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Artigo de método

Preparação de fatia de cunha in vitro para imitar conectividade do circuito neuronal vivo

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DOI:

10.3791/61664

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18 de agosto de 2020

 , 
1Section on Neuronal Circuitry, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, NIH

Neste artigo

Resumo

A integração de diversas entradas sinápticas aos neurônios é melhor medida em uma preparação que preserva todos os núcleos pré-sinápticos para o tempo natural e a plasticidade do circuito, mas as fatias cerebrais normalmente cortam muitas conexões. Desenvolvemos uma fatia cerebral modificada para imitar a atividade do circuito in vivo, mantendo a capacidade de experimentação in vitro.

Resumo

Técnicas de eletrofisiologia de fatias in vitro medem a atividade unicelular com resolução elétrica e temporal precisa. As fatias cerebrais devem ser relativamente finas para visualizar adequadamente e acessar neurônios para fixação de patches ou imagens, e o exame in vitro dos circuitos cerebrais é limitado apenas ao que está fisicamente presente na fatia aguda. Para manter os benefícios da experimentação de fatias in vitro, preservando uma porção maior de núcleos pré-sinápticos, desenvolvemos uma nova preparação de fatias. Esta "fatia de cunha" foi projetada para gravações de eletrofisiologia de grampos para caracterizar as diversas entradas monaurais, orientadas ao som para neurônios olivococlear medial (MOC) no tronco cerebral. Esses neurônios recebem suas entradas excitatórias e inibitórias primárias de neurônios ativados por estímulos no ouvido contralateral e núcleo coclear correspondente (CN). Uma fatia cerebral assimétrica foi projetada que é mais espessa no domínio rostro-caudal na borda lateral de um hemisfério e, em seguida, se inclina em direção à borda lateral do hemisfério oposto. Esta fatia contém, no lado grosso, a raiz nervosa auditiva transmitindo informações sobre estímulos auditivos para o cérebro, os circuitos intrínsecos de CN, e tanto o inibidor excitatório e trissináptico aferentes caminhos que convergem em neurônios MOC contralaterais. A gravação é realizada a partir de neurônios MOC no lado fino da fatia, onde são visualizados usando óptica DIC para experimentos típicos de grampo de remendo. A estimulação direta do nervo auditivo é realizada à medida que entra no tronco cerebral auditivo, permitindo que a atividade intrínseca do circuito CN e a plasticidade sináptica ocorram em sinapses a montante dos neurônios MOC. Com essa técnica, pode-se imitar a ativação do circuito in vivo o mais próximo possível dentro da fatia. Esta preparação de fatia de cunha é aplicável a outros circuitos cerebrais onde as análises de circuitos se beneficiariam da preservação da conectividade upstream e de entradas de longo alcance, em combinação com as vantagens técnicas da fisiologia de fatias in vitro.

Introdução

A observação da atividade dos circuitos neurais é idealmente realizada com entradas sensoriais nativas e feedback, e conectividade intacta entre regiões cerebrais, in vivo. No entanto, a realização de experimentos que dão resolução unicelular da função do circuito neural ainda é limitada por desafios técnicos no cérebro intacto. Enquanto métodos de eletrofisiologia extracelular in vivo ou imagens multifotográficas podem ser usados para investigar a atividade em sistemas nervosos intactos, interpretar como diferentes insumos se integram ou medem entradas sinápticas subestresis permanecem difíceis. Gravações in vivo de células inteiras superam essas limitações, mas são desafiadoras de realizar, mesmo em regiões cerebrais que são facilmente acessadas. Os desafios técnicos dos experimentos de resolução unicelular são ainda mais amplificados em certas populações de neurônios que estão localizadas nas profundezas do cérebro, ou em populações espacialmente difusas que requerem ferramentas genéticas para localizar células in vivo (por exemplo, expressão genética de channelrhodopsin emparelhada com gravação optrode) ou identificação histoquímica pós-hoc após a gravação do local (por exemplo, com marcadores específicos de neurotransmissão). Estando localizados difusamente perto da superfície ventral do tronco cerebral, os neurônios olivococleares medial (MOC) sofrem das limitações acima1, tornando-os extremamente difíceis de acessar para experimentação in vivo.

