Artigo de método

Análise celular única de alelos ativos transcricionralmente por peixe de molécula única

DOI:

10.3791/61680

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20 de setembro de 2020

 ,  ,  ,  , 
1GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Cancer Research, Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University, 4Department of Pharmacology and Chemical Biology, Baylor College of Medicine

Neste artigo

Resumo

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Fluorescência de RNA de molécula única in situ hibridização (smFISH) é um método para quantificar com precisão os níveis e a localização de RNAs específicos no nível único celular. Aqui, relatamos nossos protocolos de laboratório validados para processamento de banco molhado, imagem e análise de imagens para quantificação de células únicas de RNAs específicas.

Resumo

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A transcrição genética é um processo essencial na biologia celular, e permite que as células interpretem e respondam a pistas internas e externas. Os métodos tradicionais de população em massa (Northern blot, PCR e RNAseq) que medem os níveis de mRNA não têm a capacidade de fornecer informações sobre a variação célula-celular nas respostas. A visualização e quantificação de células únicas precisas e allelic é possível através de fluorescência de RNA de molécula única na hibridização situ (smFISH). O RNA-FISH é realizado por RNAs de alvo hibridizado com sondas oligonucleotídeas rotuladas. Estes podem ser imagens em modalidades de rendimento médio/alto e, por meio de pipelines de análise de imagem, fornecem dados quantitativos tanto sobre RNAs maduras quanto nascentes, todos no nível único celular. A fixação, permeabilização, hibridização e medidas de imagem foram otimizadas em laboratório ao longo de muitos anos usando o sistema de modelo descrito aqui, o que resulta em uma análise celular única bem sucedida e robusta da rotulagem smFISH. O principal objetivo com a preparação e processamento da amostra é produzir imagens de alta qualidade caracterizadas por uma alta relação sinal-ruído para reduzir falsos positivos e fornecer dados mais precisos. Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo o pipeline desde a preparação da amostra até a análise de dados em conjunto com sugestões e etapas de otimização para adaptar a amostras específicas.

Introdução

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Transcrição genética e tradução são os dois principais processos envolvidos no dogma central da biologia, indo da sequência de DNA para RNA para proteína1. Neste estudo, focamos na produção de RNA mensageiro (mRNA) durante a transcrição. A molécula nascente de RNA inclui introns não codificadores e exons de codificação. Os introns são co-transcriçãoseticamente emendados antes que o mRNA se mova para o citoplasma para tradução nos ribossomos2,3.

Tradicionalmente, a medição do mRNA é realizada em populações a granel de células (centenas a milhões) com ensaios clássicos como RT-qPCR ou mancha norte. Embora muito poderosos, esses métodos são limitados, pois não fornecem insights sobre a variação célula-celular (heterogeneidade fenotípica), identificação do número de alelos ativos transcricionalmente e, talvez mais importante, falta de informações espaciais. Mais recentemente, as tecnologias de genoma amplo que permitem o sequenciamento de RNA de células únicas (RNAseq) começaram a fazer a ponte entre os métodos de imagem e o sequenciamento4. No entanto, a RNAseq sofre de eficiências de detecção relativamente baixas e as etapas de processamento resultam em perda completa de informações espaciais5. Embora a rnAseq unicelular possa fornecer insights sobre a heterogeneidade fenotípica entre uma população de células isogênicas, a fluorescência de RNA na hibridização situ (RNA-FISH) pode facilitar uma exploração mais completa da expressão genética-alvo no nível espacial, e em uma base de aleelo por alelo6,7.

RNA FISH é uma técnica que permite a detecção e localização de moléculas de RNA alvo em células fixas. Ao contrário dos métodos anteriores e trabalhosos, o RNA-FISH de última geração utiliza sondas de ácido nucleico comercialmente disponíveis que são complementares às sequências de RNA alvo, e essas sondas hibridizam seus alvos pelo emparelhamento base Watson-Crick8. As técnicas iniciais de hibridização in situ envolveram um protocolo semelhante estabelecido por Gall e Pardue em 1969, uma vez que uma amostra foi processada com sondas de ácido nucleico que especificamente hibridizadas para um RNA9alvo . Originalmente, o ensaio foi realizado utilizando-se detecção radioativa ou colorimétrica; no entanto, na década de 1980, o desenvolvimento da fluorescência nos protocolos de hibridização situ (FISH) para o DNA FISH e posteriormente RNA FISH abriu o caminho para uma detecção mais sensível, e o potencial de multiplexação10,11.

