Eletroporação unicelular em diferentes culturas organotipápicas de neurônios inibitórios hipocampais e inibidores específicos de classe
6 de outubro de 2020
Apresentado aqui é um protocolo para eletroporação unicelular que pode fornecer genes em neurônios excitatórios e inibitórios em uma gama de idades in vitro de cultura de fatias hipocampais. Nossa abordagem fornece uma expressão precisa e eficiente de genes em células individuais, que podem ser usadas para examinar funções células autônomas e intercelulares.
A transfecção de genes é uma abordagem vital para estudos de neurobiologia. Nossa técnica de eletroporação nos permite transfectar genes de interesse interneurônios em cultura de fatias de hipocampo organotípicas sem efeitos colaterais detectáveis. Este protocolo tem uma eficiência de transfecção muito maior em comparação com outros protocolos de célula única, mas ainda é relativamente barato e simples de executar.
Esta técnica será útil para pesquisadores interessados em entender funções moleculares e fisiológicas específicas dos neurônios, incluindo mecanismos autônomos celulares e interações proteicas transsinápticas. Para preparar culturas de fatias para eletroporação, transfira as inserções de cultura de interesse para placas de Petri individuais de três centímetros carregadas com 900 microlitros de meio de cultura e coloque as culturas em uma incubadora de dióxido de carbono de mesa. Em seguida, pré-incube as pastilhas de cultura fresca com um mililitro de meio de cultura por pastilha em uma placa de Petri de 3,5 centímetros por pelo menos 30 minutos e esterilize as linhas do equipamento de eletroporação com alvejante a 10% por cinco minutos.
No final da perfusão, enxágue as linhas com água ionizada autoclavada por pelo menos 30 minutos antes de perfundir com filtro de ACSF esterilizado contendo 0,001 milimolar tetrodotoxina. Defina o pulso do eletroporador para uma amplitude de menos cinco volts, um pulso quadrado, um trem de 500 milissegundos, uma frequência de 50 hertz e uma largura de pulso de 500 microssegundos. Encha uma pipeta de vidro com cinco microlitros de solução interna contendo plasmídeo e bata suavemente na ponta várias vezes para remover quaisquer bolhas presas.
Use um microscópio de dissecção para confirmar se a ponta não está danificada e prenda firmemente a ponta da pipeta ao eletrodo. Quando a ponteira entrar em contato com o ACSF, registre a leitura da resistência da pipeta do eletroporador. Para isolar uma cultura de fatias, corte a membrana do inserto de cultura com uma lâmina afiada e use uma pinça de ângulo afiado para transferir cuidadosamente a cultura de fatias para a câmara de eletroporação.
Em seguida, fixe a posição da cultura com uma âncora de fatia. Para eletroporação das células de interesse, aplique pressão positiva na pipeta por via oral e use os controles tridimensionais do botão para manobrar a ponta da pipeta para perto da superfície da cultura de fatias. Visualizando a cultura com o microscópio, aproxime-se da célula-alvo com a ponta, mantendo a pressão positiva aplicada até que uma covinha se forme na superfície da célula.
Após a visualização da covinha, aplique rapidamente uma leve pressão negativa por via oral para que uma vedação solta se forme entre a ponta da pipeta e a membrana plasmática. A membrana entrará ligeiramente na pipeta. Deve-se observar um aumento de aproximadamente 2,5x na resistência inicial da pipeta, conforme indicado pelo aumento do tom dos alto-falantes.
Reaplique rapidamente a pressão positiva para que a covinha se reforme. Em seguida, complete imediatamente pelo menos mais dois ciclos de pressão, conforme demonstrado, sem pausa. Após o último pulso de pressão, mantenha a pressão negativa por um segundo.
Quando o tom dos alto-falantes atingir um ápice estável no tom, use o pedal para pulsar rapidamente o eletroporador. Após a eletroporação, retraia suavemente a pipeta aproximadamente 100 mícrons da célula sem aplicar pressão e reaplique a pressão positiva, verificando se a resistência é semelhante à leitura da linha de base antes de se aproximar da próxima célula. Quando todas as células de interesse tiverem sido eletroporadas, transfira a cultura de fatias para uma das pastilhas de cultura fresca preparadas e coloque a pastilha a 35 graus Celsius por até três dias.
Neste experimento representativo, o EGFP foi transfectado em cinco a 20 neurônios piramidais na área CA1 do hipocampo ao longo de sete, 14 e 21 dias de idade de cultura in vitro. A parvalbumina e os interneurônios vesiculares do glutamato tipo 3 também podem ser eletroporados com sucesso dentro da área CA1 do hipocampo. Curiosamente, a transfecção não é significativamente afetada pela idade da cultura em fatias in vitro do dia e não difere com a eficiência de transfecção observada em neurônios piramidais CA1.
Os neurônios são muito frágeis. Você deve ser extremamente cauteloso e gentil ao se aproximar e fazer um ciclo de pressão nas células e retrair a ponta da pipeta para causar sérios danos. Após a eletroporação, as células podem ser submetidas a várias análises experimentais, incluindo eletrofisiologia e imagem.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para eletroporação em única célula que permite a entrega de genes em neurônios excitatórios e inibitórios em culturas de fatias hipocampais organotípicas. Esta técnica possibilita um controle preciso sobre a expressão gênica, facilitando a investigação de mecanismos celularmente autônomos e interações intercelulares em diversos estágios de desenvolvimento.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Transfusão Gênica
- Eletrfisiologia
Contexto
- A transfeção gênica é fundamental para a pesquisa neurobiológica.
- A eletroporação oferece alta eficiência de transfeção com efeitos colaterais mínimos.
