseert. Met behulp van grote glaselektroden, tetrodotoxine-bevattende kunstmatige cerebrospinale vloeistof en milde elektrische pulsen, leverden we een gen van belang in gekweekte hippocampale CA1-piramidale neuronen en remmende interneurons. Bovendien kon elektroporatie worden uitgevoerd in gekweekte hippocampale slices tot 21 dagen in vitro zonder vermindering van de transfectie-efficiëntie, waardoor de ontwikkelingsstadia van de segmentcultuur konden worden bestudeerd. Met de interesse om de moleculaire functies van genen in een breed scala van celtypen te onderzoeken, toont onze methode een betrouwbare en eenvoudige benadering van in vitro gentransfectie in muishersenweefsel die kan worden uitgevoerd met bestaande elektrofysiologische apparatuur en technieken.
Introduction
In de moleculaire biologie is een van de belangrijkste overwegingen voor een onderzoeker hoe een gen van belang in een cel of populatie cellen kan worden afgeleverd om zijn functie op te helderen. De verschillende leveringsmethoden kunnen worden gecategoriseerd als biologisch (bv. een virale vector), chemisch (bv. calciumfosfaat of lipide) of fysisch (bv. elektroporatie, micro-injectie of biolistica)1,2. Biologische methoden zijn zeer efficiënt en kunnen celtypespecifiek zijn, maar worden beperkt door de ontwikkeling van specifieke genetische hulpmiddelen. Chemische benaderingen zijn zeer krachtig in vitro, maar transfecties zijn over het algemeen willekeurig; verder zijn deze benaderingen meestal alleen voorbehouden aan primaire cellen. Van de fysieke benaderingen is biolistics technisch gezien het eenvoudigst en gemakkelijkst, maar produceert opnieuw willekeurige transfectieresultaten met een relatief laag rendement. Voor toepassingen die overdracht naar specifieke cellen vereisen zonder dat we genetische hulpmiddelen hoeven te ontwikkelen, kijken we naar eencellige elektroporatie3,4.
Terwijl elektroporatie in de afgelopen twintig jaar alleen betrekking had op veldelektroporatie, zijn er in de afgelopen twintig jaar meerdere in vitro en in vivo eencellige elektroporatieprotocollen ontwikkeld om specificiteit en efficiëntie5,6,7te verbeteren , wat aantoont dat elektroporatie kan worden gebruikt om genen over te dragen naar individuele cellen en daarom uiterst nauwkeurig kan zijn. De procedures zijn echter technisch veeleisend, tijdrovend en relatief inefficiënt. Recentere artikelen hebben inderdaad de haalbaarheid onderzocht van gemechaniseerde elektroporatieplatforms8,9, die kunnen helpen om verschillende van deze barrières weg te nemen voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het installeren van dergelijke robotica. Maar voor degenen die op zoek zijn naar eenvoudigere middelen, blijven de problemen met elektroporatie, namelijk celdood, transfectiefalen en pipetverstopping, een zorg.
We hebben onlangs een elektroporatiemethode ontwikkeld die gebruik maakt van glazen pipetten met grotere punt, mildere elektrische pulsparameters en een unieke drukcyclile stap, die een veel hogere transfectie-efficiëntie in excitatory neuronen genereerde dan eerdere methoden, en ons voor het eerst in staat stelde om genen in remmende interneurons te transfecteren, waaronder somatostatine-uitdrukkende remmende interneurons in het hippocampale CA1-gebied van muisorganotypische plakcultuur10. De betrouwbaarheid van deze elektroporatiemethode in verschillende remmende interneurontypen en neuronale ontwikkelingsstadia is echter niet aangepakt. Hier hebben we aangetoond dat deze elektroporatietechniek in staat is om genen over te zetten in zowel excitatory neuronen als verschillende klassen van interneurons. Belangrijk is dat de transfectie-efficiëntie hoog was, ongeacht de dagen in vitro (DIV) slice culture age getest. Deze gevestigde en gebruiksvriendelijke techniek wordt ten zeerste aanbevolen aan elke onderzoeker die geïnteresseerd is in het gebruik van eencellige elektroporatie voor verschillende celtypen in de context van in vitro muishersenweefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprotocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of Massachusetts Medical School. Slice culture preparation, plasmidevoorbereiding en elektroporatie worden ook beschreven in onze eerder gepubliceerde methoden en kunnen worden verwezen voor aanvullende informatie10.