As fatias cerebrais (~100-500 μm de espessura) têm sido usadas há muito tempo para estudar circuitos cerebrais, incluindo circuitos de tronco cerebral auditivo, devido à segregação física de neurônios conectados que estão contidos dentro da mesma fatia2,3,4,5,6,7,8,9. Experimentos com fatias muito mais grossas (>1 mm) têm sido empregados em outros laboratórios para entender como os insumos bilaterais se integram em áreas do complexo olivary superior (SOC), incluindo a azeitona superior medial10,11. Estas fatias foram preparadas de tal forma que os axônios do nervo auditivo (AN) permaneceram intactos dentro da fatia e foram eletricamente estimulados a iniciar a liberação de neurotransmissores sinápticos no CN, imitando a atividade dos neurônios auditivos de primeira ordem como eles responderiam ao som. Uma grande desvantagem dessas fatias grossas é a visibilidade dos neurônios para gravações eletrofisiológicas de grampo de remendo ("patching"). A remenda torna-se cada vez mais difícil à medida que os numerosos axônios nesta área tornam-se mieliados com12,13,14,15anos, tornando o tecido opticamente denso e obscurecendo neurônios mesmo em uma típica fatia cerebral fina. Nosso objetivo é criar preparações in vitro que se assemelham mais à conectividade do circuito de gravações in vivo, mas com as habilidades de gravação de alta produtividade e alta resolução da eletrofisiologia de grampos visualmente guiados em fatias cerebrais.

Nosso laboratório investiga a fisiologia dos neurônios do sistema auditivo e diferente, incluindo neurônios MOC. Estes neurônios colinérgicos fornecem feedback eferente à cóclea, modulando a atividade das células ciliares externas (OHCs)16,17,18,19,20. Estudos anteriores mostraram que essa modulação desempenha um papel no controle de ganhos na cóclea21,22,23,24,25,26 e proteção contra trauma acústico27,28,29,30,31,32,33. Em camundongos, os neurônios MOC estão divididos no núcleo ventral do corpo trapezoide (VNTB) no tronco cerebral auditivo1. Nosso grupo utilizou a linha de mouse ChAT-IRES-Cre cruzada com a linha de rato repórter tdTomato para atingir neurônios MOC em fatias de tronco cerebral sob iluminação epifluorescente. Mostramos que os neurônios MOC recebem uma entrada inibitória diferente do núcleo medial ipsilateral do corpo trapezoide (MNTB), que é animado, por sua vez, por axônios de células espessas globulares (GBC) no núcleo coclear contralateral (CN)34,35,36,37,38. Além disso, os neurônios MOC provavelmente recebem sua entrada excitatória de células T-estelares no CN39,40,41. Juntos, esses estudos mostram que os neurônios MOC recebem insumos excitatórios e inibitórios derivados do mesmo ouvido (contralateral). No entanto, os neurônios pré-sinápticos, e seus axônios convergindo em neurônios MOC, não são suficientemente próximos um do outro para estarem totalmente intactos em uma típica preparação de fatias coronais. Para investigar como a integração de entradas sinápticas aos neurônios MOC afeta seus padrões potenciais de ação, com foco na inibição recém-descrita, desenvolvemos uma preparação na qual poderíamos estimular os diversos afferents aos neurônios MOC de um ouvido da maneira mais fisiologicamente realista possível, mas com os benefícios técnicos de experimentos in vitro de fatias cerebrais.

