Name: Eletroporação unicelular em diferentes culturas organotipápicas de neurônios inibitórios hipocampais e inibidores específicos de classe (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Aprenda a técnica de eletroporação unicelular para transfecção gênica em culturas organotípicas de hipocampo. Este método eficiente permite estudar funções moleculares e fisiológicas de neurônios excitatórios e inibitórios.

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Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Subsídios à Saúde (R01NS085215 a K.F., T32 GM107000 e F30MH122146 a A.C.). Os autores agradecem à Sra. Naoe Watanabe por assistência técnica hábil.

Todos os protocolos animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Faculdade de Medicina da Universidade de Massachusetts. A preparação da cultura de fatias, a preparação plasmida e a eletroporação também estão detalhadas em nossos métodos publicados anteriormente e podem ser encaminhadas para informações adicionais10.
1. Preparação para cultura de fatias
<ol><li>Prepare culturas de fatias hipocampais organotípicas do rato como descrito anteriormente11, usando camundongos pós-natal de 6 a 7 dias de idade de ambos os sexos.<ol>
<li>Preparar a mídia de dissecção para a cultura de fatia organotipípica composta (em mM): 238 sacarose, 2,5 KCl, 1 CaCl2, 4 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, e 11 glicose em água desionizada, depois gás com 5% DE CO2/95% O2 a um pH de 7,4.</li>
		<li>Prepare a mídia de cultura de fatia organotipípica composta por: 78,8% (v/v) Águia Média Essencial Mínima, 20% (v/v) soro de cavalo, 17,9 mM NaHCO3, 26,6 mM de glicose, 2 M CaCl2, 2 M MgSO4,30 mM HEPES, insulina (1 μg/mL) e 0,06 mM ácido ascórbico, pH ajustado para 7,3. Ajuste a osmolaridade para 310-330 osmol usando um osmômetro.</li>
		<li>Disseque hipocampi de todo o cérebro usando duas espátulas, e corte (400 μm) usando um helicóptero de tecido. Separe as fatias usando duas fórceps e transfira para inserções de cultura celular de 30 mm em uma placa de 6 poços cheia de mídia de cultura (950 μL) sob as pastilhas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Armazene culturas de fatias organotipíticas em uma incubadora de cultura de tecidos (35°C, 5% CO2) e mude a mídia de cultura de fatias a cada dois dias.</li>
</ol>2. Preparação plasmid
<ol><li>Prepare o plasmídeo para o gene de interesse.<ol>
<li>Subclone aprimorou o gene da proteína fluorescente verde (EGFP) em um vetor pCAG.</li>
		<li>Purifique o plasmídeo pCAG-EGFP com um kit de purificação livre de endotoxinas e dissolva-se em uma solução interna que consiste em água tratada com pirocarbonato de dietilo contendo 140 mM K-metanosulfonato, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2e 10 mM HEPES, ajustado para pH 7.3 com KOH (concentração plasmida: 0,1 μg/μL).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparação de pipeta de vidro
<ol><li>Puxe pipetas de vidro borossilicato (4,5 – 8 MΩ) em um puxador de micropipette(Figura 1A). NOTA: As pipetas de vidro usadas para gravações de grampos de remendo de células inteiras são ideais para eletroporação.</li>
	<li>Asse pipetas de vidro durante a noite a 200°C para esterilizar.</li>
	<li>Verifique o tamanho da ponta da pipeta sob um microscópio de dissecção para aproximar a resistência elétrica.<ol>
<li>Opcional:Verifique a resistência da pipeta anexando a pipeta ao eletrodo de eletroporação e use o micromanipulador para manobrar a ponta da pipeta em fluido cerebrospinal artificial esterilizado por filtro (aCSF) contendo (em mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 5 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 e 11 glicose em água desionizada, gaseado com 5% de CO2/95% O2 a um pH de 7,4. Confirme a resistência real usando a leitura no eletroporador. NOTA: Quanto mais nítida a ponta da pipeta, maior a resistência elétrica. A resistência à pipeta deve estar abaixo de 10 MΩ. Pipetas de vidro com alta resistência à pipeta(Figura 1B) muitas vezes entupem na ponta durante a eletroporação repetida.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Configuração da plataforma de eletroporação
<ol><li>Instale o eletroporador em uma plataforma padrão de eletrofisiologia de células inteiras, equipada com um microscópio vertical montado em uma mesa de mudança com uma bomba micromanipuladora e peristáltica.</li>
	<li>Instale o headstage do eletroporador em um micromanipulador e conecte um par de alto-falantes ao eletroporador. Conecte o eletroporador a um pedal de pé que pode ser usado para enviar um pulso quando estiver pronto. NOTA: Os alto-falantes emitem um tom quando ligados, que é um indicador da resistência elétrica no eletrodo. Isso permite determinar mudanças relativas na resistência sem afastar a atenção do procedimento.</li>
</ol>5. Preparação para eletroporação
<ol><li>Transfira as pastilhas de cultura de fatias de 6 placas de poço para 3 cm de placas de Petri carregadas com 900 μL de mídia cultural e armazene em uma incubadora de CO2 até estar pronta para realizar a eletroporação.<ol>
<li>Pré-inser em que a cultura fresca insira com meios de cultura fatia (1 mL) por pelo menos 30 min em uma placa de Petri de 3,5 cm para fatias de cultura após a eletroporação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Limpe e prepare a plataforma para eletroporação.<ol>
<li>Perfunda as linhas com alvejante de 10% por 5 minutos para esterilizar o tubo e a câmara antes de iniciar o experimento para o dia.</li>
		<li>Perfumar as linhas com água autoclavada deionizada por pelo menos 30 minutos para enxaguar completamente.</li>