1. Snijd cultuurbereiding
- Bereid muis organotypische hippocampale plakculturen voor zoals eerder beschreven11, met behulp van postnatale 6- tot 7-daagse oude muizen van beide geslachten.
- Bereid dissectiemedia voor organotypische plakcultuur bestaande uit (in mM): 238 sucrose, 2,5 KCl, 1 CaCl2,4 MgCl2,26 NaHCO3,1 NaH2PO4en 11 glucose in gedeïoniseerd water, vervolgens gas met 5% CO2/95% O2 tot een pH van 7,4.
- Bereid organotypische plakcultuurmedia bestaande uit: 78,8% (v/v) Minimum Essential Medium Eagle, 20% (v/v) paardenserum, 17,9 mM NaHCO3, 26,6 mM glucose, 2 M CaCl 2 , 2 M MgSO4, 30 mM HEPES, insuline (1 μg/ml) en 0,06 mM ascorbinezuur. Stel de osmolariteit in op 310-330 osmol met behulp van een osmometer.
- Ontleed hippocampi uit de hele hersenen met behulp van twee spatels en snijd (400 μm) met behulp van een tissue chopper. Afzonderlijke segmenten met behulp van twee tangen en breng over op 30 mm celkweekinzetstukken in een 6-putplaat gevuld met kweekmedia (950 μL) onder de inzetstukken.
- Bewaar organotypische plakculturen in een weefselkweek-incubator (35°C, 5% CO2)en verander de plakkweekmedia om de twee dagen.
2. Plasmide voorbereiding
- Bereid de plasmide voor op het gen van belang.
- Subklonen verbeterd groen fluorescerend eiwit (EGFP) gen in een pCAG vector.
- Zuiver pCAG-EGFP plasmide met een endotoxinevrije zuiveringskit en los op in een interne oplossing die bestaat uit met diethylpyrocarbonaat behandeld water met 140 mM K-methaansulfaat, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2en 10 mM HEPES, aangepast aan pH 7,3 met KOH (plasmideconcentratie: 0,1 μg/μL).
3. Glazen pipet voorbereiding
- Trek borosilicaat glazen pipetten (4,5 – 8 MΩ) op een micropipettrekker (figuur 1A).
OPMERKING: De glazen pipetten die worden gebruikt voor patchklemopnamen met hele cellen zijn ideaal voor elektroporatie. - Bak glazen pipetten 's nachts op 200°C om te steriliseren.
- Controleer de grootte van de pipetpunt onder een dissectiemicroscoop om de elektrische weerstand te benaderen.
- Optioneel: Controleer de pipetweerstand door de pipet aan de elektroporatieelektrode te bevestigen en gebruik de micromanipulator om de pipettip in de met filter gesteriliseerde kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) te manoeuvreren die (in mM) bevat: 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5CaCl2,5 MgCl2, 26NaHCO3,1 NaH2 PO 4 en 1 glucose Bevestig de werkelijke weerstand met behulp van de uitlezing op de elektroporator.
OPMERKING: Hoe scherper de pipetpunt, hoe groter de elektrische weerstand. De pipetweerstand moet lager zijn dan 10 MΩ. Glazen pipetten met een hoge pipetweerstand (figuur 1B) verstoppen vaak aan de punt tijdens herhaalde elektroporatie.
- Optioneel: Controleer de pipetweerstand door de pipet aan de elektroporatieelektrode te bevestigen en gebruik de micromanipulator om de pipettip in de met filter gesteriliseerde kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) te manoeuvreren die (in mM) bevat: 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5CaCl2,5 MgCl2, 26NaHCO3,1 NaH2 PO 4 en 1 glucose Bevestig de werkelijke weerstand met behulp van de uitlezing op de elektroporator.
4. Elektroporation installatieopstelling
- Installeer de elektroporator op een standaard elektrofysiologie-installatie voor hele cellen, uitgerust met een rechtopstaande microscoop gemonteerd op een schakeltafel met een micromanipulator en peristaltische pomp.
- Installeer de kop van de elektroporator op een micromanipulator en sluit een paar luidsprekers aan op de elektroporator. Sluit de elektroporator aan op een voetpedaal dat kan worden gebruikt om een puls te verzenden wanneer deze klaar is.
