Preparação de fatia de cunha in vitro para imitar conectividade do circuito neuronal vivo

Matthew  J. Fischl; Catherine J. C. Weisz

doi:10.3791/61664

É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Preparação de fatia de cunha in vitro para imitar conectividade do circuito neuronal vivo

5.3K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/61664

⸱

18 de agosto de 2020

Matthew J. Fischl¹ , Catherine J. C. Weisz¹

¹Section on Neuronal Circuitry, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, NIH

Neste artigo

Resumo

A integração de diversas entradas sinápticas aos neurônios é melhor medida em uma preparação que preserva todos os núcleos pré-sinápticos para o tempo natural e a plasticidade do circuito, mas as fatias cerebrais normalmente cortam muitas conexões. Desenvolvemos uma fatia cerebral modificada para imitar a atividade do circuito in vivo, mantendo a capacidade de experimentação in vitro.

Resumo

Técnicas de eletrofisiologia de fatias in vitro medem a atividade unicelular com resolução elétrica e temporal precisa. As fatias cerebrais devem ser relativamente finas para visualizar adequadamente e acessar neurônios para fixação de patches ou imagens, e o exame in vitro dos circuitos cerebrais é limitado apenas ao que está fisicamente presente na fatia aguda. Para manter os benefícios da experimentação de fatias in vitro, preservando uma porção maior de núcleos pré-sinápticos, desenvolvemos uma nova preparação de fatias. Esta "fatia de cunha" foi projetada para gravações de eletrofisiologia de grampos para caracterizar as diversas entradas monaurais, orientadas ao som para neurônios olivococlear medial (MOC) no tronco cerebral. Esses neurônios recebem suas entradas excitatórias e inibitórias primárias de neurônios ativados por estímulos no ouvido contralateral e núcleo coclear correspondente (CN). Uma fatia cerebral assimétrica foi projetada que é mais espessa no domínio rostro-caudal na borda lateral de um hemisfério e, em seguida, se inclina em direção à borda lateral do hemisfério oposto. Esta fatia contém, no lado grosso, a raiz nervosa auditiva transmitindo informações sobre estímulos auditivos para o cérebro, os circuitos intrínsecos de CN, e tanto o inibidor excitatório e trissináptico aferentes caminhos que convergem em neurônios MOC contralaterais. A gravação é realizada a partir de neurônios MOC no lado fino da fatia, onde são visualizados usando óptica DIC para experimentos típicos de grampo de remendo. A estimulação direta do nervo auditivo é realizada à medida que entra no tronco cerebral auditivo, permitindo que a atividade intrínseca do circuito CN e a plasticidade sináptica ocorram em sinapses a montante dos neurônios MOC. Com essa técnica, pode-se imitar a ativação do circuito in vivo o mais próximo possível dentro da fatia. Esta preparação de fatia de cunha é aplicável a outros circuitos cerebrais onde as análises de circuitos se beneficiariam da preservação da conectividade upstream e de entradas de longo alcance, em combinação com as vantagens técnicas da fisiologia de fatias in vitro.

Introdução

A observação da atividade dos circuitos neurais é idealmente realizada com entradas sensoriais nativas e feedback, e conectividade intacta entre regiões cerebrais, in vivo. No entanto, a realização de experimentos que dão resolução unicelular da função do circuito neural ainda é limitada por desafios técnicos no cérebro intacto. Enquanto métodos de eletrofisiologia extracelular in vivo ou imagens multifotográficas podem ser usados para investigar a atividade em sistemas nervosos intactos, interpretar como diferentes insumos se integram ou medem entradas sinápticas subestresis permanecem difíceis. Gravações in vivo de células inteiras superam essas limitações, mas são ....