		<li>Perfunda as linhas com aCSF esterilizado por filtro contendo tetrodotoxina de 0,001 mM (TTX). NOTA: O TTX minimiza a toxicidade celular e a morte devido à superexcitação dos interneurons10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Defina os parâmetros de pulso do eletroporador: amplitude de –5 V, pulso quadrado, trem de 500 ms, frequência de 50 Hz e uma largura de pulso de 500 μs.</li>
	<li>Encha a pipeta de vidro com 5 μL de solução interna contendo plasmídeos.<ol>
<li>Remova quaisquer bolhas de ar presas da ponta da pipeta piscando e tocando suavemente a ponta várias vezes.</li>
		<li>Verifique se há danos na ponta visualizando-a sob um microscópio de dissecção ou repetindo o passo 3.3.1 para verificar a resistência da pipeta. NOTA: Se a ponta estiver danificada, a pipeta de vidro deve ser descartada, e esta etapa deve ser repetida com uma nova pipeta de vidro previamente preparada na etapa 3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conecte com segurança a ponta da pipeta ao eletrodo e ligue os alto-falantes. Registo a leitura (resistência da pipeta) do eletroporador quando a ponta tiver feito contato com o meio aCSF.</li>
	<li>Corte a membrana de inserção de cultura usando uma lâmina afiada e isole uma cultura de fatia. Transfira cuidadosamente a cultura da fatia para a câmara de eletroporação usando fórceps angulares afiados e fixe sua posição com uma âncora de fatia.<ol>
<li>Não mantenha a cultura da fatia fora da incubadora por mais de 30 minutos de cada vez para evitar efeitos colaterais, como alterações na saúde neuronal ou função12.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Células eletroporadas de interesse
<ol><li>Aplique pressão positiva na pipeta com boca ou usando uma seringa de 1 mL (pressão de 0,2 - 0,5 mL) presa à tubulação.</li>
	<li>Use os controles de botão tridimensional do micromanipulador para manobrar a ponta da pipeta perto da superfície da cultura da fatia.</li>
	<li>Escolha uma célula-alvo e aproxime-a, mantendo a pressão positiva aplicada até que uma covinha se forme na superfície da célula, visível no microscópio.</li>
	<li>Realize ciclos de pressão.<ol>
<li>Aplique rapidamente uma leve pressão negativa pela boca de modo que uma vedação solta se forme entre a ponta da pipeta e a membrana plasmática, indicada visualmente pela membrana subindo um pouco na ponta da pipeta. Observe um aumento (~2,5x a resistência inicial) na resistência à pipeta ouvindo um aumento no tom proveniente dos alto-falantes. Aplice rapidamente a pressão positiva para que a covinha se reeme.</li>
		<li>Imediatamente complete pelo menos mais dois ciclos de pressão sem pausar, em seguida, mantenha pressão negativa para 1 s. NOTA: Pausar entre ciclos, aplicar muita pressão ou segurar a pressão negativa por muito tempo pode causar danos celulares significativos e possivelmente causar a morte da célula durante a eletroporação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pulso rápido do eletroporador uma vez usando o pedal do pé quando o tom dos alto-falantes atinge um ápice estável no tom, indicando pico de resistência elétrica. Não espere no pico de resistência por mais de 1 s antes de enviar o pulso. NOTA: Não observamos eletroporação fora do alvo ao usar este protocolo10. Apenas as células em contato com a pipeta de vidro durante os ciclos de pressão foram transfecidas. Posicionar a pipeta perto de outros neurônios não resulta em transfecção genética.</li>
	<li>Retire suavemente a pipeta aproximadamente 100 μm da célula sem aplicar pressão.</li>
	<li>Reaplousa a pressão positiva, verificando se a resistência é semelhante à leitura registrada na etapa 5.5 e, em seguida, aproxime-se da célula seguinte.<ol>
<li>Remova os potenciais tamancos, indicados visualmente ou por uma resistência significativa (>15% maior) à pipeta após a eletroporação, aplicando pressão positiva. NOTA: Se não houver entupimento visível e a resistência ainda for significativamente maior, descarte a pipeta e use uma nova. Em média, uma pipeta pode ser usada para até 20 eventos de eletroporação se o usuário tivercuidado 10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após a eletroporação, transfira a cultura da fatia para uma inserção de cultura fresca e incubar a 35°C na incubadora por até 3 dias.</li>
</ol>7. Fixação, coloração e imagem de culturas de fatias hipocampais organotípicas
<ol><li>Fixar culturas de fatia organofíspica eletroporada 2 – 3 dias após a transfecção com 4% de paraformaldeído e 4% de sacarose em 0,01 M de salina tamponada de fosfato (1x PBS) por 1,5 h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova as fatias fixativas e incubadas em 30% de sacarose em 0,1 M tampão fosfato (1x PB) por 2 h.</li>
	<li>Coloque fatias em um copo de slides e congele-as colocando o vidro de deslizamento em cima de gelo seco esmagado. Descongele as fatias em temperatura ambiente e transfira-as para uma placa de 6 poços cheia de 1x PBS.</li>
	<li>Manche as fatias com anticorpos anti-GFP e coelhinho em tampão GDB (0,1% gelatina, 0,3% Triton X-100, 450 mM NaCl e 32% 1x PB, pH 7,4) por 2h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave as fatias com 1x PBS três vezes à temperatura ambiente por 10 minutos cada lavagem.</li>
	<li>Incubar fatias com anticorpo secundário alexa 488 conjugado e anticorpo secundário alexa 594 conjugados em tampão GDB por 1 h à temperatura ambiente. Incubar fatias com DAPI (4 μg/mL) em 1x PBS por 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave as fatias com 1x PBS três vezes à temperatura ambiente por 3 minutos cada lavagem.</li>
	<li>Monte fatias em lâminas de vidro usando meio de montagem e realize imagens de fluorescência.</li>
</ol>