OPMERKING: De luidsprekers geven een toon af wanneer ze worden ingeschakeld, wat een indicator is van de elektrische weerstand bij de elektrode. Dit maakt het mogelijk om relatieve veranderingen in weerstand te bepalen zonder de aandacht van de procedure af te trekken.
5. Elektroporatievoorbereiding
- Breng plak kweekinzetstukken over van 6 putplaten naar 3 cm Petrischalen geladen met 900 μL kweekmedia en bewaar in een tafelblad CO2 incubator tot ze klaar zijn om elektroporatie uit te voeren.
- Pre-incubate verse kweekinzetstukken met plak cultuur media (1 ml) gedurende ten minste 30 minuten in een petrischaal van 3,5 cm tot kweekschijfjes na elektroporatie.
- Reinig en bereid het booreiland voor op elektroporatie.
- Doordrenk de lijnen gedurende 5 minuten met 10% bleekmiddel om de slang en kamer te steriliseren voordat u het experiment voor de dag begint.
- Doordrenk de lijnen met gedeioneerd autoclaafwater gedurende ten minste 30 minuten om volledig te spoelen.
- Doordrenkt de lijnen met met filter gesteriliseerde aCSF die 0,001 mM tetrodotoxine (TTX) bevat.
OPMERKING: TTX minimaliseert cellulaire toxiciteit en overlijden als gevolg van overexcitatie van interneurons10.
- Stel de pulsparameters van de elektroporator in: amplitude van –5 V, vierkante puls, trein van 500 ms, frequentie van 50 Hz en een pulsbreedte van 500 μs.
- Vul de glazen pipet met 5 μL plasmidehoudende interne oplossing.
- Verwijder eventuele vastzittende luchtbellen van de pipettip door meerdere keren te tikken en zachtjes op de punt te tikken.
- Controleer de punt op beschadigingen door deze te visualiseren onder een dissectiemicroscoop of door stap 3.3.1 te herhalen om de pipetweerstand te controleren.
OPMERKING: Als de punt beschadigd is, moet de glazen pipet worden weggegooid en deze stap moet worden herhaald met een nieuwe glazen pipet die eerder in stap 3 is voorbereid.
- Bevestig de pipettip stevig aan de elektrode en zet de luidsprekers aan. Noteer de uitlezing (de weerstand van de pipet) van de elektroporator wanneer de tip contact heeft gemaakt met het aCSF-medium.
- Snijd het kweekinzetmembraan met een scherp mes en isoleer één plakcultuur. Breng de plakcultuur voorzichtig over naar de elektroporatiekamer met behulp van een scherpe hoekige tang en bevestig de positie met een plakanker.
- Houd de plakcultuur niet langer dan 30 minuten per keer buiten de incubator om bijwerkingen zoals veranderingen in neuronale gezondheid of functie12te voorkomen.
6. Elektroporaatcellen van belang
- Oefen positieve druk uit op de pipet met de mond of met behulp van een spuit van 1 ml (druk van 0,2 - 0,5 ml) die aan de slang is bevestigd.
- Gebruik de 3-dimensionale knopbediening van de micromanipulator om de pipetpunt in de buurt van het oppervlak van de plakcultuur te manoeuvreren.
- Kies een doelcel en benader deze, houd de positieve druk toegepast totdat er een kuiltje op het celoppervlak ontstaat, zichtbaar op de microscoop.
- Drukcycli uitvoeren.
- Oefen snel milde negatieve druk uit via de mond, zodat er een losse afdichting ontstaat tussen de pipetpunt en het plasmamembraan, visueel aangegeven door het membraan dat enigszins in de pipetpunt omhoog gaat. Let op een toename (~2,5x de beginweerstand) in pipetweerstand door te luisteren naar een toename van de toon die uit de luidsprekers komt. Breng snel weer positieve druk aan zodat het kuiltje zich opnieuw vormt.
- Voltooi onmiddellijk nog minstens twee drukcycli zonder te pauzeren en houd vervolgens de negatieve druk 1 s vast.
OPMERKING: Pauzeren tussen cycli, te veel druk uitoefenen of de negatieve druk te lang vasthouden, kan aanzienlijke celschade veroorzaken en mogelijk de cel laten afsterven tijdens elektroporatie.
