Artigo de método
* These authors contributed equally
Na cultura in vitro do córtex ovariano bovino e o efeito da dieta nutricional passo da escada no microambiente ovariano é apresentado. As peças do córtex ovariano foram cultivadas por sete dias e foram avaliados esteroides, citocinas e fases folículos. O tratamento da dieta Stair-Step teve aumento da esterogênese, resultando na progressão do folículo na cultura.
O desenvolvimento folículo do estágio primordial para o antral é um processo dinâmico dentro do córtex ovariano, que inclui fatores endócrinos e paracrinos de células somáticas e comunicação cumulus cell-oocyte. Pouco se sabe sobre o microambiente ovariano e como as citocinas e esteroides produzidos no meio circundante afetam a progressão ou prisão do folículo. A cultura in vitro do córtex ovariano permite que os folículos se desenvolvam em um ambiente normalizado que permanece apoiado pelo estroma adjacente. Nosso objetivo era determinar o efeito da dieta nutricional stair-step no microambiente ovariano (desenvolvimento de folículos, esteroides e citocinas) através da cultura in vitro do córtex ovariano bovino. Para isso, foram removidas as peças cortical ovarianas das novilhas submetidas a dois esquemas nutricionalmente desenvolvidos nutricionalmente diferentes antes da puberdade: Controle (desenvolvimento nutricional tradicional) e Stair-Step (alimentação e restrição durante o desenvolvimento) que foram cortadas em aproximadamente 0,5-1 mm3 peças. Essas peças foram posteriormente passadas através de uma série de lavagens e posicionadas em uma inserção de cultura tecidual que é colocada em um poço que contém o meio de cultura de Waymouth. O córtex ovariano foi cultivado por 7 dias com mudanças diárias na mídia da cultura. A secção histológica foi realizada para determinar mudanças no estágio folículo antes e depois da cultura para determinar os efeitos da nutrição e do impacto da cultura sem tratamento adicional. O meio de cultura cortex foi agrupado ao longo de dias para medir esteroides, metabólitos de esteroides e citocinas. Havia tendências para o aumento de hormônios esteroides no microambiente ovariano que permitiam a progressão do folículo nas culturas do córtex ovariano Stair-Step versus Control. A técnica de cultura do córtex ovariano permite uma melhor compreensão do microambiente ovariano, e como alterações na secreção endócrina podem afetar a progressão e o crescimento do folículo tanto de tratamentos in vivo quanto in vitro. Este método de cultura também pode ser benéfico para testar potenciais terapêuticas que podem melhorar a progressão do folículo em mulheres para promover a fertilidade.
O córtex ovariano representa a camada externa do ovário onde ocorre o desenvolvimento do folículo1. Folículos primordiais, inicialmente presos em desenvolvimento, serão ativados para se tornarem folículos primários, secundários e, em seguida, folículos antral ou terciários baseados nos insumos paracrino e gonadotropina1,2,3,4. Para entender melhor os processos fisiológicos dentro do ovário, a cultura tecidual pode ser usada como modelo in vitro, permitindo assim que um ambiente controlado realize experimentos. Muitos ....
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Os ovários foram obtidos do Centro de Pesquisa animal de carne dos EUA16. Como ditoanteriormente, 16, todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais de Carne dos EUA (USMARC), de acordo com o guia de Cuidado e Uso de Animais Agrícolas em Pesquisa e Ensino Agrícola. Os ovários foram levados para o Laboratório Reprodutivo da Universidade de Nebraska-Lincoln, onde foram processados e cultivados.
1. Preparação de mídia necessária
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Este procedimento de cultura do córtex bovino pode ser usado para determinar uma grande variedade de dados hormonais, citocinas e histologia de pequenos pedaços do ovário. A coloração, como hematoxilina e eosina (H&E), pode ser usada para determinar a morfologia ovariana através do folículo16,23,31 (Figura 3). Resumidamente, os folículos foram classificados como primordiais, que é um oócito cerc.......
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O benefício da cultura do córtex ovariano in vitro, como descrito neste manuscrito, é que os folículos se desenvolvem em um ambiente normalizado com estroma adjacente ao redor dos folículos. As células somáticas e oócito permanecem intactos, e há comunicação célula-celular apropriada como modelo in vivo. Nosso laboratório descobriu que um sistema de cultura de 7 dias fornece dados representativos de foliculogênese e esteróideogênese para o tratamento do córtex ovariano. Outros protocolos de cultura de tecido ovariano têm.......
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Os autores não têm nada a revelar.
Esta pesquisa foi apoiada pelo Instituto Nacional de Alimentos e Agricultura 2013-67015-20965 para a ASC, Universidade de Nebraska Food for Health Competitive Grants to ASC. O Escotilha do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos concede a 8ª adesão do NEB26-202/W3112 #1011127 à ASC, Hatch-NEB ANHL Accession #1002234 à ASC. Quantitative Life Sciences Initiative Summer Postdoctoral Scholar Support – COVID-19 Award for summer funding for CMS.
Os autores gostariam de estender sua apreciação ao Dr. Robert Cushman, Centro de Pesquisa animal de carne dos EUA, Clay Center, NE para agradecê-lo por fornecer os ovários em uma publicação anterio....
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| #11 Lâmina Scapel | Swann-Morton | Lâmina Escapulhosa | 303 |
| #21 Lâmina Scapel | Swann-Morton | Lâmina Scaple | 307 |
| Corning | 430514 | 0.22 µ m poro para meio filtrante | |
| AbsoluteIDQ Sterol17 Ensaio | Biocrates | Sterol17 Kit | As amostras são enviadas para Biocrates e painéis de esteróides são executados e os resultados são retornados |
| Kit de Dupla Anticorporação Androstenediona RIA | MPBio | 7109202 | RIA para determinar a androstenediona do meio de cultura |
| Bélgica Kit de Ensaio A4 | Fonte DIA | KIP0451 | RIA para determinar androstenediona a partir de meio de cultura |
| Bovine Cytokine Array Q3 | RayBiotech | QAB-CYT-3-1 | Kit de citocinas para determinar citocinas a partir de células de meio de |
| culturaSens Software Standard 1.3 | Olympus | 7790 | Imaging Software |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | Gibco ThermoFisher Scientific | 5150056 | Aditivo ao meio |
| de culturaLeibovitz's L-15 Medium | Gibco ThermoFisher Scientific | 4130039 | Usado para lavagem de tecidos em bancada limpa e no táxi de biossegurança |
| Microscópio | Microscópio de | SZX16 | usado para imagens de peças de cultura de tecidos |
| Câmera de Microscópio | Câmera | Olympus DP71 | usada para imagens de peças de cultura de tecidos |
| Inserções de Cultura de Células Millicell 0.4µ m, 12,mm de diâmetro | Millipore Sigma | PICM01250 | Inserções que permitem que o tecido descanse contra o meio sem ser submerso nele Placa |
| multipoços de 24 poços | Placa | Falcon 353047 | usada para segurar meduim, inserções e tecidos Placa |
| de | Petri Falcon 351007 60 x 15 mm | usada para etapas de lavagem antes da cultura | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS 1X) | Corning | 21-040- CV | Usado para lavagem de tecidos |
| SAS Versão 9.3 | SAS Institute | 9.3 TS1M2 | Software de análise estatística |
| Fatiador de tecidos Thomas Stadie-Riggs | Thomas Scientific | 6727C10 | Cortador de tecidos para preparação de seções finas e uniformes de tecido fresco |
| Waymouth MB 752/1 Medium | Sigma-Aldrich | W1625 | Medium usado para culturas de tecidos |
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