<ol><li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+gene+transfer+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).</li>
<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+by+direct+microinjection+of+DNA+into+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells.</a> Cell. 22 (2), Pt 2 479-488 (1980).</li>
<li>Rae, J. L., Levis, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archives%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation.</a> Pflugers Archives: European Journal of Physiology. 443 (4), 664-670 (2002).</li>
<li>Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+microporation+technique+for+the+transfection+of+cultured+CNS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).</li>
<li>Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+of+individual+neurons+using+modified+electrophysiology+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques.</a> Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).</li>
<li>Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+small+interfering+RNA+by+single-cell+electroporation+in+cerebellar+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).</li>
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<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robot+for+high+yield+electrophysiology+and+morphology+of+single+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo.</a> Nature Communication. 8, 15604(2017).</li>
<li>Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+manipulation+in+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell manipulation in brain tissue.</a> PLoS One. 7 (4), 35603(2012).</li>
<li>Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+method+for+single-cell+electroporation+in+mouse+organotypic+hippocampal+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture.</a> Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632(2020).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li>
<li>Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+synaptic+scaling+induced+by+changes+in+postsynaptic+firing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing.</a> Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+on+microchips%3A+the+harmful+effects+of+pH+changes+and+scaling+down%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down.</a> Science Reports. 5, 17817(2015).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li>
<li>Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+manipulate+the+fate+of+single+neural+stem+cells+in+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue.</a> Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+microinjection+technology+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Single-cell microinjection technology in cell biology.</a> Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).</li>
<li>De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+rat+CA1+neurones+in+acute+versus+organotypic+slices%3A+role+of+experience+in+synaptic+morphology+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity.</a> Journal of Physiology. 550, Pt 1 135-147 (2003).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