- Pulseer de elektroporator snel eenmaal met behulp van het voetpedaal wanneer de toon van de luidsprekers een stabiele top in toonhoogte bereikt, wat wijst op een piek elektrische weerstand. Wacht niet langer dan 1 s bij de piekweerstand voordat u de puls verzendt.
OPMERKING: We hebben geen off-target elektroporatie waargenomen bij het gebruik van dit protocol10. Alleen de cellen die tijdens drukcycli in contact kwamen met de glazen pipet werden getransfecteerd. Het plaatsen van de pipet in de buurt van andere neuronen leidt niet tot gentransfectie. - Trek de pipet voorzichtig ongeveer 100 μm uit de cel zonder druk uit te oefenen.
- Breng opnieuw positieve druk aan, controleer of de weerstand vergelijkbaar is met de geregistreerde uitlezing in stap 5.5 en benader vervolgens de volgende cel.
- Verwijder potentiële klompen, visueel aangegeven of door een significant verhoogde (>15% hogere) pipetweerstand na elektroporatie, door positieve druk uit te oefenen.
OPMERKING: Als er geen zichtbare verstopping is en de weerstand nog steeds aanzienlijk hoger is, gooi dan de pipet weg en gebruik een nieuwe. Gemiddeld kan een pipet worden gebruikt voor maximaal 20 elektroporatiegebeurtenissen als de gebruiker voorzichtig is10.
- Verwijder potentiële klompen, visueel aangegeven of door een significant verhoogde (>15% hogere) pipetweerstand na elektroporatie, door positieve druk uit te oefenen.
- Breng na elektroporatie de plakcultuur over op een verse kweekinzet en incubeer maximaal 3 dagen bij 35°C in de incubator.
7. Fixatie, kleuring en beeldvorming van organotypische hippocampale plakculturen
- Fix elektroporated organotypic slice culturen 2 – 3 dagen na transfectie met 4% paraformaldehyde en 4% sucrose in 0,01 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS) gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur.
- Verwijder fixatieve en incubeer plakjes in 30% sacharose in 0,1 M fosfaatbuffer (1x PB) gedurende 2 uur.
- Leg plakjes op een glijbaanglas en vries ze in door het schuifglas op gemalen droogijs te leggen. Ontdooi de plakjes op kamertemperatuur en breng ze over op een 6-putplaat gevuld met 1x PBS.
- Bevlek de plakjes met muis anti-GFP en konijn anti-RFP antilichamen in GDB buffer (0,1% gelatine, 0,3% Triton X-100, 450 mM NaCl, en 32% 1x PB, pH 7,4) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Was plakjes met 1x PBS drie keer op kamertemperatuur gedurende 10 minuten per wasbeurt.
- Incubeer plakjes met antimuis Alexa 488-geconjugeerd secundair antilichaam en anti-konijn Alexa 594-geconjugeerd secundair antilichaam in GDB-buffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Incubeer plakjes met DAPI (4 μg/ml) in 1x PBS gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Was plakjes met 1x PBS drie keer op kamertemperatuur gedurende 3 minuten per wasbeurt.
- Monteer plakjes op glazen dia's met behulp van montagemedium en voer fluorescentiebeeldvorming uit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onze eencellige elektroporatie is in staat om genen nauwkeurig af te leveren in visueel geïdentificeerde excitatory en remmende neuronen. We elektroporated drie verschillende neuronale celtypes op drie verschillende tijdstippen. Parvalbumine (Pv) of vesiculaire glutamaat type 3 (VGT3) die neuronen uitdrukt, werden gevisualiseerd door Pvcre (JAX #008069) of VGT3cre (JAX #018147) lijnen te kruisen met TdTomato (een variant van rode fluorescerende eiwit) reporter lijn (Jax #007905), respectievelijk genaamd Pv /TdTomato en VGT3 / TdTomato lijnen. Organotypische plakculturen werden bereid uit C57BL/6J, Pv/TdTomato en VGT3/TdTomato muizen.