Outros desenvolvimentos no RNA FISH levaram à capacidade de detectar e quantificar moléculas de RNA únicas (smFISH)12,13. A detecção direta é um método no qual as próprias sondas são rotuladas com fluoroforos. Um desafio com o smFISH é que há necessidade de sondas/alvos hibridizadores suficientes para facilitar a detecção de sinais fluorescentes como pontos distintos e limitados por difração. Para resolver esse problema, pode-se usar um conjunto de sondas de oligonucleotídeos de DNA de uma única vez complementares a várias regiões do RNA8,12,14. A ligação de múltiplas sondas aumenta a densidade fluorófora local, tornando o RNA visível como um ponto distinto e de alta intensidade por microscopia de fluorescência. Este método é vantajoso porque a ligação fora do alvo de oligonucleotídeos no pool de conjuntos de sondas pode ser distinguida do verdadeiro sinal spot do RNA, analisando quantitativamente o tamanho e intensidade do spot para diferenciar entre o verdadeiro sinal e a ligação espúria de oligonucleotídeos, facilitando assim uma análise mais precisa através da redução de falsos positivos12.

Métodos alternativos para detectar mRNA são o clássico método de tradução nick baseado em clones BAC e o sistema de DNA ramificado mais recentemente desenvolvido. No método clonado por BAC, nick-translation, o DNA a ser rotulado é enzimaticamente cortado e um novo nucleotídeo é adicionado ao final exposto de 3'. A atividade da polimerase de DNA I adiciona um nucleotídeo rotulado resultando na sonda desejada15,16. A técnica de DNA ramificada envolve sondas oligonucleotídeos que hibridizam em pares para alvos de RNA e essas sondas são amplificadas utilizando múltiplas moléculas de amplificação de sinal. Este método pode melhorar significativamente a relação sinal-ruído, mas a amplificação pode distorcer a quantitação precisa, uma vez que as manchas fluorescentes podem ser extremamente diferentes em tamanho e intensidade17.

Como um sistema modelo para este protocolo, que é totalmente empregado como parte da participação do Programa de Pesquisa de Superfundo niehs para quantificar os efeitos de produtos químicos endócrinos disruptivos em Galveston Bay/Houston Ship Channel, usamos o receptor de estrogênio (ER) linha de células de câncer de mama positiva MCF-7 tratada durante a noite com um agonista ER, 17β-estradiol (E2)7,18,19. O E2 regula muitos genes alvos de ER, incluindo o gene prototípico alvo de ER, GREB17,20,21,22. O protocolo smFISH descrito aqui utiliza um conjunto de dois conjuntos de sondas espectralmente separados visando o GREB1; um que hibridize para exons e o outro para introns, permitindo a medição tanto do RNA maduro quanto nascente7. Em seguida, usamos microscopia de epifluorescência juntamente com a desconvolução para amostras rotuladas por SmFISH de imagem e, em seguida, aplicamos rotinas de análise de imagem para quantificar o número de alelos ativos e RNAs maduros por célula.

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Protocolo

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Para garantir os melhores resultados, a parte de laboratório molhada deste protocolo requer precauções padrão sem RNase em todas as etapas. Por exemplo, o uso de pontas de pipeta filtradas, vasos estéreis e tampões sem RNase é altamente incentivado. O uso de inibidores de RNase, como os complexos ribonucleosídeos vanadyl, também é sugerido, especialmente para RNAs de alvo de baixa abundância.