Descrevemos aqui um método de eletroporação que transfecta neurônios excitatórios e inibitórios com alta eficiência e precisão. Nosso protocolo de eletroporação otimizado tem três avanços inovadores para alcançar transfecção genética altamente eficiente. Nossa primeira modificação foi aumentar o tamanho da pipeta em comparação com os protocolos publicados anteriormente3,5,6. Essa mudança nos permitiu eletroporar muitos neurônios...

Na biologia molecular, uma das considerações mais importantes para um pesquisador é como entregar um gene de interesse em uma célula ou população de células para elucidar sua função. Os diferentes métodos de parto podem ser categorizados como biológicos (por exemplo, um vetor viral), químicos (por exemplo, fosfato de cálcio ou lipídico) ou físicos (por exemplo, eletroporação, microinjeção ou biolística)1,2. Os métodos biológicos são altamente eficientes e podem ser específicos do tipo celular, mas são limitados pelo desenvolvimento de ferramentas genéticas específicas. Abordagens químicas são muito poderosas in vitro, mas transfecções são geralmente aleatórias; além disso, essas abordagens são principalmente reservadas apenas para células primárias. Das abordagens físicas, a biolística é a mais simples e fácil do ponto de vista técnico, mas novamente produz resultados aleatórios de transfecção com uma eficiência relativamente baixa. Para aplicações que requerem transferência para células específicas sem a necessidade de desenvolver ferramentas genéticas, buscamos eletroporação unicelular3,4.
Considerando que a eletroporação usada para se referir apenas à eletroporação de campo, nos últimos vinte anos, vários protocolos de eletroporação unicelular in vitro e in vivo foram desenvolvidos para melhorar a especificidade e eficiência5,6,7, demonstrando que a eletroporação pode ser usada para transferir genes para células individuais e pode, portanto, ser extremamente precisa. No entanto, os procedimentos são tecnicamente exigentes, demorados e relativamente ineficientes. De fato, trabalhos mais recentes têm investigado a viabilidade das plataformas de eletroporação mecanizadas8,9, que podem ajudar a eliminar várias dessas barreiras para pesquisadores interessados em instalar tal robótica. Mas para aqueles que procuram meios mais simples, os problemas com eletroporação, ou seja, morte celular, falha de transfecção e entupimento de pipetas, permanecem uma preocupação.
Recentemente desenvolvemos um método de eletroporação que usa pipetas de vidro de ponta maior, parâmetros de pulso elétrico mais suaves e uma etapa de ciclismo de pressão única, que gerou uma eficiência de transfeção muito maior em neurônios excitatórios do que os métodos anteriores, e nos permitiu pela primeira vez transfectar genes em interneurônios inibitórios, incluindo interneurônios inibidores expressivos na região hipocampal ca1 da cultura organotipica do rato10. No entanto, a confiabilidade deste método de eletroporação em diferentes tipos inibitórios e estágios de desenvolvimento neuronal não foi abordada. Aqui, demonstramos que essa técnica de eletroporação é capaz de transfetar genes tanto em neurônios excitatórios quanto em diferentes classes de interneurônios. É importante ressaltar que a eficiência da transfecção foi alta independentemente dos dias in vitro (DIV) da idade da cultura da fatia testada. Esta técnica estabelecida e fácil de usar é altamente recomendada para qualquer investigador interessado em usar eletroporação unicelular para diferentes tipos de células no contexto do tecido cerebral in vitro do rato.