Ten eerste werd elektroporatie uitgevoerd in CA1-piramidale neuronen (Py) op 7, 14 of 21 dagen in vitro (DIV). EGFP werd overgetransfecteerd in 5-20 piramidale neuronen in het hippocampale CA1-gebied gedurende deze slicecultuurleeftijden (Figuur 2B-D). CA1-piramidale neuronen werden geïdentificeerd met behulp van differentieel interferentiecontrast (DIC). Om de anatomische verdeling en morfologische verschillen tussen piramidale neuronen en remmende interneurons in plakcultuur aan te tonen, werden CA1-piramidale neuronen geëlektropoeerd met EGFP in een DIV7 Pv/TdTomato-muis en werd nucleaire counterstaining uitgevoerd om de verschillende locatie van EGFP-positieve neuronen in de CA1-piramidale cellaag weer te geven (Figuur 2A).
Vervolgens werd dit protocol ook toegepast op TdTomato-positieve Pv- en VGT3-geïnterneerden. EGFP elektroporatie werd uitgevoerd in 1-10 fluorescerend gelabelde interneurons. TdTomato-positieve Pv (Figuur 3) en VGT3 (Figuur 4) neuronen werden met succes geëlektropoeerd in het hippocampale CA1 gebied. Interessant is dat transfectie van het EGFP-gen dat van belang is voor al deze remmende neuronale typen niet significant werd beïnvloed door DIV en niet verschilde met de transfectie-efficiëntie (~ 80%) waargenomen in CA1-piramidale neuronen (Figuur 5).
Figuur 1: Twee representatieve glazen pipet afbeeldingen.
(A) Toon pipetten met een lagere weerstand (6,5 MΩ), gebruikt in dit protocol, en (B) pipetten met een hogere weerstand (10,4 MΩ) die typisch zijn voor elektroporatieprotocollen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Organotypische hippocampale plakculturen werden geëlektropoeerd met EGFP (groen) op drie verschillende tijdstippen.
(A) Representatieve organotypische hippocampale plakcultuur in een DIV7 Pv/TdTomato muis. CA1-piramidale neuronen werden geëlektropoeerd met EGFP (groene, witte pijlpunten) en vertoonden geen overlap met TdTomato (TdT)-positieve Pv-interneurons (rode, gele pijlpunten). DAPI nucleaire counterstaining (blauw) werd uitgevoerd. DG: dentate gyrus. (B-D) CA1-piramidale neuronen werden geëlektropoeerd met EGFP op drie verschillende tijdstippen: (B) DIV7, (C) DIV14 en (D) DIV21. Organotypische plakculturen werden gefixeerd met 4% sucrose, 4% paraformaldehyde/ 1x PBS en afgebeeld zonder verdere doorsnede. Linksboven, lage vergrotingsafbeeldingen van het hippocampale CA1-gebied. Pijlpunten vertegenwoordigen individuele CA1-piramidale neuronen die zijn gericht op elektroporatie. Getransfecteerde neuronen met gele pijlpunten worden ingezoomd in de onderste panelen. Witte pijlpunten betekenen extra elektroporated neuronen buiten de hoge vergrotingsweergave. Rechtsboven, lage vergroting beelden van over elkaar heen (Sup) fluorescerende en Nomarski afbeeldingen. Schaalbalken: respectievelijk 500, 50, 100, 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Pv/TdTomato organotypische hippocampale plakculturen werden geëlektropoeerd met EGFP (groen) op drie verschillende tijdstippen.
(A) DIV7, (B) DIV14 en (C) DIV21. Overlap met Pv-gelabelde TdTomato (TdT)-positieve cellen (rood) werd waargenomen in de hippocampale CA1-piramidale cellaag en oriens. In de lage vergrotingssets (bovenste rij) vertegenwoordigen gele pijlpunten individuele Pv-geïnterneerdeurons die zijn gericht op elektroporatie. Witte pijlpunten betekenen extra TdTomato-positieve Pv-geïnterneerde ionen die buiten de hoge vergrotingsweergave zijn geëlektropoeerd. Schaalbalken: 50, 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: VGT3/TdTomato organotypische hippocampale plakculturen werden geëlektropoeerd met EGFP (groen) op drie verschillende tijdstippen.
