O protocolo aqui apresentado destina-se a demonstrar a ocorrência de interações heterólogas entre proteínas de membrana tipo III residente em Golgi com n- e/ou C-termini expostos citoplasma em células de mamíferos vivos usando a variante mais recente do ensaio de complementação da luciferase dividida.
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Artigo de método
Demonstração de Complexos Heterologos formados por Proteínas de Membrana Tipo III de Golgi-Residente usando Ensaio de Complementação de Luciferase Dividida
Neste artigo
Resumo
Resumo
O objetivo deste protocolo é explorar a aplicabilidade da variante mais recente da complementação da luciferase dividida para demonstrar complexos heterologos formados por transportadores de açúcar nucleotídeos (NSTs). Essas proteínas multitransmembrana residentes em ER e Golgi carregam os açúcares nucleotídeos citoplasmicamente sintetizados através de membranas organelas para fornecer enzimas que mediam a glicosiloção com seus substratos. Os NSTs existem como dimers e/ou oligômeros superiores. Interações heterólogas entre diferentes NSTs também foram relatadas. Para verificar se a técnica é adequada para estudar o fenômeno da heteromerização do NST, testamos-a contra uma combinação dos dois NSTs residentes em Golgi que foram previamente mostrados para associar por vários outros meios. O ensaio de complementação da luciferase parece ser particularmente adequado para estudar interações entre proteínas de membrana residente em Golgi, pois não requer altos níveis de expressão, que muitas vezes desencadeiam a deslocalização da proteína e aumentam o risco de falsos positivos.
Introdução
Este manuscrito descreve um protocolo passo-a-passo para verificar a presença de interações heterólogas entre proteínas de membrana tipo III residentes em Golgi em células humanas transitóriamente transfectadas usando a variante mais recente do ensaio de complementação da luciferase dividida. O procedimento foi mais extensivamente testado contra transportadores de açúcar nucleotídeos (NSTs), mas também conseguimos resultados positivos para outras proteínas de membrana tipo III residentes em Golgi cujas proteínas de membrana N e/ou C-termini estão enfrentando o citoplasma.
Nosso grupo de pesquisa explora o papel dos NSTs na glicosilação de macromoléculas. Os NSTs são proteínas de membrana tipo III residentes em Golgi e/ou ER com n-e C-termini voltados para o lado citoplasmásmico da membrana organellar1. Acredita-se que os NSTs carreguem açúcares ativados por nucleotídeos através de membranas organela para fornecer glicosilatransferases com seus substratos. Os NSTs formam dimers e/ou maiores oligômeros2,3,4,5,6,7,8,9,10. Além disso, também foram relatadas interações heterólogas entre diferentes NSTs. Os NSTs também foram demonstrados para formar complexos com enzimas de glicosilação funcionalmente relacionadas12,13,14. Buscamos uma alternativa à técnica atualmente utilizada, a abordagem FRET baseada em fluorescência (FLIM), para estudar interações de NSTs e proteínas residentes em Golgi, então decidimos testar o ensaio de complementação da luciferase dividida. Permitiu identificar uma nova interação entre um NST e uma enzima de glicosylation funcionalmente relacionada9.
A modificação mais recente do ensaio de complementação da luciferase split, NanoBiT, é utilizada no protocolo aqui apresentado. Ela se baseia na reconstituição da enzima luciferase (por exemplo, NanoLuc) dos dois fragmentos - o grande, denominado como BiT grande ou LgBiT, uma proteína de 17,6 kDa, e o pequeno, composto por apenas 11 aminoácidos, denominados como pequenos BiT ou SmBiT. As duas proteínas de interesse são fundidas com os fragmentos complementares e transitavelmente expressas em uma linha celular humana. Se as duas proteínas de fusão interagirem, uma luminescência é produzida in situ após a adição de um substrato permeável celular. Esses dois fragmentos foram otimizados para que se associem à afinidade mínima, a menos que sejam reunidos por uma interação entre as proteínas de interesse a que se fundem.
Em geral, os métodos baseados em bioluminescência têm algumas vantagens sobre os baseados na fluorescência. Os sinais bioluminescentes têm uma maior relação sinal-ruído porque a luminescência de fundo é insignificante em comparação com o sinal derivado da luciferase16. Em contraste, abordagens baseadas em fluorescência geralmente sofrem de um fundo relativamente alto causado pelo fenômeno da autofluorescência. Além disso, a bioluminescência é menos prejudicial às células analisadas do que a fluorescência, pois no primeiro caso não há necessidade de excitar a amostra. Por essas razões, abordagens bioluminescentes para estudar PPIs in vivo superam os métodos fluorescentes comumente usados como Förster Resonance Energy Transfer (FRET) ou Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC).