<table><tbody><tr><td><forte>Preparação de plasmídeo</forte>Kit de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>purificação de plasmídeo</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Preparação de cultura de fatias organotípicas</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 Placas de poços</td><td>PINÇA</td><td></td> GREINER BIO-ONE 657160 <td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45</td><td>FST</td><td>#5/45</td><td>Pinça de dissecção angular para preparação de cultura de fatias organotípicas</td></tr><tr><td>Unidade de Filtro de Frasco</td><td>Millipore</td><td></td><td>SCHVU02RE Filtração e armazenamento de meios de cultura</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Aglutinante</td><td>BD C150-UL</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>10180</td><td>Picador de tecidos para preparação de cultura de fatias organotípicas</td></tr><tr><td>Inserto de cultura de células Millicell, 30 mm</td><td>Millipore</td><td>PIHP03050</td><td>Insertos de cultura de fatias organotípicas</td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>Precision Systems</td><td>OSMETTE II</td><td></td></tr><tr><td>ESPÁTULAS REVESTIDAS COM PTFE</td><td>Cole-Parmer</td><td>SK-06369-11</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>FST</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscópio</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Filtração a Vácuo Estéril</td><td>Millipore</td><td>SCGPT01RE</td><td>Filtração e armazenamento de aCSF</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Preparação de eletrodos</td>Capilares Extrator de Micropipetter 640796 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Warner</td></tr><tr><td>Instruments</td><td> Instrumento</td><td>P-1000</td><td>Extrator</td></tr><tr><td>Forno</td><td>Fichário</td><td>BD (E2)</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de filamento</td><td>Sutter Instrumento</td><td>FB330B</td><td>Extrator</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Eletroporação de célula única e imagem de fluorescência #1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5 mm Falcon Petri Plates</td><td>BD Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Airtable</td><td>TMC</td><td>63-7512E</td><td></td></tr><tr><td>Câmera CCD</td><td>Q Imaging</td><td>Retiga-2000DC</td><td></td></tr><tr><td>Câmera Sistema de Eletroporação</td><td>Dispositivos Moleculares</td><td>Axoporator 800A</td><td>Eletroporador</td></tr><tr><td>Sistema de Iluminação de Fluorescência</td><td>Prior Lumen</td><td>200</td><td></td></tr><tr><td>Manipulador</td><td>Sutter Instrumento</td><td>MPC-385</td><td></td></tr><tr><td>Metamorfo software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Aquisição de imagens</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Rainin</td><td>Dynamax, RP-2</td><td>Bomba de perfusão</td></tr><tr><td>Mesa móvel</td><td>Luigs & Alto-falante Neuman</td><td>240 XY</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Desconhecido</td><td></td><td>Alto-falantes conectados ao eletroporador</td></tr><tr><td>Microscópio Estéreo</td><td>Olympus</td><td>SZ30</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de Mesa</td><td>Thermo Scientific</td><td>MIDI 40</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Vertical</td><td>Olympus</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence imagem #2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>All-in-One microscópio de fluorescência</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr></tbody></table>

eletroporação unicelular em diferentes culturas organotipápicas de neurônios inibitórios hipocampais e inibidores específicos de classe