A fatia de cunha é uma preparação de fatia grossa modificada projetada para a investigação da integração do circuito em neurônios MOC (esquematizado na Figura 1A). No lado grosso da fatia, a cunha contém os axônios decepados do nervo auditivo (denominado "raiz nervosa auditiva" daqui em diante) à medida que entram no tronco cerebral da periferia e da sinapse no CN. A raiz nervosa auditiva pode ser estimulada eletricamente para evocar a liberação de neurotransmissores e a ativação sináptica das células do CN42,43,44,45,46. Este formato de estimulação tem vários benefícios para a análise do circuito. Primeiro, em vez de estimular diretamente os axônios T-stellate e GBC que fornecem uma entrada diferente aos neurônios MOC, estimulamos o AN para permitir a ativação de circuitos intrínsecos abundantes no CN. Esses circuitos modulam a saída de neurônios CN para seus alvos em todo o cérebro, incluindo neurônios MOC46,47,48,49,50,51. Em segundo lugar, a ativação polissináptica de circuitos diferentes do AN através do a montante CN dos neurônios MOC permite que um tempo de ativação mais natural e para a plasticidade ocorra nessas sinapses como ocorreriam in vivo durante a estimulação auditiva. Terceiro, podemos variar nossos padrões de estimulação para imitar uma atividade. Finalmente, tanto as projeções monaural excitatórias quanto inibitórias para os neurônios MOC estão intactas na fatia da cunha, e sua integração pode ser medida em um neurônio MOC com a precisão da eletrofisiologia de grampo de remendo. Como um todo, este esquema de ativação fornece um circuito mais intacto para os neurônios MOC em comparação com uma preparação típica de fatia cerebral. Esta fatia de cunha do tronco cerebral também pode ser usada para investigar outras áreas auditivas que recebem insumos inibitórios do MNTB ipsilateral, incluindo a azeitona superior lateral, o núcleo olivary superior e a azeitona superior medial10,11,52,53,54,55,56. Além de nossa preparação específica, este método de corte pode ser usado ou modificado para avaliar outros sistemas com os benefícios de manter a conectividade de entradas de longo alcance e melhorar a visualização de neurônios para uma variedade de técnicas de eletrofisiologia de resolução unicelular ou de imagem.

Este protocolo requer o uso de um estágio ou plataforma vibratome que pode ser inclinado aproximadamente 15°. Aqui usamos um estágio magnético de 2 peças comercialmente disponível onde o "palco" é um disco de metal com um fundo curvo colocado em uma "base de estágio" magnética côncava. O estágio pode então ser deslocado para ajustar o ângulo da fatia. Círculos concêntricos na base do palco são usados para estimar o ângulo de forma reprodutível. O estágio e a base do palco são colocados na câmara de corte, onde a base do estágio magnético também pode ser girada.

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e AVC/Instituto Nacional de Surdez e Outros Transtornos de Comunicação Do Comitê de Cuidado e Uso de Animais.

1. Preparações experimentais

NOTA: Detalhes sobre a preparação de fatias, incluindo solução de corte, temperatura de corte, temperatura de incubação de fatias e aparelhos (etc.) são específicos para a preparação do tronco cerebral realizada neste experimento. Os detalhes da incubação da fatia podem ser alterados por experiência de laboratório.

  1. Prepare soluções internas para fixação de correção.
    1. Prepare a solução de grampo de tensão contendo (em mM) 76 Cs-metanosulfonato, 56 CsCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5 Na2-fosphocreatine, 5 QX-314, e 0,01 Alexa Fluor-488 hydrazide. Ajuste o pH para 7.2 com CsOH.
    2. Prepare a solução de grampo atual contendo (em mM) 125 K-gluconato, 5 KCl, 1 MgCl2, 0.1 CaCl2, 10 HEPES, 1 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na2-phosphocreatine e 0.01 Alexa Fluor-488 hydrazide. Ajuste o pH para 7.2 com KOH.
  2. Prepare 100 mL de 4% de ágar adicionando 4 g de ágar a 100 mL de água quente (perto de ferver). Coloque na placa de mexida aquecida para manter a temperatura e mexa até dissolver completamente. Despeje em pratos de Petri de plástico de 100 mm até aproximadamente 1 cm de profundidade e deixe esfriar. Leve à geladeira até que seja necessário.
  3. Prepare 1 L fluido cerebrospinal artificial (ACSF) contendo em mM: 124 NaCl, 1.2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 5 KCl, 26 NaHCO3, 1.25 KH2PO4, e 10 dextrose. Bolha com carbogen (5% CO2 / 95% O2) por pelo menos 10 min, depois ajuste o pH final para 7,4 com 1 M NaOH se necessário. Mantenha a oxigenação e pH de solução borbulhando continuamente com carbogen durante todo o experimento.
  4. Prepare a solução de fatiamento de 200 mL adicionando ácido kynurenic de 1 mM ao ACSF. Solução sonicate em um banho de água sonicating por 10 minutos até que o ácido kynurnic seja dissolvido. Bolha contínua com carbogen e coloque no gelo.
    ATENÇÃO: Utilize equipamentos de proteção individual adequados ao manusear ácido kynurnic.
  5. Monte uma lâmina apropriada no vibratome seguindo as instruções do fabricante. Frio vibratome cortando câmara cercando-a com gelo.