1. Cultura celular e configuração experimental

  1. Manter as células cancerígenas de mama mcf-7 aderentes (ATCC #HTB-22) em um frasco de cultura tecidual T75 com fenol-vermelho livre (apenas necessário para experimentos de estimulação hormonal) O meio de Águia modificado (DMEM) modificado de Dulbecco( DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, 1 nM piruvato de sódio, 50 i.U./mL penicilina e 50 μg/mL estreptomicina.
  2. Coloque tampas redondas revestidas de poli-D revestidas de ácido (0,16 a 0,19 mm de espessura, 12 mm de diâmetro) em uma placa de cultura de tecido multiwell de 24 milímetros.
    NOTA: Use 1 M HCl para etch ácido as tampas e cubra com uma solução de 1 mg/mL de poli-D-lisina reconstituída em PBS estéril (salina tamponada com fosfato sem Ca++ e Mg++) de acordo com os protocolos padrão.
  3. Remova a mídia de crescimento das células e lave uma vez com 5 mL de PBS estéril (soro fisiológico tamponado com fosfato sem Ca++ e Mg++). Despemar células MCF-7 usando 2-3 mL de solução Trypsin-EDTA 0,25%. Uma vez que as células sejam separadas, neutralize a solução Trypsin-EDTA 0,25% com um volume igual de mídia de crescimento.
  4. Transfira as células na suspensão da mídia para um tubo cônico de 15 mL, gire a 391 x g por 1 minuto para desarmar as células. Remova cuidadosamente a mídia do tubo cônico sem perturbar a pelota celular e resuspende as células em uma quantidade adequada de mídia de tratamento.
    NOTA: A mídia de tratamento é de DMEM livre de fenol-vermelho complementada com 5% de carvão-dextran descascado e dialisado FBS, 2 mM L-glutamina, 1 nM pirunato de sódio, 50 i.U./mL penicilina e 50 μg/mL estreptomicina. Esta mídia é essencial para experimentos de estimulação hormonal esteroide, pois o componente sérico é em grande parte esgotado de esteroides por carvão descascando a mídia, e tem fatores de crescimento reduzidos através da diálise.
  5. Semear as células em deslizamentos de cobertura na placa de 24 multiwell em 60.000 a 70.000 células por poço em 500 μL de mídia de tratamento. Para este experimento, a confluência celular deve ser em torno de 70-80% na iniciação do tratamento. Otimize a densidade de semeadura celular dependendo do tipo celular, taxa de crescimento e duração do experimento para evitar a confluência, o que complica a análise da imagem.
    NOTA: Para melhor análise de imagens e imagens, evite a aglomeração celular. Para isso, misture completamente a alíquota das células por pipetação (ou brevemente vórtice) das células algumas vezes antes de dispensar os poços. Antes de colocar as células banhadas de volta na incubadora, deixar as células se instalarem na capa de cultura tecidual por cerca de 20 minutos ajuda a reduzir a aglomeração celular.
  6. Incubar células por pelo menos dois dias antes dos tratamentos para garantir a sincronização do ciclo celular e a redução de fundo devido a quaisquer moléculas de sinalização que permanecem no soro despojado/dialisado da mídia de crescimento.
  7. Após uma incubação de 48 horas em meios de tratamento, trate as células MCF-7 com 10 nM 17β-estradiol (E2) e controle de veículo (DMSO), diluídas em meios de tratamento por 24 horas. Este tratamento usa uma dose saturada de E2 para induzir uma resposta máxima. Realize o curso de tempo e experimentos de dose-resposta para determinar empiricamente as condições para diferentes genes-alvo, modelos celulares e tipo de tratamentos. Como exemplo, veja nossa recentepublicação 7.

2. Preparação de tampões

  1. Para preparar o tampão de fixação, diluir formaldeído monomérico purificado (vendido por fornecedores de microscopia eletrônica como 16% paraformaldeído) a 4% em PBS Ca++/Mg++ (soro fisiológico tamponado com fosfato mais Ca++ e Mg++). Adicione os complexos vanadyl ribonucleosídeos (VRC) ao buffer de fixação para uma concentração final de 2 mM para retardar a degradação do RNA.
    1. Calcule a quantidade total de buffer de fixação com base na necessidade de 300-500 μL de fixação por poço de uma placa de 24 multiwell. Armazene o formaldeído de 4% no gelo até que seja necessário na etapa de fixação.
      NOTA: Faça o buffer de fixação fresco para cada experimento.
      ATENÇÃO: Formaldeído é um teratogênio que é absorvido pela pele. Use este produto químico em um capô de fumaça, juntamente com EPI apropriado de acordo com suas regulamentações institucionais.
  2. Para a etapa de permeabilização, prepare 70% de etanol em água livre nuclease. Uma opção alternativa é triton-X100 de 0,5% em PBS Ca++/Mg++ mais 2 mM de VRC. Calcule a quantidade total de tampão de permeabilização necessário utilizando 500 μL de buffer por poço.
  3. Para preparar 9 mL do tampão de hibridização, adicione 2 mL de caldo 50% de sulfato de dextran e 1 mL de tampão de 20x SSC (citrato de sódio salino) a 6 mL de água livre nuclease. Vórtice para misturar completamente o tampão de hibridização. Este buffer pode ser armazenado a 4 °C por até uma semana.
  4. Existem cinco etapas de lavagem separadas que requerem 2x de focela de sódio salino (SSC). Calcule o volume final do buffer SSC de 2x necessário antecipando 500 μL de buffer por deslizamento de tampa por etapa de lavagem. Diluir a quantidade necessária de estoque 20x tampão SSC em água sem nuclease. 2 mM VRC pode ser adicionado para lavar etapas como uma precaução extra. Este buffer pode ser armazenado à temperatura ambiente durante a duração das etapas de processamento.