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

A eletroporação estabeleceu-se como um método crítico para transferir genes específicos para as células para entender sua função. Aqui, descrevemos uma técnica de eletroporação unicelular que maximiza a eficiência (~80%) da transfesão genética in vitro em neurônios inibitórios excitatórios e específicos de classe na cultura de fatia hipocampal organotipada do camundongo. Usando grandes eletrodos de vidro, fluido cerebrospinal artificial contendo tetrodotoxina e pulsos elétricos leves, entregamos um gene de interesse em neurônios piramimatais de CA1 hipocampal e interneurônios inibitórios. Além disso, a eletroporação poderia ser realizada em fatias hipocampais cultivadas até 21 dias in vitro sem redução na eficiência da transfecção, permitindo o estudo de diferentes estágios de desenvolvimento da cultura de fatias. Com o interesse crescente em examinar as funções moleculares dos genes em uma variedade diversificada de tipos celulares, nosso método demonstra uma abordagem confiável e direta para a transfecção genética in vitro no tecido cerebral do camundongo que pode ser realizada com equipamentos e técnicas de eletrofisiologia existentes.

Nossa eletroporação unicelular é capaz de fornecer genes precisamente em neurônios excitatórios e inibitórios visualmente identificados. Eletroporamos três tipos diferentes de células neuronais em três pontos de tempo diferentes. Linhas de glutamato parvalbumin (Pv) ou glutamato vesicular tipo 3 (VGT3) expressando neurônios foram visualizados cruzando linhas decre Pv (JAX #008069) ou VGT3cre (JAX #018147) com linhas repórter TdTomato (uma variante de proteína fluorescente vermelha) (Jax #007905), re...

Apresentado aqui é um protocolo para eletroporação unicelular que pode fornecer genes em neurônios excitatórios e inibitórios em uma gama de idades in vitro de cultura de fatias hipocampais. Nossa abordagem fornece uma expressão precisa e eficiente de genes em células individuais, que podem ser usadas para examinar funções células autônomas e intercelulares.

Eletroporação unicelular em diferentes culturas organotipápicas de neurônios inibitórios hipocampais e inibidores específicos de classe

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...