2. Remoção cerebral com raiz nervosa auditiva intacta para estimulação

NOTA: Os ratos para esses experimentos foram obtidos cruzando camundongos transgênicos ChAT-IRES-Cre em um fundo C57BL/6J com ratos repórteres tdTomato (Ai14). Camundongos usados para histologia e eletrofisiologia foram início pós-audição (P14-P23), que é em torno de P12 em camundongos. Neurônios que expressam tdTomato no núcleo ventral do corpo trapezoid (VNTB) têm sido previamente caracterizados como neurônios MOC nesta linha de camundongos57.

  1. Eutanize (por exemplo, asfixia por CO2) e decapite o animal utilizando procedimentos institucionais aprovados.
  2. Usando uma lâmina de barbear, corte a pele na linha média do crânio do nariz para a parte de trás do pescoço. Descasque a pele para expor o crânio.
  3. Usando uma tesoura pequena, faça uma incisão no crânio através da linha média começando na base (extremidade caudal perto da medula espinhal) do crânio e continuando em direção ao nariz.
  4. Na sutura lambda, faça cortes no crânio a partir da linha média, lateral em direção à orelha em ambos os lados. Descasque o crânio para expor o cérebro.
  5. Começando na extremidade rostral, levante suavemente o cérebro do crânio com uma pequena espátula de laboratório ou fórceps contundentes. Corte o nervo óptico e continue a trabalhar suavemente o cérebro para trás, expondo a superfície ventral.
  6. Corte os nervos trigêmeos beliscando-os com fórceps finos perto da superfície ventral do tronco cerebral.
    NOTA: Faça isso cuidadosamente, pois o nervo vestibulococochlear está logo abaixo disso e precisa estar intacto para uma eventual estimulação.
  7. Coloque a preparação em uma placa de vidro Petri cheia de solução de corte frio. Coloque o prato sob um microscópio dissecando. Bolha suavemente com carbogen.
  8. Corte o nervo facial perto do tronco cerebral e exponha o nervo vestibulocochlear.
  9. Usando fórceps finos, empurre as pontas para a foramina onde o nervo vestibulocochlear sai do crânio o mais longe possível e belisque o nervo para cortá-lo, deixando a raiz nervosa presa ao tronco cerebral. Repita isso do outro lado.
  10. Uma vez que ambas as raízes nervosas estejam livres, remova as meninges e vasculatura da superfície ventral do tronco cerebral perto do corpo trapezoide.
  11. Liberte o cérebro completamente do crânio beliscando os nervos cranianos restantes e o tecido conjuntivo tomando cuidado para preservar a medula espinhal restante, se possível.

3. Bloqueie e monte o cérebro no palco (disco magnético)

  1. Prepare a superfície do cérebro para se fixar no estágio bloqueando o cérebro ao nível do quiasma óptico.
    1. Com a superfície ventral para cima, estabilize o cérebro usando uma ferramenta contundente para imobilizar suavemente a medula espinhal para que o cérebro não se incline durante a etapa seguinte.
    2. Ao nível do quiasmo óptico, use fórceps abertos para criar o plano para bloquear o cérebro inserindo através do cérebro até o fundo do prato. Insira as fórceps em um ângulo de aproximadamente 20° da vertical para que as pontas saiam da superfície dorsal do cérebro caudal para o quiasmo óptico.
    3. Corte ao longo dos fórceps usando a lâmina de barbear.
  2. Cole o cérebro à superfície do palco.
    1. Prepare um pequeno bloco (~1 cm3) de 4% de ágar para suportar o cérebro.
    2. Coloque uma pequena gota de cola no palco e espalhe-a em um retângulo para que o cérebro e o bloco de ágar possam ser colados.
    3. Usando fórceps, levante cuidadosamente o cérebro e dobre suavemente o excesso de líquido usando a borda de uma toalha de papel. Coloque a superfície bloqueada sobre a cola, a superfície ventral será em direção à lâmina durante o corte.
    4. Empurre o bloco de ágar suavemente contra a superfície dorsal do cérebro para apoiá-lo durante o corte e para garantir o posicionamento cerebral adequado (ou seja, ângulo).

