Eletroporação unicelular em diferentes culturas organotipápicas de neurônios inibitórios hipocampais e inibidores específicos de classe

Apresentado aqui é um protocolo para eletroporação unicelular que pode fornecer genes em neurônios excitatórios e inibitórios em uma gama de idades in vitro de cultura de fatias hipocampais. Nossa abordagem fornece uma expressão precisa e eficiente de genes em células individuais, que podem ser usadas para examinar funções células autônomas e intercelulares.

A transfecção de genes é uma abordagem vital para estudos de neurobiologia. Nossa técnica de eletroporação nos permite transfectar genes de interesse interneurônios em cultura de fatias de hipocampo organotípicas sem efeitos colaterais detectáveis. Este protocolo tem uma eficiência de transfecção muito maior em comparação com outros protocolos de célula única, mas ainda é relativamente barato e simples de executar.

Esta técnica será útil para pesquisadores interessados em entender funções moleculares e fisiológicas específicas dos neurônios, incluindo mecanismos autônomos celulares e interações proteicas transsinápticas. Para preparar culturas de fatias para eletroporação, transfira as inserções de cultura de interesse para placas de Petri individuais de três centímetros carregadas com 900 microlitros de meio de cultura e coloque as culturas em uma incubadora de dióxido de carbono de mesa. Em seguida, pré-incube as pastilhas de cultura fresca com um mililitro de meio de cultura por pastilha em uma placa de Petri de 3,5 centímetros por pelo menos 30 minutos e esterilize as linhas do equipamento de eletroporação com alvejante a 10% por cinco minutos.

No final da perfusão, enxágue as linhas com água ionizada autoclavada por pelo menos 30 minutos antes de perfundir com filtro de ACSF esterilizado contendo 0,001 milimolar tetrodotoxina. Defina o pulso do eletroporador para uma amplitude de menos cinco volts, um pulso quadrado, um trem de 500 milissegundos, uma frequência de 50 hertz e uma largura de pulso de 500 microssegundos. Encha uma pipeta de vidro com cinco microlitros de solução interna contendo plasmídeo e bata suavemente na ponta várias vezes para remover quaisquer bolhas presas.

Use um microscópio de dissecção para confirmar se a ponta não está danificada e prenda firmemente a ponta da pipeta ao eletrodo. Quando a ponteira entrar em contato com o ACSF, registre a leitura da resistência da pipeta do eletroporador. Para isolar uma cultura de fatias, corte a membrana do inserto de cultura com uma lâmina afiada e use uma pinça de ângulo afiado para transferir cuidadosamente a cultura de fatias para a câmara de eletroporação.

Em seguida, fixe a posição da cultura com uma âncora de fatia. Para eletroporação das células de interesse, aplique pressão positiva na pipeta por via oral e use os controles tridimensionais do botão para manobrar a ponta da pipeta para perto da superfície da cultura de fatias. Visualizando a cultura com o microscópio, aproxime-se da célula-alvo com a ponta, mantendo a pressão positiva aplicada até que uma covinha se forme na superfície da célula.

Após a visualização da covinha, aplique rapidamente uma leve pressão negativa por via oral para que uma vedação solta se forme entre a ponta da pipeta e a membrana plasmática. A membrana entrará ligeiramente na pipeta. Deve-se observar um aumento de aproximadamente 2,5x na resistência inicial da pipeta, conforme indicado pelo aumento do tom dos alto-falantes.

Reaplique rapidamente a pressão positiva para que a covinha se reforme. Em seguida, complete imediatamente pelo menos mais dois ciclos de pressão, conforme demonstrado, sem pausa. Após o último pulso de pressão, mantenha a pressão negativa por um segundo.

Quando o tom dos alto-falantes atingir um ápice estável no tom, use o pedal para pulsar rapidamente o eletroporador. Após a eletroporação, retraia suavemente a pipeta aproximadamente 100 mícrons da célula sem aplicar pressão e reaplique a pressão positiva, verificando se a resistência é semelhante à leitura da linha de base antes de se aproximar da próxima célula. Quando todas as células de interesse tiverem sido eletroporadas, transfira a cultura de fatias para uma das pastilhas de cultura fresca preparadas e coloque a pastilha a 35 graus Celsius por até três dias.

Neste experimento representativo, o EGFP foi transfectado em cinco a 20 neurônios piramidais na área CA1 do hipocampo ao longo de sete, 14 e 21 dias de idade de cultura in vitro. A parvalbumina e os interneurônios vesiculares do glutamato tipo 3 também podem ser eletroporados com sucesso dentro da área CA1 do hipocampo. Curiosamente, a transfecção não é significativamente afetada pela idade da cultura em fatias in vitro do dia e não difere com a eficiência de transfecção observada em neurônios piramidais CA1.

Os neurônios são muito frágeis. Você deve ser extremamente cauteloso e gentil ao se aproximar e fazer um ciclo de pressão nas células e retrair a ponta da pipeta para causar sérios danos. Após a eletroporação, as células podem ser submetidas a várias análises experimentais, incluindo eletrofisiologia e imagem.