Demonstração de Complexos Heterologos formados por Proteínas de Membrana Tipo III de Golgi-Residente usando Ensaio de Complementação de Luciferase Dividida

Resumo

O protocolo aqui apresentado destina-se a demonstrar a ocorrência de interações heterólogas entre proteínas de membrana tipo III residente em Golgi com n- e/ou C-termini expostos citoplasma em células de mamíferos vivos usando a variante mais recente do ensaio de complementação da luciferase dividida.

Resumo

O objetivo deste protocolo é explorar a aplicabilidade da variante mais recente da complementação da luciferase dividida para demonstrar complexos heterologos formados por transportadores de açúcar nucleotídeos (NSTs). Essas proteínas multitransmembrana residentes em ER e Golgi carregam os açúcares nucleotídeos citoplasmicamente sintetizados através de membranas organelas para fornecer enzimas que mediam a glicosiloção com seus substratos. Os NSTs existem como dimers e/ou oligômeros superiores. Interações heterólogas entre diferentes NSTs também foram relatadas. Para verificar se a técnica é adequada para estudar o fenômeno da heteromerização do NST, testamos-a contra uma combinação dos dois NSTs residentes em Golgi que foram previamente mostrados para associar por vários outros meios. O ensaio de complementação da luciferase parece ser particularmente adequado para estudar interações entre proteínas de membrana residente em Golgi, pois não requer altos níveis de expressão, que muitas vezes desencadeiam a deslocalização da proteína e aumentam o risco de falsos positivos.

Introdução

Este manuscrito descreve um protocolo passo-a-passo para verificar a presença de interações heterólogas entre proteínas de membrana tipo III residentes em Golgi em células humanas transitóriamente transfectadas usando a variante mais recente do ensaio de complementação da luciferase dividida. O procedimento foi mais extensivamente testado contra transportadores de açúcar nucleotídeos (NSTs), mas também conseguimos resultados positivos para outras proteínas de membrana tipo III residentes em Golgi cujas proteínas de membrana N e/ou C-termini estão enfrentando o citoplasma.

Nosso grupo de pesquisa explora o papel dos NSTs na glicosilação de m....

Protocolo

1. Geração de plasmídeos de expressão

1. Examine a topologia da membrana das proteínas de interesse usando uma ferramenta de previsão de topologia.
2. Projete a estratégia de clonagem para que os fragmentos maiores e menores enfrentem o citoplasma uma vez que as proteínas de fusão tenham sido inseridas nas membranas golgi. Se, como no caso aqui apresentado, tanto n- quanto C-termini das proteínas de interesse são citoplasmicamente orientados, marque as proteínas de oito maneiras possíveis (ver Figura 1B). Se n ou C-terminus de uma ou ambas as proteínas de interesse forem luminally orientadas, exclua-a da marcação.
3. ....

Resultados

Para obter os dados mais confiáveis nesta abordagem, todas as combinações possíveis devem ser testadas (ver Figura 1). Em paralelo, devem ser incluídos controles positivos e negativos. O controle positivo deve consistir nas duas proteínas que são conhecidas por interagir, das quais uma é fundida com o fragmento maior e a outra é fundida com o fragmento menor. O controle negativo, idealmente, deve consistir nas duas proteínas de membrana tipo III não interagindo marcadas da mesma forma. No en.......

Discussão

Aqui fornecemos um protocolo detalhado que permite a demonstração de complexos heterologos formados entre proteínas de membrana tipo III residente em Golgi, como NSTs, utilizando o ensaio de complementação da luciferase split. A abordagem proposta para análise e interpretação de dados envolve relacionar a luminescência obtida para a combinação proteica de interesse à luminescência obtida para a combinação de controle correspondente, que é composta por uma das proteínas de interesse fundidas com o fragmento maior e a prot.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
			tripsina-EDTA a 0,25%
Linha
BioCoat Poly-D-Lysine 96 poços Branco / Transparente Fundo Plano Microplaca tratada com TC, com tampa	Corning	356651
Centrífuga
de células Suplementos de cultura de células (soro bovino fetal inativado por calor, L-glutamina, penicilina, estreptamicina)
CO2 incubadora
Expressão de plasmídeos que codificam proteína(s) de interesse não marcados com fragmentos
Reagente de transfecção FuGENE HD	Promega	E2311
GloMax Discover Microplate Reader (ou um leitor de microplacas de luminescência diferente)	Promega	GM3000
Meio de crescimento dedicado à linha celular utilizada
Materiais e reagentes para clonagem molecular padrão (bactérias, polimerase termoestável, enzimas de restrição, DNA ligase, materiais e reagentes para purificação de ácidos nucleicos)
NanoBiT MCS Starter System	Promega	N2014	Este kit contém vetores que permitem a marcação das proteínas de interesse com fragmentos de NanoBiT em diferentes orientações, bem como o plasmídeo de controle que codifica a proteína HaloTag fundida com SmBiT e um par de plasmídeos de controle positivo.
Sistema de ensaio de células vivas Nano-Glo	Promega	N2011	Este kit contém furimazina, que é um substrato que permite a detecção da atividade de NanoLuc em células vivas, e um tampão de diluição dedicado.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, sem vermelho de fenol	Gibco	11058021
Agitador
Software para análise de dados (por exemplo, GraphPad Prism)
Termociclador

Solução de celular de mamíferos aderentede culturade NanoBiTde oribital