4. Corte o cérebro para criar fatia de cunha

NOTA: Prepare uma fatia cerebral usando vibratome que tenha a raiz nervosa coclear no lado grosso e neurônios olivococlear medial (MOC) e o núcleo medial do corpo trapezoide (MNTB) no lado fino.

  1. Coloque o disco magnético com cérebro preso na base do palco e coloque-o na câmara de corte com a superfície ventral do cérebro orientada para a lâmina.
  2. Encha a câmara com solução de corte gelado e bolha com carbogen.
  3. Abaixe a lâmina na solução e corte fatias caudais para a região de interesse para garantir que as fatias sejam simétricas. Se as fatias parecerem assimétricas, incline o palco ligeiramente para obter simetria.
    NOTA: As velocidades da lâmina entre 0,05-0,10 mm/s foram eficazes para cortar fatias saudáveis e podem variar dependendo da idade animal e região cerebral.
  4. Uma vez que as fatias sejam simétricas, mude o palco ~15° (correspondente a aproximadamente 3 anéis concêntricos na base do palco) para um lado.
    NOTA: Desperte o palco da raiz nervosa auditiva que você deseja preservar na fatia.
  5. Continue cortando cuidadosamente até que a raiz nervosa auditiva esteja perto da superfície de um lado, e o nervo facial possa ser visto na superfície do outro lado.
  6. Mude o palco 15° para a posição original.
  7. Mova a lâmina para longe do tecido e gire a base do palco 90° para que a borda lateral do lado fino esteja voltada para a lâmina. Abaixe a lâmina várias centenas de mícrons e, em seguida, lentamente traga a lâmina perto da borda do tecido. Repita isso até que a lâmina toque a borda lateral. Abaixe a lâmina para a espessura desejada da borda fina da fatia, aqui mais 200 mícrons.
    NOTA: A fatia resultante tem idealmente ~300 mm de espessura ao nível do núcleo ventral do corpo trapezoid (VNTB) no lado onde ocorrerá a fixação do patch.
  8. Mova a lâmina para trás do tecido e gire a base do palco para trás para que a superfície ventral esteja voltada para ela.
  9. Faça o corte que designa a superfície rostral da fatia da cunha. Transfira a fatia para um pedaço de papel de interface (1 cm2) superfície caudal para baixo. Mova a fatia para a câmara de incubação ou outro aparelho de incubação adequado para recuperação (30 min a 35 °C).
    NOTA: O nervo facial deve ser visível em ambos os hemisférios da fatia na superfície rostral (ver Figura 1B).

5. Configuração e gravação de eletrofisiologia

  1. Coloque a fatia da cunha na câmara de gravação e fixe a fatia com uma harpa ou sistema estabilizador. Perfunda o tecido continuamente a uma taxa de 7-10 mL/min com ACSF quente (35 °C) borbulhado com carbogen.
  2. Identifique neurônios MOC geneticamente rotulados no VNTB usando epifluorescência com filtros de emissão de 561 nm para gravações de grampos de remendo. Vire fatia se não houver células potencialmente remendáveis.
  3. Usando óptica DIC, concentre-se na raiz nervosa auditiva no lado grosso da fatia e use um micromanipulador para mover o eletrodo estimulante de tungstênio bipolar até a raiz nervosa auditiva e suavemente para a superfície do tecido.
    NOTA: Eletrodos de sucção têm sido usados em experimentos auditivos de estimulação nervosa em outros laboratórios. Eletrodos de vidro de ou métodos de estimulação óptica podem ser empregados se aplicável a outras preparações específicas.
  4. Mova o campo de visão de volta para o VNTB para escolher um neurônio MOC para atingir a eletrofisiologia do grampo de remendo.
  5. Encha uma pipeta de gravação com solução interna apropriada para o experimento proposto.
  6. Remendar e gravar do neurônio MOC na configuração de células inteiras. Compense a capacitância da membrana e a resistência da série, se necessário.
  7. Ajuste a amplitude de estimulação elétrica da raiz nervosa auditiva para obter eventos postsináspticos consistentes no neurônio MOC.
    NOTA: Pode ser necessário mover o eletrodo de estimulação.
  8. Execute protocolos de estimulação adequados para observar correntes sinápticas evocadas em MOC (grampo de tensão) ou padrões potenciais de ação (grampo de corrente).
    NOTA: A preparação da fatia de cunha pode ser usada com quaisquer ferramentas típicas de grampo de remendo, como gravações de remendo soltos, farmacologia, optogenética, imagem de cálcio, neurotransmissor sem corte, etc.