(A) DIV7, (B) DIV14 en (C) DIV21. Overlap met VGT3-gelabelde TdTomato (TdT)-positieve cellen (rood) werd waargenomen in de hippocampale CA1-piramidale cellaag en oriens. In de lage vergrotingssets (bovenste rij) vertegenwoordigen gele pijlpunten individuele VGT3-geïnterneerdeurons die zijn gericht op elektroporatie. Witte pijlpunten betekenen extra TdTomato-positieve VGT3-geïnterneerde ionen die buiten de hoge vergrotingsweergave zijn geëlektropoeerd. Schaalbalken: 50, 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Vergelijkbare niveaus van transfectie-efficiëntie in CA1-piramidale neuronen, Pv/TdTomato en VGT3/TdTomato-interneuronen op drie verschillende in vitro slice-cultuurleeftijden.
Overzichtsbalkgrafieken van drie verschillende segmentcultuurleeftijden: DIV7 (links), DIV14 (midden) en DIV21 (rechts). Elk symbool vertegenwoordigt de transfectie-efficiëntie verkregen uit één organotypische plakcultuur CA1 Py: DIV7 (12 plakculturen van 2 muizen), DIV14 (8/2), DIV21 (8/2); Pv: DIV7 (5/2), DIV14 (6/2), DIV21 (6/2); VGT3: DIV7 (6/2), DIV14 (7/2), DIV21 (6/2). Eenrichtings ANOVA; n.s. (niet significant). De getoonde gegevens zijn gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven hier een elektroporatiemethode die zowel excitatory als remmende neuronen met hoge efficiëntie en precisie transfecteert. Ons geoptimaliseerde elektroporatieprotocol heeft drie innovatieve doorbraken om een zeer efficiënte gentransfectie te bereiken. Onze eerste wijziging was om de pipetgrootte te vergroten in vergelijking met eerder gepubliceerde protocollen3,5,6. Deze verandering stelde ons in staat om veel neuronen te elektropoeren zonder pipet verstopping. Bovendien is het mogelijk dat de pipetten met een lagere weerstand het gebruik van mildere elektrische pulsparameters mogelijk maken in vergelijking met eerdere methoden, terwijl ze toch het gewenste resultaat bereiken3. Vervolgens, herhaalde druk fietsen voor elektroporatie duidelijk verminderde celdood10. We merkten vaak op dat met de toepassing van een enkele puls van negatieve druk vóór elektroporating, plasmamembraan vastzat aan de binnenkant van de pipetpunt, waardoor de cel werd beschadigd. De drukcycli hielpen veel minder plasmamembraan aan de pipet te plakken, wat de celoverleving en het herstel tijdens de procedure verbeterde10. Ten slotte verbeterde de toevoeging van TTX aan aCSF het succes van elektroporatie in remmende neuronen10aanzienlijk . Wij zijn van mening dat elektroporatie dodelijke celoverexcitatie kan veroorzaken die door TTX kan worden voorkomen. Bovenal bieden deze kritische verbeteringen opmerkelijk hoge slagingspercentages in elektroporatie voor zowel excitatory als remmende neuronen (Figuur 5). Hoewel we geen elektrofysiologische afwijkingen in onze neuronen vonden na transfectie met deze methode10 in de beoogde cellen, is gemeld dat lokale pH-veranderingen tijdens elektroporatie de levensvatbaarheid van cellen verminderen en de optimalisatie van elektroporatieparameters relatief moeilijk kan zijn in vergelijking met andere gentransfectiemethoden13,14. Daarom is het belangrijk om onvoorziene bijwerkingen van elektroporatie te overwegen en de elektrische parameters indien nodig opnieuw te optimaliseren om een hoge transfectie-efficiëntie voor elke specifieke toepassing te bereiken.
Micro-injectietechnologie is ook gebruikt als een krachtige benadering om transgenen te leveren aan cellen2,15,16. Deze aanpak levert echter over het algemeen een lagere opbrengst van transfectie op en vereist een hoog niveau van vaardigheid. Onze methode kan daarentegen relatief eenvoudig en tegen minimale kosten worden gebruikt voor laboratoria die routinematig elektrofysiologiestudies met hele cellen uitvoeren.