- O método é relativamente simples e econômico em comparação com outras técnicas.
- Compreender as funções moleculares e fisiológicas em neurônios é essencial para a neurobiologia.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um método eficaz para transfectar genes em populações neuronais.
- Estudar funções e mecanismos moleculares específicos em neurônios excitatórios e inibitórios.
- Avaliar a eficiência de transfeção em culturas de fatias de diferentes idades.
Métodos Utilizados
- A eletroporação foi realizada em culturas de fatias hipocampais organotípicas.
- Neurônios piramidais e interneurônios foram os principais modelos biológicos utilizados.
- A transfeção foi avaliada em fatias de diferentes idades (7, 14 e 21 dias in vitro).
- Os passos detalhados incluem preparação, técnicas de pipetagem e monitoramento de alterações na resistência.
- Os danos celulares durante o processo foram minimizados por meio de manipulação cuidadosa.
Resultados Principais
- Obteve-se alta eficiência de transfeção gênica em neurônios direcionados, sem diferenças significativas entre as idades dos cultivos de fatias.
- A eletroporação não afetou negativamente a viabilidade, mantendo a integridade celular após a transfeção.
- O método permitiu estudos detalhados sobre respostas fisiológicas e possíveis mecanismos de interação entre neurônios.
- A transfeção bem-sucedida de interneurônios do tipo glutamato vesicular 3 da pars também foi demonstrada.
Conclusões
- Este estudo apresenta um protocolo robusto para transfeção gênica em culturas neuronais, ampliando as capacidades de pesquisa em neurobiologia.
- O método estabelece as bases para investigações adicionais sobre mecanismos neuronais e funções intercelulares.
- Compreender esses processos é essencial para obter insights sobre a plasticidade neuronal e possíveis aplicações terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A eletroporação em cultura de fatias hipocampais organotípicas permite a entrega precisa de genes em neurônios excitatórios e inibitórios, apoiando a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas na descoberta em neurociência. O método fornece alta eficiência de transfeção (~80%) em diferentes estágios de desenvolvimento, permitindo triagens fenotípicas consistentes e o desenvolvimento de ensaios para investigação de vias. Essa abordagem reduz a incerteza biológica nos testes iniciais de hipóteses sobre alvos, possibilitando estudos reprodutíveis e quantitativos de expressão gênica em sistemas neuronais relevantes para doenças.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas em neurônios excitatórios do hipocampo e em neurônios inibitórios de classes específicas.
- Valor Científico: Apoia a validação funcional de alvos ao associar a expressão gênica a respostas fisiológicas em microcircuitos intactos.
- Valor Operacional: Alcança alta eficiência de transfeção sem efeitos colaterais detectáveis, reduzindo a variabilidade experimental.
- Valor Operacional: Funciona em diferentes idades de culturas de fatias (7–21 dias in vitro), permitindo estudos longitudinais do engajamento de alvos.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Valor Científico: Prepara sistemas neuronais validados para ensaios downstream de eletrofisiologia e imageamento.
- Valor Científico: Fornece dados quantitativos com resolução em nível de única célula sobre função gênica e interações proteicas.
- Valor Operacional: Utiliza equipamentos padrão de eletrofisiologia, permitindo integração escalável em fluxos de trabalho existentes.
- Valor Operacional: Mantém a eficiência de transfeção durante períodos prolongados de cultivo, apoiando campanhas de triagem longitudinais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Fornece circuitria hipocampal relevante para doenças, permitindo o estudo de mecanismos-alvo em contextos fisiopatológicos.
- Valor Científico: Permite a avaliação de interações proteicas transsinápticas e mecanismos autônomos celulares.
- Valor Operacional: Facilita a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, mantendo a saúde neuronal após transfeção.
- Valor Operacional: Apoia decisões de avanço com ajuste de risco mediante entrega gênica confiável e repetível em culturas primárias de neurônios.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses sobre alvos até a identificação de compostos iniciais, permitindo a redução de riscos mecanicistas antes da triagem de compostos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias em populações neuronais do hipocampo.
- Triagem: Fornece sistemas prontos para ensaio com transfeção reprodutível e saídas quantitativas para avaliação de compostos.
- Análises: Permite o monitoramento baseado em resistência e leituras eletrofisiológicas para correlacionar expressão gênica com fenótipos funcionais.
- Pesquisa Translacional: Conecta estudos de função gênica à continuidade pré-clínica por meio de transfeção estável em fatias organotípicas.
- Reutilização Empresarial: Aproveita a infraestrutura existente de eletrofisiologia, posicionando o método como uma plataforma reutilizável para validação de alvos neuronais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio de entrega gênica de alta eficiência e baixa toxicidade em neurônios primários.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio de parâmetros de pulso e protocolo de ciclo de pressão consistentes.
- Valor Estratégico: Tomada de decisões mais assertiva sobre avançar ou não avançar, reduzindo a ambiguidade mecanicista no engajamento de alvos neuronais.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco mediante avaliação confiável da função gênica em diferentes classes neuronais e estágios de desenvolvimento.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em eletrofisiologia e manipulação de micropipetas para direcionamento de célula única.
- Depende de eletrodos de vidro, eletroporador e ACSF estéril com tetrodotoxina para a saúde neuronal.
- Necessita padronização das sequências de pulsos de pressão e monitoramento da resistência entre diferentes usuários.
- Considerações de adaptação incluem o ajuste da concentração de plasmídeo e da largura do pulso para diferentes tipos neuronais ou tamanhos de gene.
- Limitação prática: a fragilidade neuronal exige técnica meticulosa para evitar a ruptura da membrana durante os ciclos de pressão.