6. Confirmação histológica dos núcleos do tronco cerebral

NOTA: Isso é feito com coloração violeta de cresito, em fatia de cunha fixa e re-seccionada. Este método permite a visualização de núcleos que estão contidos na fatia.

  1. Depois de preparar uma fatia de cunha, submergir fatia em fixação (4% PFA em PBS) durante a noite. Enxágüe a fatia 3x por 10 min em PBS (temperatura ambiente em um shaker), depois coloque em 30% de sacarose na PBS durante a noite a 4 °C para crioprotetor.
  2. Remendo a fatia em um microtome congelante (40-70 mm) e colete seções seriais em uma placa de 24 poços em PBS.
  3. Monte seções em lâminas revestidas de gelatina e deixe secar completamente. Coloque slides no vagão de slides.
  4. Prepare soluções violetas de cresyl
    1. Prepare acetato violeta de 1% de cresílico misturando acetato violeta de 5 g em 500 mL dH2O
    2. Prepare o tampão de acetato preparando pela primeira vez a solução A de 90 mL (ácido acético glacial de 540 mL + 89,46 mL dH2O) e 10 mL solução B (acetato de sódio de 136 mg em 10 mL dH2O). Combine a solução A e a solução B que produz o tampão de acetato.
    3. Combine 1% de acetato violeta de crestil com o tampão de acetato 1:1 para 0,5% de violeta de crestil no tampão de acetato. Filtrar antes de usar.
    4. Prepare 95% e 70% de etanol diluindo 100% etanol com volumes apropriados de dH2O
  5. Execute o protocolo de coloração violeta cresyl. Mova o carro de slides através de bandejas de solução, manchando a solução em excesso em uma toalha de papel entre as bandejas: xileno – 5 min; 95% etanol – 3 min; 70% etanol – 3 min; dH2O – 3 min; Solução violeta de 0,5% cresyl – monitoramento de 8 a 14 min com frequência até que a coloração nuclear fique roxa escura; dH2O – 3 min; 70% etanol – 3 min; 95% etanol – 1-2 min; 100% etanol – deslizamentos de mergulho duas vezes; xileno – 5 min; xileno: 25 min até que a montagem seja realizada.
    ATENÇÃO: Use xileno apenas sob um capô de fumaça.
  6. Remova slides do xileno um de cada vez e coloque imediatamente os deslizamentos de cobertura em slides usando meio de montagem. Permitir a montagem de meio a seco (durante a noite).
  7. Seções de imagem.