A transfecção de genes é uma abordagem vital para estudos de neurobiologia. Nossa técnica de eletroporação nos permite transfectar genes de interesse interneurônios em cultura de fatias de hipocampo organotípicas sem efeitos colaterais detectáveis. Este protocolo tem uma eficiência de transfecção muito maior em comparação com outros protocolos de célula única, mas ainda é relativamente barato e simples de executar.Esta técnica será útil para pesquisadores interessados em entender funções moleculares e fisiológicas específicas dos neurônios, incluindo mecanismos autônomos celulares e interações proteicas transsinápticas. Para preparar culturas de fatias para eletroporação, transfira as inserções de cultura de interesse para placas de Petri individuais de três centímetros carregadas com 900 microlitros de meio de cultura e coloque as culturas em uma incubadora de dióxido de carbono de mesa. Em seguida, pré-incube as pastilhas de cultura fresca com um mililitro de meio de cultura por pastilha em uma placa de Petri de 3,5 centímetros por pelo menos 30 minutos e esterilize as linhas do equipamento de eletroporação com alvejante a 10% por cinco minutos.No final da perfusão, enxágue as linhas com água ionizada autoclavada por pelo menos 30 minutos antes de perfundir com filtro de ACSF esterilizado contendo 0,001 milimolar tetrodotoxina. Defina o pulso do eletroporador para uma amplitude de menos cinco volts, um pulso quadrado, um trem de 500 milissegundos, uma frequência de 50 hertz e uma largura de pulso de 500 microssegundos. Encha uma pipeta de vidro com cinco microlitros de solução interna contendo plasmídeo e bata suavemente na ponta várias vezes para remover quaisquer bolhas presas.Use um microscópio de dissecção para confirmar se a ponta não está danificada e prenda firmemente a ponta da pipeta ao eletrodo. Quando a ponteira entrar em contato com o ACSF, registre a leitura da resistência da pipeta do eletroporador. Para isolar uma cultura de fatias, corte a membrana do inserto de cultura com uma lâmina afiada e use uma pinça de ângulo afiado para transferir cuidadosamente a cultura de fatias para a câmara de eletroporação.Em seguida, fixe a posição da cultura com uma âncora de fatia. Para eletroporação das células de interesse, aplique pressão positiva na pipeta por via oral e use os controles tridimensionais do botão para manobrar a ponta da pipeta para perto da superfície da cultura de fatias. Visualizando a cultura com o microscópio, aproxime-se da célula-alvo com a ponta, mantendo a pressão positiva aplicada até que uma covinha se forme na superfície da célula.Após a visualização da covinha, aplique rapidamente uma leve pressão negativa por via oral para que uma vedação solta se forme entre a ponta da pipeta e a membrana plasmática. A membrana entrará ligeiramente na pipeta. Deve-se observar um aumento de aproximadamente 2,5x na resistência inicial da pipeta, conforme indicado pelo aumento do tom dos alto-falantes.Reaplique rapidamente a pressão positiva para que a covinha se reforme. Em seguida, complete imediatamente pelo menos mais dois ciclos de pressão, conforme demonstrado, sem pausa. Após o último pulso de pressão, mantenha a pressão negativa por um segundo.Quando o tom dos alto-falantes atingir um ápice estável no tom, use o pedal para pulsar rapidamente o eletroporador. Após a eletroporação, retraia suavemente a pipeta aproximadamente 100 mícrons da célula sem aplicar pressão e reaplique a pressão positiva, verificando se a resistência é semelhante à leitura da linha de base antes de se aproximar da próxima célula. Quando todas as células de interesse tiverem sido eletroporadas, transfira a cultura de fatias para uma das pastilhas de cultura fresca preparadas e coloque a pastilha a 35 graus Celsius por até três dias.Neste experimento representativo, o EGFP foi transfectado em cinco a 20 neurônios piramidais na área CA1 do hipocampo ao longo de sete, 14 e 21 dias de idade de cultura in vitro. A parvalbumina e os interneurônios vesiculares do glutamato tipo 3 também podem ser eletroporados com sucesso dentro da área CA1 do hipocampo. Curiosamente, a transfecção não é significativamente afetada pela idade da cultura em fatias in vitro do dia e não difere com a eficiência de transfecção observada em neurônios piramidais CA1.Os neurônios são muito frágeis. Você deve ser extremamente cauteloso e gentil ao se aproximar e fazer um ciclo de pressão nas células e retrair a ponta da pipeta para causar sérios danos. Após a eletroporação, as células podem ser submetidas a várias análises experimentais, incluindo eletrofisiologia e imagem.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós descrevemos um método para preparar organotípicas fatias do hipocampo que pode ser facilmente adaptado a outras regiões do cérebro. Fatias de cérebro são colocadas em membranas porosas e meios de cultura está autorizado a formar uma interface. Este método preserva a arquitetura bruta do hipocampo para até duas semanas em cultura.

Organotípicas Hippocampal Culturas Slice

Este é um protocolo para preparar e manter uma preparação fatia neocortical na cultura organotípicas com a finalidade de fazer gravações elétrica de neurônios piramidais.

Gravação de células inteiras a partir de uma preparação Slice organotípicas de Neocortex

Para realizar uma avaliação rápida da função de genes no desenvolvimento de córtex cerebral, que descrevem métodos que envolvem...

Métodos de Estudo da morfogênese neuronal:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Eletroporação RNAi no Cortex Cerebral Murina embrionárias

Fonte: Keener, D. G., et al. Eletroporação de célula única em diferentes culturas de fatias organotípicas de neurônios excitatórios do hipocampo de camundongos e inibitórios específicos de classe. J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demonstra o processo de eletroporação de célula única para introduzir DNA de plasmídeo em neurônios dentro de culturas de fatias de hipocampo de camundongos. O procedimento envolve posicionamento preciso da pipeta, ajustes de pressão e pulsos de eletroporação para...