3. Fixação para RNA FISH

  1. Após o tratamento, remova a mídia dos poços e lave uma vez com estéril, frio PBS Ca++/Mg++. Se for utilizado um modelo celular de baixa adesão, não utilize um vácuo para aspirar líquido; use pipetting manual para remover cuidadosamente a mídia do lado do poço e omitir a etapa inicial de lavagem. Adicione 500 tampão de fixação μL por 30 minutos no gelo.
    NOTA: Se a amostra estiver propensa à degradação do RNA, use PBS estéril com VRC de 2 mM para a etapa de lavagem neste momento.
  2. Remova a fixação e descarte-a em resíduos químicos de acordo com as normas institucionais. Lave as células duas vezes com PBS Ca++/Mg++ por 3 minutos.
  3. Retire o PBS e adicione 500 μL de 70% de etanol a cada poço. Sele a placa 24 com um filme de plástico parafina. Coloque em um rotador a 4 °C por uma mínima de quatro horas. É melhor deixar as amostras em 70% de etanol durante a noite. O protocolo pode ser pausado neste momento e as amostras podem ser armazenadas por até uma semana em 70% de etanol.
    NOTA: Um Triton-X100 de 0,5% em PBS com solução VRC de 2 mM pode ser usado como alternativa. Incubar as amostras em 500 μL deste tampão de permeabilização por 20 minutos à temperatura ambiente em um rotador. Se utilizar este buffer de permeabilização, o protocolo não pode ser pausado neste momento e deve continuar através da etapa de hibridização.

4. Hibridização para RNA FISH

  1. Remova o tampão de permeabilização e lave uma vez em 500 μL de tampão SSC 2x mais 10% de formamida por 5 minutos à temperatura ambiente em um rotador.
  2. Prepare o buffer de hibridização completo. Calcule aproximadamente 30 μL de tampão de hibridização completo por deslizamento de cobertura. Adicione formamida ao buffer de hibridização para atingir os percentes necessários. Por exemplo, se 500 μL de tampão de hibridização completo forem necessários, então ele consistiria em 450 μL do buffer de hibridização previamente feito mais 50 μL de formamide de grau molecular para atingir 10% vol/vol. Vórtice brevemente para misturar.
    ATENÇÃO: A formamida é um teratogênio que é absorvido pela pele. Use este produto químico em um capô de fumaça, juntamente com EPI apropriado de acordo com as normas institucionais.
  3. Diluir as sondas GREB1 intron (rotulada com Atto 647N) e GREB1 (rotuladas com quasar 570) em 1:300 em tampão de hibridização. Misture através de pipetting. Proteja este buffer da luz e use imediatamente.
    NOTA: As sondas foram projetadas e fabricadas como detalhadas em Stossi et al7. As sondas são geralmente fornecidas como um pool de sonda oligonucleotídeo seco que deve ser reconstituído no buffer TE livre de RNAse de acordo com o protocolo do fabricante14. A solução de estoque para essas sondas foi de 12,5 μM, portanto; a concentração de trabalho das sondas é de 42 nM.
  4. Prepare uma câmara umidificante para a etapa de hibridização da noite para o dia. Coloque um pedaço de filme plástico de parafina, lado não exposto para cima, em uma placa de vidro Petri limpa com um descontaminante superficial para remover RNases. Saturar duas toalhas de papel com água estéril e colocá-las ao longo das bordas da placa de Petri para fornecer umidade, pois a secagem pode destruir rotulagem específica.
  5. Aliquotar as sondas pontilhando 30 μL de sondas em tampão de hibridização no lado limpo do filme plástico parafina. Distribua as alíquotas das sondas para que as tampas não entrem em contato entre si.
  6. Usando fórceps esterilizados, gire suavemente o lado da célula de deslizamentos para baixo nas sondas na placa de vidro Petri. Evite bolhas de ar e não aplique pressão nas tampas.
    NOTA: Não descarte a placa de cultura tecidual com o tampão SSC 2x, pois será necessário para as etapas subsequentes.
  7. Sele a placa de vidro Petri com filme plástico parafina e cubra a placa com papel alumínio para evitar a exposição da luz aos fluoroforos. Incubar durante a noite, até 16 horas, a 37 °C em uma superfície plana não rotativa. O tempo de incubação pode ser variado empiricamente, porém recomenda-se um mínimo de 4 horas.
    NOTA: As tampas são suscetíveis a deslizar ao redor ao incubar no tampão de hibridização, o que pode levar a manchas secas na mancha de cobertura e danificar a amostra.