7. Rotulagem de biocittina para rastreamento anterograde de axônios em tecido vivo e não fixado

  1. Prepare uma fatia de cunha como acima (Passos 2-4).
  2. Transfira a fatia para papel de interface (~1 cm2). Sob um microscópio dissecando, localize o CN no lado grosso da fatia.
  3. Remova cuidadosamente o excesso de ACSF da área ao redor da fatia torcendo um canto de um papel de tecido para retirar o ACSF do tecido. Isso evita que a biocittina se espalhe para áreas circundantes da fatia que poderiam levar à absorção em células fora do CN.
  4. Com fórceps finos, selecione um pequeno cristal de biocitna e coloque-o na superfície do CN. Pressione suavemente o cristal no tecido para promover o contato com os neurônios e posterior absorção em somata. Repita esta etapa para cobrir a região de interesse desejada, neste caso regiões CN contendo neurônios T-stellate e GBC.
  5. Coloque a fatia em uma câmara de incubação. Deixe a fatia incubar por 2-4 h a 35 °C para permitir a absorção e o transporte da biocittina. Após a incubação, enxágue a fatia em ACSF para remover quaisquer partículas de biocittina.
  6. Coloque a fatia em fixação (4% PFA em PBS) durante a noite. Enxágüe 3x por 10 min em PBS.
  7. Corte crioproteto em 30% de sacarose em PBS durante a noite a 4 °C ou até que a fatia afunde.
  8. Ressectar o tecido para produzir seções transversais em um microtome congelante a 70-100 mm.
  9. Tecido de processo usando métodos imunohistoquímicos padrão com um streptavidin fluorescentemente conjugado.
    NOTA: A imunohistoquímica adicional pode ser realizada nas seções se útil para rotular corpos de células pré-sinápticas, axônios, receptores ou outras moléculas sinápticas importantes para a visualização do circuito (ou seja, as etapas primárias de anticorpos não devem afetar negativamente a visualização secundária da biocittina).
  10. Imagem do tecido.

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Resultados

Exame histológico da fatia de cunha
Para nossa investigação da função auditiva do neurônio brainstem, a preparação da fatia de cunha foi projetada para conter a raiz nervosa auditiva e o contralateral CN aos neurônios MOC destinados às gravações (exemplo de fatia mostrada na Figura 1B). O exame histológico inicial da preparação é importante para confirmar que a fatia contém os núcleos necessários para a ativação do circuito e que as projeções axonais estão intactas. Dois ...