Expressão gênica via eletroporação de célula única em culturas de fatias de hipocampo de camundongos

Este vídeo demonstra o protocolo para eletroporação de genes de célula única em neurônios excitatórios e inibitórios em uma variedade de culturas de fatias de hipocampo in vitro. A técnica é útil para examinar funções moleculares e fisiológicas específicas dos neurônios, incluindo mecanismos autônomos celulares e interações de proteínas transsinápticas.

Eletroporação de célula única em culturas organotípicas de fatias cerebrais: uma técnica in vitro para entregar plasmídeos dentro de neurônios-alvo em fatias cerebrais do hipocampo

O vídeo demonstra um protocolo para estudar interações sinápticas e respostas neuronais em uma fatia de cérebro de hipocampo de camundongo transfectado. Envolve iluminar neurônios sensoriais de longo alcance para desencadear potenciais de ação e registrar os potenciais pós-sinápticos excitatórios resultantes no neurônio registrado usando a técnica de patch-clamp de célula inteira.

Fotoestimulação e gravações de grampo de remendo de células inteiras de neurônios em fatias de hipocampo de camundongos

As gravações de pares são gravações simultâneas de grampo de patch de células inteiras de dois neurônios sinapticamente conectados, permitindo a caracterização eletrofisiológica e farmacológica precisa das sinapses entre neurônios individuais. Aqui descrevemos a metodologia detalhada e os requisitos para estabelecer esta técnica em culturas de fatias organotípicas do hipocampo em qualquer laboratório equipado para eletrofisiologia.

Emparelhados Recordings células inteiras em organotï¿½icas fatias do hipocampo

Aqui apresentamos um protocolo que fornece uma ferramenta para examinar mecanismos regulatórios de genes específicos durante o desenvolvimento do hipocampo. O emprego de eletroporação ex utero e cultura de fatias organotípicas permite a regulação positiva e descendente da expressão de genes de interesse em células individuais e segue seu destino durante o desenvolvimento.

Ex Utero Eletroporação e Organotípicas Cultura Slice of Mouse Hippocampal Tissue

Este manuscrito fornece protocolos que usam in utero eletroporação (IUE) para descrever a conectividade estrutural dos neurônios no nível de uma única célula e a excitabilidade dos neurônios marcados com fluorescência. A histologia é utilizado para caracterizar dendrítica e projecções axonais. a gravação de célula inteira em fatias agudas é usado para investigar a excitabilidade.

In Utero Eletroporação Abordagens para estudar a excitabilidade neuronal subpopulações e Conectividade uma única célula

Este protocolo fornece instruções para a observação direta de neurônios corticais que migram radialmente. A eletroporação in utero , a cultura de fatia organotípica e a imagem confocal de lapso de tempo são combinadas para estudar de forma direta e dinâmica os efeitos da sobre-expressão ou downregulation de genes de interesse em neurônios migratórios e analisar sua diferenciação durante o desenvolvimento.

Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando<em&gt; Em Utero</em&gt; Electroporação

Aqui, nós fornecemos um método confiável e de baixo custo para gerar electroporated culturas do cérebro organotypic fatia de embriões do rato apropriados para microscopia confocal e técnicas de geração de imagens ao vivo.

Ex Utero Eletroporação e culturas Organotypic fatia do cérebro embrionário Mouse para imagens ao vivo de migração gabaérgica interneurônios

Aprenda a técnica de eletroporação unicelular para transfecção gênica em culturas organotípicas de hipocampo. Este método eficiente permite estudar funções moleculares e fisiológicas de neurônios excitatórios e inibitórios.

Eletroporação unicelular em diferentes culturas organotipápicas de neurônios inibitórios hipocampais e inibidores específicos de classe (Vídeo) | JoVE Journal

Eletroporação unicelular em diferentes culturas organotipápicas de neurônios inibitórios hipocampais e inibidores específicos de classe

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