5. Preparando amostras para imagens

  1. No dia seguinte, remova as tampas da câmara umidificante usando fórceps e devolva-as à placa de 24 poços com o lado da célula para cima. Adicione 500 μL de tampão SSC fresco 2x mais 10% de formamida para lavar o excesso de sonda e hibridização não específica.
    NOTA: Proteja as amostras da luz a partir deste ponto.
  2. Lave as células duas vezes com 500 μL de tampão SSC 2x mais 10% de formamida por 15 minutos cada a 37°C em um rotador aquecido.
  3. Contratena o DNA com DAPI a 1 μg/mL em tampão SSC 2x por 10 minutos à temperatura ambiente em um rotador.
  4. Lave uma vez com tampão SSC 2x por 5 minutos em temperatura ambiente.
  5. Monte as tampas em lâminas de vidro usando mídia de montagem não endurecedora depois de remover qualquer excesso de tampão SSC de 2x com uma toalha de papel e uma lavagem rápida em água livre de nuclease para eliminar o excesso de sais. Por fim, sele as tampas com esmalte claro.

6. Microscopia de alta resolução e processamento de imagem

  1. Imagem as amostras em um microscópio de epifluorescência de campo largo usando um objetivo de óleo de 60x ou 100x e uma câmera sCMOS. Veja a tabela de materiais para o microscópio específico e objetivo utilizado para este experimento.
    1. Imagem completa assim que as amostras são totalmente processadas para evitar a degradação dependente do tempo do sinal.
      NOTA: O óleo de imersão com um índice de refração (RI) de 1.516 é usado neste experimento. Testes empíricos devem ser realizados para corresponder ao RI de óleo com amostras específicas, pois os incompatibilidades de RI resultarão em aberrações da função de propagação de ponto que afetará a desconvolução da imagem.
  2. As imagens são capturadas com um tamanho de pixel lateral de 0,10827 μm.
  3. Otimize a quantidade de iluminação da fonte de luz (ou seja, transmissão por cento) e os tempos de exposição para cada canal (DAPI, TRITC, filtros CY5 neste exemplo específico) usando a amostra que deverá ter a maior intensidade (ou seja, controles positivos). Neste experimento, espera-se que a amostra tratada com E2 tenha maior intensidade para ambos os conjuntos de sondas GREB1. Geralmente, a transmissão percentual para sondas GREB1 intron e exon é de 50 – 100%, e os tempos de exposição variam de 0,25 a 0,60 segundos.
  4. Além disso, adquira imagens em condições que evitem fotobleaching e/ou qualquer saturação de pixels de câmera. Em nossa experiência, deve haver uma diferença mínima de ~dez vezes entre o fundo e a intensidade do sinal. A saturação de poucos pixels/campo pode ocorrer devido a sinais não específicos na amostra (ou seja, sujeira na mancha de cobertura, agregados de sonda fora da célula), o que pode ser aceitável, mas apenas se regiões saturadas não forem incluídas na quantitação.
  5. Para definir a aquisição de uma pilha z, concentre-se na amostra no canal DAPI. Selecione a parte superior e a parte inferior da pilha z nas distâncias onde os núcleos manchados do DAPI ficam fora de foco. O tamanho da etapa de pilha z que usamos é de 0,25 μm por fatia e a pilha z total deve abranger toda a célula (cerca de 10 μm em células MCF-7). No entanto, o tamanho da etapa z-stack mudará de acordo com o objetivo utilizado e deve seguir o critério de amostragem de Nyquist.
    NOTA: Os introns geralmente estão presentes apenas no núcleo; no entanto, os exons estão tanto no núcleo quanto no citoplasma. Portanto, a configuração da pilha z como descrita acima capturará a maior parte da rotulagem intron e exon, pois a pilha de z abrange toda a célula.
  6. Tipicamente, imagem um mínimo de 200 células para análise quantitativa em experimentos preliminares para capturar um instantâneo da magnitude de resposta e variação entre as células.
  7. Algumas células imagens são excluídas da análise final (ou seja, taxa de abandono) porque serão filtradas pelo pipeline de análise (ou seja, células que tocam a borda da imagem, células apoptóticas/mitóticas).
    NOTA: Ao selecionar áreas de imagem, existem alguns fatores a serem observados. Escolha áreas com células uniformemente espalhadas e não sobrepostas, conforme definido pela fluorescência nuclear rotulada pelo DAPI. Além disso, tente selecionar áreas que tenham o menor número de núcleos ao longo das bordas da área de imagem para evitar contar células parciais. Imagens automatizadas e imparciales são sempre preferidas para experimentos que requerem análise estatística.
  8. Após a aquisição, imagens desconvolvem usando um algoritmo restaurador agressivo usando 10 ciclos (ou seja, número de iterações). Gerar projeções de intensidade máxima para análise de imagem (omitir esta etapa se for necessária análise 3D específica). Salvar todas as imagens de projeção de acordo com a profundidade de bit da câmera usada; no nosso caso, foram salvas imagens em escala de cinza TIFF de 16 bits. As imagens RGB têm um pouco de profundidade reduzida, resultando em perda de informações; portanto, as imagens RGB não são adequadas para análise de imagens.