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Discussão

O procedimento de corte descrito aqui chamado de fatia de cunha é poderoso para manter circuitos neuronais pré-sinápticos intactos, mas com a acessibilidade da experimentação de fatias cerebrais para análise da função neuronal. Deve-se tomar muito cuidado em várias etapas iniciais, a fim de maximizar a utilidade da preparação para a análise do circuito. As dimensões da cunha devem ser confirmadas por meio do exame histológico, que é essencial para a confirmação de que tanto os núcleos pré-sinápticos quanto suas projeções...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramuros do NIH, NIDCD, Z01 DC0000091 (CJCW).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Preparações experimentais
Agar, póFisher ScientificBP1423500bloco de ágar 4% usado para estabilizar o tecido cerebral durante a seccionamento do vibratomo
AlexaFluor Hydrazide 488InvitrogenA10436Fluoróforo usado em solução interna para confirmar o sucesso do patch de neurônio MOC
Analytical BalanceGeneses Scientific (Intramalls)AV114Produtos químicos de pesagem
Lâmina de barbear de dois gumesTed Pella121-6Lâmina de corte Vibratome
Ácido quinurênico (5g)Sigma AldrichK3375-5GFatiamento Aditivo ACSF usado para reduzir a atividade dos neurônios durante a dissecção e fatiamento, a fim de melhorar a saúde do tecido para fixação de remendos
Medidor de pH FisherScientific (Intramalls)13-620-451Testador de pH de solução
Placas de Petri de plástico 100mm de diâmetro X 20mmFisher Scientific (Intramalls)12-556-0024% Preparação de Ágar
Agitando Placa QuenteFisher Scientific (Intramalls)11-500-150Aquecimento para 4% Preparação
Dissecção e Fatiamento
BiocytinSigma AldrichB4261-250MGProduto químico usado para rastreamento axonal (conjugado com Streptavidin 488)
Microscópio de dissecaçãoAmscopeSM-1BNPara dissecção de precisão durante a remoção do cérebro
Dumont # 5 FórcepsFine Science Tools11252-20 Ferramenta dedissecação de fórceps fino
Pinça econômica # 3WPI501976Ferramenta de dissecação de fórceps
Placa de Petri de vidro 150mm diâmetro x 15mm HFisher Scientific (Intramalls)08-747EPrato de dissecação
Papel de interface (203 X 254mm PCTE Membrane 10um)Thomas Scientific1220823Slice incubação/aplicação de biocitina
Leica VT1200S VibratomeLeica1491200S001Vibratome para corte de fatia de cunha seccionamento
Tesoura MayoRobozRS-6872Ferramenta
de dissecaçãoLâminas de aço carbono de um gumeFisher Scientific (Intramalls)12-640Lâmina de barbear para dissecação
Disco de amostra, orientandoLeica14048142068Estágio de vibratomo especializado para inclinação reprodutível
SpoonulaFisherSci14-375-10 Ferramenta dedissecação
Super GlueNewegg15187Usado para colar tecido no estágio
de vibratomoA mola de Vannas Scissorsfine Science Tools91500-09Ferramenta
Electrophysiology
A1R Microscópio Confocal VerticalNikon InstrumentsMicroscópio de eletrofisiologia e imagem, pode ser qualquer microscópio compatível com eletrofisiologia
Eletrodo Vidro borossilicato com filamento OD 1,5 mm, ID 1,1 mm, 10 cm de comprimentoSutter InstrumentBF150-110-10Patch clamping pipeta de vidro
Enchimento de eletrodo MicroFilWPICMF20GPatch eletrodo pipeta filler
Aquecedor de solução em linhaWarner Instruments (GSAdvantage)SH-27BAquecedor do sistema de perfusão de fatias
Sistemas Multi-MicromanipuladoresSutter IntrumentsMPC-200 com micromanipuladores MP285para colocação de patch clamp e eletrodo de estimulação
P-1000 extrator de pipeta horizontal para micropipetas de vidroInstrumentosSutter FG-P1000Patch clamp pipetter
extrator Patch-clamp amplificador e softwareHEKAEPC-10 / Patchmaster NextPode ser qualquer amplificador/software
Câmara de GravaçãoWarner InstrumentsRC26GFatia "banho" durante a gravação
Câmara de Gravação HarpaWarner Instruments640253Estabiliza a fatia durante a gravação de eletrofisiologia
Fatia Câmara de IncubaçãoConstruçãoCâmara de retenção aquecida e oxigenada para fatias durante a recuperação após o corte
Unidade de isolamento de estímuloA.M.P.I.Unidade de isolamento de estímulo Iso-Flexpara eletrofisiologia
Seringa 60CCFischer Scientific (Intramalls)14-820-11Manuseio de fluido de perfusão de eletrofisiologia
Controlador de temperaturaWarner Instruments (GSAdvantage)TC-324C Controlador detemperatura do sistema de perfusão de fatia
Tubulação 1/8 OD 1/16 IDFischer Scientific (Intramalls)14-171-129Manuseio de fluidos de perfusão de eletrofisiologia
Microeletrodo bipolar concêntrico TugstenWPITM33CCINSEletrodo estimulante para eletrofisiologia
Histologia
24 poço PlacaFisher Scientific (Intramalls)12-556006Histologia coleta de fatias e imunocoloração
Alexa Fluor 488 StreptavidinJackson Immuno labs016-540-084Anticorpo secundário para visualização de biocitina
Corning Orbital ShakerSigmaCLS6780FPShaker para agitação imuno-histoquímica
Acetato de violeta CresylSigma Aldrich (Intramalls)C5042-10GColoração celular para histologia
Lâminas de micrótomo descartáveisFisher Scientific22-210-052Lâmina de micrótomo deslizante
Filtro-seringa Nalgene 4mm Acetato de Celulose 0.2umFisher Scientific (Intramalls)09-740-34AFiltro de seringa para enchimento de pipetas de gravação com solução interna
Fluoromount-G Slide Mounting Medium FisherScientificOB100-01Imunohistoquímica fluorescência montagem de vidro
de coloração com rackFisher Scientific ( Intramalls)08-812Microscópio
deslizante Microm HM450 Micrótomo deslizante Microm HM450histologia
Microscópio de cobertura de vidro: Retângulos 50mm X 24mmFisher Scientific (Intramalls)12-543DHistoquímica slide cover glass
Permount mount mediumFisher ScientificSP15-100Cresyl violet seção de montagem lâminas médias
SuperfrostFisher Scientific22-034980Lâminas de histologia
de ágar de dissecação Personalizada lâmina para

Referências

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