Fluorescência de RNA de molécula única in situ hibridização (smFISH) é um método para quantificar com precisão os níveis e a localização de RNAs específicos no nível único celular. Aqui, relatamos nossos protocolos de laboratório validados para processamento de banco molhado, imagem e análise de imagens para quantificação de células únicas de RNAs específicas.
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Artigo de método
Análise celular única de alelos ativos transcricionralmente por peixe de molécula única
Neste artigo
Resumo
Resumo
A transcrição genética é um processo essencial na biologia celular, e permite que as células interpretem e respondam a pistas internas e externas. Os métodos tradicionais de população em massa (Northern blot, PCR e RNAseq) que medem os níveis de mRNA não têm a capacidade de fornecer informações sobre a variação célula-celular nas respostas. A visualização e quantificação de células únicas precisas e allelic é possível através de fluorescência de RNA de molécula única na hibridização situ (smFISH). O RNA-FISH é realizado por RNAs de alvo hibridizado com sondas oligonucleotídeas rotuladas. Estes podem ser imagens em modalidades de rendimento médio/alto e, por meio de pipelines de análise de imagem, fornecem dados quantitativos tanto sobre RNAs maduras quanto nascentes, todos no nível único celular. A fixação, permeabilização, hibridização e medidas de imagem foram otimizadas em laboratório ao longo de muitos anos usando o sistema de modelo descrito aqui, o que resulta em uma análise celular única bem sucedida e robusta da rotulagem smFISH. O principal objetivo com a preparação e processamento da amostra é produzir imagens de alta qualidade caracterizadas por uma alta relação sinal-ruído para reduzir falsos positivos e fornecer dados mais precisos. Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo o pipeline desde a preparação da amostra até a análise de dados em conjunto com sugestões e etapas de otimização para adaptar a amostras específicas.
Introdução
Transcrição genética e tradução são os dois principais processos envolvidos no dogma central da biologia, indo da sequência de DNA para RNA para proteína1. Neste estudo, focamos na produção de RNA mensageiro (mRNA) durante a transcrição. A molécula nascente de RNA inclui introns não codificadores e exons de codificação. Os introns são co-transcriçãoseticamente emendados antes que o mRNA se mova para o citoplasma para tradução nos ribossomos2,3.
Tradicionalmente, a medição do mRNA é realizada em populações a granel de células (centenas a milhões) com ensaios c....
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Protocolo
Para garantir os melhores resultados, a parte de laboratório molhada deste protocolo requer precauções padrão sem RNase em todas as etapas. Por exemplo, o uso de pontas de pipeta filtradas, vasos estéreis e tampões sem RNase é altamente incentivado. O uso de inibidores de RNase, como os complexos ribonucleosídeos vanadyl, também é sugerido, especialmente para RNAs de alvo de baixa abundância.
1. Cultura celular e configuração experimental
- Manter as células cancerígenas de mama mcf-7 aderentes (ATCC #HTB-22) em um frasco de cultura tecidual T75 com fenol-vermelho livre (apenas necessário para experimentos de estimu....
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Resultados
Para analisar as respostas hormonais via smFISH, como exemplo, optou-se pelo modelo receptor de estrogênio (ER) utilizado em ensaios de alto rendimento para determinar a presença de produtos químicos endócrinos em desastres ambientais no contexto de participação no Programa de Pesquisa de Superfundoniehs 7. Neste experimento, as células cancerígenas de mama mcf-7 aderiram foram tratadas com o agonista ER 17β-estradiol (E2, 10 nM) ou veículo (DMSO) durante 24 horas. Conjuntos de sondas separadas es.......
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Discussão
A metodologia smFISH descrita baseia-se nos protocolos publicados anteriormente7,12,14. Neste protocolo, explicamos as etapas críticas que foram otimizadas desde o laboratório molhado (incluindo densidade de semeadura, tempo de fixação, permeabilização e concentração de sondas), até análise de imagens e imagens, fornecendo um pipeline experimental completo para laboratórios interessados em realizar análises celulares únicas da t.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
MAM, FS e MGM são financiados pela NIEHS (Projeto 4, P42ES027704, PI, Rusyn). MAM, FS, RMM, MGM e PKS são suportados pelo Centro GCC de Microscopia Avançada e Informática de Imagem (RP170719) financiado pelo CPRIT. A imagem também é apoiada pelo Núcleo Integrado de Microscopia da Baylor College of Medicine com financiamento do NIH (DK56338, e CA125123), CPRIT (RP150578), Dan L. Duncan Comprehensive Cancer Center e John S. Dunn Gulf Coast Consortium for Chemical Genomics.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | Número CAS 50-28-2 |
| Ambion SSC (20X) Tampone, Rnase-free | ThermoFisher Scientific | AM9770 | |
| Corning DMEM com L-Glutamina e 4,5 g/L de Glicose | Fisher Scientific | MT10017CV | Fabricado pela Invitrogen |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Sem piruvato de sódio |
| Sulfato de Dextrano, Solução Estéril a 50% | Sigma-Aldrich | 3730-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++ | Corning | 21030CV | Fabricado pela Calbiochem |
| Ethanol, 200 Proof (100%) | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353047 | Fabricado pela Decon |
| Laboratories Fetal Soro Bovino (FBS), 500 mL | Fisher Scientific | 50-753-2978 | Fabricado pela Gemini Bio Products |
| GE Healthcare DeltaVision LIVE Microscópio de Deconvolução de Alta Resolução GE | Healthcare | ||
| Hyclone Water, Óleo | de Imersão SH3053802 | Científica Fisher Scientific | |
| 1.516 | GE Healthcare Life Sciences | 29162940 | Fabricado pela GE |
| Solução de L-glutamina | Fisher Scientific | MT25005Cl | Fabricado pela Corning |
| Células MCF-7 | ATCC | HTB-22 | |
| Formamida de Grau Molecular | Promega | PAH5051 | |
| Olympus 60x/1.42 NA Objetivo | Olympus | ||
| Parafilm | Bemis Company, Inc. | 52858-076 | Distribuído pela VWR |
| Paraformaldeído, Solução a 16%, | Microscopia Eletrônica | 15710 | |
| Solução de Penicilina-Estreptomicina | Fisher Scientific | MT3001Cl | Fabricado pela Corning |
| Ribonucleosídeo Vanadyl Complex | VWR | 101229-716 | Fabricado pela New England Biosciences |
| RNase Away | Ambion | 9780 | |
| Piruvato de sódio, 100 mM | Fisher Scientific | 11-360-070 | Fabricado pela Gibco |
| Thermo Scientific Glass Covers, #1.5 | Fisher Scientific | 12-545-81P | |
| Triton X-100, 100 mL | Fisher Scientific | BP151-100 | Fabricado pela Fisher BioReagents |
| Tripsina-EDTA Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| Meio de Montagem Antidesbotamento Vectashield 10 mL | NC9265087 Fisher Scientific | Fabricado pela Vector Laboratories |
Referências
- Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. iGenetics: A Mendelian Approach. , Pearson Education, Inc. 331-352 (2006).
- Darnell, J. E. Variety in the level of gene control in eukaryotic cells. Nature. 297, 365-371 (1982).
- Köhler, A., Hurt, E.
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Reimpressões e permissões