Nosso protocolo se baseia em referir a luminescência obtida para a combinação proteica de interesse à luminescência obtida para a combinação de controle. Esta última inclui uma das proteínas testadas que é fundida com um fragmento maior e uma proteína de controle (por exemplo, HaloTag), fundida com um fragmento menor. Esta última é uma proteína de origem bacteriana que não se espera que interaja com nenhuma das proteínas mamíferas. O uso dessa proteína como controle coloca limitações à topologia dos pares de proteínas residentes em Golgi a serem analisados. Uma vez que nas células de mamíferos essa proteína é sintetizada no citoplasma, ambas as proteínas de interesse devem ter pelo menos uma cauda citoplasmática.
Esta abordagem pode ser particularmente útil para a triagem inicial de PPIs. Pode se tornar o método de escolha quando as proteínas de fusão de interesse são expressas em níveis que são simplesmente insuficientes para que outras abordagens sejam aplicadas. Da mesma forma, o ensaio de complementação da luciferase dividido pode ser a melhor opção se as proteínas de interesse forem expressas em níveis elevados, mas isso afeta negativamente sua localização subcelular ou é conhecido por forçar interações não específicas. Como o fragmento menor tem apenas 11 aminoácidos, o ensaio de complementação da luciferase dividido pode ser aplicado ao usar tags maiores é impossível. Por fim, pode ser empregado para confirmar ainda mais os dados obtidos utilizando outras técnicas, como no caso aqui apresentado.
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Protocolo
1. Geração de plasmídeos de expressão
- Examine a topologia da membrana das proteínas de interesse usando uma ferramenta de previsão de topologia.
- Projete a estratégia de clonagem para que os fragmentos maiores e menores enfrentem o citoplasma uma vez que as proteínas de fusão tenham sido inseridas nas membranas golgi. Se, como no caso aqui apresentado, tanto n- quanto C-termini das proteínas de interesse são citoplasmicamente orientados, marque as proteínas de oito maneiras possíveis (ver Figura 1B). Se n ou C-terminus de uma ou ambas as proteínas de interesse forem luminally orientadas, exclua-a da marcação.
- Subclone os genes de interesse em vetores de expressão apropriados (ver Tabela de Materiais) seguindo protocolos de clonagem padrão.
NOTA: O teste de todas as orientações possíveis é recomendado, uma vez que algumas opções de marcação podem não funcionar devido à proximidade insuficiente, orientação subótima ou restrições espaciais.
2. Transfecção transitória da expressão plasmídeos nas células
- Colher a cultura celular hek293T aderente por experimentação e resuspensar as células em um meio de crescimento completo dedicado. Coloque as células (2 x 104/100 μL/bem) em uma placa de fundo claro, lado branco de 96 poços. Ajuste o número total de poços para acomodar todas as combinações e controles testados, incluindo réplicas.
NOTA: Tente usar apenas os 60 poços internos da placa para minimizar as mudanças térmicas e evitar a evaporação durante a noite. O uso de placas revestidas de poli-D-lysina é altamente recomendado, como as indicadas na Tabela de Materiais, caso contrário as células podem se desprender durante as etapas subsequentes de lavagem. - Cultura as células durante a noite em condições padrão (37 °C, 5% CO2).
- No dia seguinte transfectam as células com as combinações desejadas de plasmídeos de expressão obtidos no ponto 1.1.
- Plasmídeos de expressão diluídos em um meio livre de soro (ver Tabela de Materiais) a 6,25 ng/μL para cada construção.
- Adicione o reagente de transfecção à base de lipídio em uma proporção lipídica-DNA apropriada e incubar de acordo com a instrução do fabricante.
- Adicione 8 μL de mistura lipídica:DNA aos poços designados. Misture o conteúdo da placa por rotação suave. Isso resulta na transfecção de ambas as construções de expressão a 50 ng/bem.
- Cultura as células por 20-24 h em condições padrão (37 °C, 5% CO2).
NOTA: A colheita das células por mais tempo pode resultar em níveis mais elevados de expressão proteica de fusão, o que pode promover uma associação não específica entre os fragmentos.
3. Troca média
- No dia seguinte substitua o meio condicionado por 100 μL de um meio livre de soro em cada poço. Certifique-se de que as células não se separaram em troca média.
NOTA: Esta etapa deve ser feita 2-3 h antes da adição da solução de trabalho furimazine. A retirada do soro minimiza o fundo causado pela autoluminescência da furimazina.