Onlangs hebben we laten zien dat meerdere genen kunnen worden getransfecteerd in zowel excitatory als somatostatine die remmende neuronen uitdrukken zonder bijwerkingen op elektrofysiologische eigenschappen10. In deze studie tonen we aan dat deze elektroporatiemethode zeer efficiënt is in CA1-piramidale neuronen (figuur 2) en Pv (figuur 3) en VGT3 (figuur 4) remmende interneuronen. Bovendien stelt deze elektroporatietechniek ons in staat om genen van belang te transfecteren met een slagingspercentage van ~ 80%, ongeacht celtype of aantal dagen in vitro (Figuur 5). Hoewel de techniek alleen in vitro is getest, is aangetoond dat organotypische hippocampale plakculturen op dezelfde DIV-tijdpunten die we hebben getest, leeftijdsgematchte in vivo synaptische morfologie en activiteit volgen, zoals te zien is in acuut bereide hippocampale plakjes17. Bovendien, omdat we deze methode alleen in hippocampale neuronen hebben getest, is het mogelijk dat er onverwachte uitdagingen kunnen zijn bij het toepassen van deze techniek op neuronen in andere hersengebieden. De methode nodigt uit tot het verkennen van genen tijdens organotypische segmentcultuurontwikkeling waarbij synaptische transmissie en dichtheid, naast andere eigenschappen, in de loop van de tijd veranderen.
Dit protocol is een verbetering ten opzichte van eerder vastgestelde in die zin dat het tegelijkertijd goedkoop, minder technisch uitdagend en efficiënter is in het genereren van gentransfectie met één neuron5,6,7,8,9. Het lijkt ook een verbetering te zijn ten opzichte van eerdere methoden in termen van lagere percentages celschade of overlijden, omdat we hebben waargenomen dat ~ 80% van de cellen na de procedure met succes werden getransfecteerd en gezond. Deze methode biedt daarom een nieuwe mogelijkheid om de rollen van genen in meerdere neuronale celtypen te onderzoeken met behulp van fluorescerende muismodellen. Toekomstige studies met behulp van deze methode kunnen zich richten op eiwit-eiwit interacties tussen cellen om specifieke moleculaire of fysiologische functies te onderzoeken, waaronder trans-synaptische eiwitinteracties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Grants (R01NS085215 to K.F., T32 GM107000 en F30MH122146 to A.C.). De auteurs danken mevrouw Naoe Watanabe voor vakkundige technische bijstand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid preparation | |||
| Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12362 | |
| Organotypic slice culture preparation | |||
| 6 Well Plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | #5/45 | Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation |
| Flask Filter Unit | Millipore | SCHVU02RE | Filtration and storage of culture media |
| Incubator | Binder | BD C150-UL | |
| McIlwain Tissue Chopper | TED PELLA, INC. | 10180 | Tissue chopper for organotypic slice culture preparation |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Organotypic slice culture inserts |
| Osmometer | Precision Systems | OSMETTE II | |
| PTFE coated spatulas | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Scissors | FST | 14958-09 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | SCGPT01RE | Filtration and storage of aCSF |
| Electrode preparation | |||
| Capillary Glasses | Warner Instruments | 640796 | |
| Micropipetter Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller |
| Oven | Binder | BD (E2) | |
| Puller Filament | Sutter Instrument | FB330B | Puller |
| Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Dishes | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| CCD camera | Q Imaging | Retiga-2000DC | Camera |
| Electroporation System | Molecular Devices | Axoporator 800A | Electroporator |
| Fluorescence Illumination System | Prior | Lumen 200 | |
| Manipulator | Sutter Instrument | MPC-385 | Manipulator |
| Metamorph software | Molecular Devices | Image acquisition | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Dynamax, RP-2 | Perfusion pump |
| Shifting Table | Luigs & Neuman | 240 XY | |
| Speaker | Unknown | Speakers connected to the electroporator | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ30 | |
| Table Top Incubator | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Upright Microscope | Olympus | BX61WI | |
| Fluorescence imaging #2 | |||
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 |
References
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).
- Capecchi, M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell. 22 (2), Pt 2 479-488 (1980).
- Rae, J. L., Levis, R. A.
- Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons. Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).
- Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques. Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).
- Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures. Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).
- Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), 094904 (2017).
- Li, L., et al. A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo. Nature Communication. 8, 15604 (2017).
- Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F.
- Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture. Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632 (2020).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).
- Li, Y., et al. Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down. Science Reports. 5, 17817 (2015).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. Journal of Physiology. 550, Pt 1 135-147 (2003).