4. Preparação da solução de trabalho furimazine
- Pouco antes da medição, misture 1 volume de furimazine com 19 volumes de um tampão de diluição (uma diluição de 20 vezes).
NOTA: O volume total da solução de trabalho furimazine a ser preparada depende do número de poços individuais a serem analisados (a solução de trabalho furimazine é adicionada ao meio de cultura celular em uma proporção de 1:5, portanto, a cada poço previamente preenchido com 100 μL de um meio sem soro 25 μL da solução de trabalho furimazine deve ser adicionado). - Adicione a solução de trabalho furimazine aos poços designados (25 μL/well). Misture suavemente a placa à mão ou usando um agitador orbital (por exemplo, 15 s a 300-500 rpm).
5. Medir a luminescência
- Insira a placa em um leitor de microplaca de luminescência.
- Para experimentos que devem ser realizados a 37 °C equilibre a placa por 10-15 min na temperatura indicada.
- Selecione os poços a serem analisados.
- Leia a luminescência com tempo de integração de 0,3 s. Continue monitorando a luminescência por até 2 h quando necessário.
6. Análise de dados
- Calcular valores médios e desvios padrão para todas as combinações testadas e de controle.
- Analise os dados usando ANOVA unidirecional com várias comparações.
- Calcule os valores de alteração do fold dividindo uma luminescência média obtida para combinações de interesse por uma luminescência média obtida para os controles negativos correspondentes. Avalie os resultados.
NOTA: A abordagem da análise de dados aqui proposta pressupõe que a interação pode ser reivindicada se a luminescência obtida para a combinação testada for estatisticamente significativamente maior do que a luminescência obtida para a combinação de controle correspondente e, ao mesmo tempo, a razão desses dois valores excede 10.
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Resultados
Para obter os dados mais confiáveis nesta abordagem, todas as combinações possíveis devem ser testadas (ver Figura 1). Em paralelo, devem ser incluídos controles positivos e negativos. O controle positivo deve consistir nas duas proteínas que são conhecidas por interagir, das quais uma é fundida com o fragmento maior e a outra é fundida com o fragmento menor. O controle negativo, idealmente, deve consistir nas duas proteínas de membrana tipo III não interagindo marcadas da mesma forma. No en...
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Discussão
Aqui fornecemos um protocolo detalhado que permite a demonstração de complexos heterologos formados entre proteínas de membrana tipo III residente em Golgi, como NSTs, utilizando o ensaio de complementação da luciferase split. A abordagem proposta para análise e interpretação de dados envolve relacionar a luminescência obtida para a combinação proteica de interesse à luminescência obtida para a combinação de controle correspondente, que é composta por uma das proteínas de interesse fundidas com o fragmento maior e a prot...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela concessão nº 2016/23/D/NZ3/01314 do Centro Nacional de Ciência (NCN), Cracóvia, Polônia.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| tripsina-EDTA a 0,25% | |||
| Linha | |||
| BioCoat Poly-D-Lysine 96 poços Branco / Transparente Fundo Plano Microplaca tratada com TC, com tampa | Corning | 356651 | |
| Centrífuga | |||
| de células Suplementos de cultura de células (soro bovino fetal inativado por calor, L-glutamina, penicilina, estreptamicina) | |||
| CO2 incubadora | |||
| Expressão de plasmídeos que codificam proteína(s) de interesse não marcados com fragmentos | |||
| Reagente de transfecção FuGENE HD | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover Microplate Reader (ou um leitor de microplacas de luminescência diferente) | Promega | GM3000 | |
| Meio de crescimento dedicado à linha celular utilizada | |||
| Materiais e reagentes para clonagem molecular padrão (bactérias, polimerase termoestável, enzimas de restrição, DNA ligase, materiais e reagentes para purificação de ácidos nucleicos) | |||
| NanoBiT MCS Starter System | Promega | N2014 | Este kit contém vetores que permitem a marcação das proteínas de interesse com fragmentos de NanoBiT em diferentes orientações, bem como o plasmídeo de controle que codifica a proteína HaloTag fundida com SmBiT e um par de plasmídeos de controle positivo. |
| Sistema de ensaio de células vivas Nano-Glo | Promega | N2011 | Este kit contém furimazina, que é um substrato que permite a detecção da atividade de NanoLuc em células vivas, e um tampão de diluição dedicado. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, sem vermelho de fenol | Gibco | 11058021 | |
| Agitador | |||
| Software para análise de dados (por exemplo, GraphPad Prism) | |||
| Termociclador |
Referências
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