7. Análise de imagem

  1. Leia as instruções e baixe o caderno jupyter do github(https://github.com/pankajmath/RNA_FISH_analysis).
  2. Instale a distribuição python anaconda(https://www.anaconda.com/distribution/)versão 3.6 ou superior.
  3. Abra o prompt anaconda e digite o comando de instalação para instalar ITK simples para anaconda(https://anaconda.org/SimpleITK/simpleitk).
  4. Abra o navegador anaconda e lance o notebook jupyter. Ele abrirá um navegador da Web mostrando diretórios e arquivos. Navegue pelas estruturas do diretório para chegar ao diretório contendo o notebook jupyter baixado do github.
  5. Abra o notebook e execute cada célula pressionando Shift and Enter simultaneamente.
  6. Siga os detalhes de cada função e etapa fornecida no notebook. Para um conjunto diferente de imagens, pode-se ter que alterar alguns valores de parâmetros.
    NOTA: Em suma, os núcleos são segmentados a partir do canal DAPI usando limiares locais com um tamanho de bloco de 251 pixels, buracos foram preenchidos e objetos menores que 100 pixels removidos. Núcleos tocantes foram divididos usando um algoritmo divisor de águas. A máscara nuclear foi então dilatada por 100 pixels e a bacia hidrográfica foi usada para separar objetos de toque usando núcleos como bacias. Para identificar RNA de estado estável (exons), foi utilizado o limiar de Otsu; para alelos ativos transcricionais (intron), primeiro foi aplicado um borrão gaussiano (sigma=1) e, em seguida, foi utilizado o limiar máximo de entropia.

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Resultados

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Para analisar as respostas hormonais via smFISH, como exemplo, optou-se pelo modelo receptor de estrogênio (ER) utilizado em ensaios de alto rendimento para determinar a presença de produtos químicos endócrinos em desastres ambientais no contexto de participação no Programa de Pesquisa de Superfundoniehs 7. Neste experimento, as células cancerígenas de mama mcf-7 aderiram foram tratadas com o agonista ER 17β-estradiol (E2, 10 nM) ou veículo (DMSO) durante 24 horas. Conjuntos de sondas separadas es...

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Discussão

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A metodologia smFISH descrita baseia-se nos protocolos publicados anteriormente7,12,14. Neste protocolo, explicamos as etapas críticas que foram otimizadas desde o laboratório molhado (incluindo densidade de semeadura, tempo de fixação, permeabilização e concentração de sondas), até análise de imagens e imagens, fornecendo um pipeline experimental completo para laboratórios interessados em realizar análises celulares únicas da t...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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MAM, FS e MGM são financiados pela NIEHS (Projeto 4, P42ES027704, PI, Rusyn). MAM, FS, RMM, MGM e PKS são suportados pelo Centro GCC de Microscopia Avançada e Informática de Imagem (RP170719) financiado pelo CPRIT. A imagem também é apoiada pelo Núcleo Integrado de Microscopia da Baylor College of Medicine com financiamento do NIH (DK56338, e CA125123), CPRIT (RP150578), Dan L. Duncan Comprehensive Cancer Center e John S. Dunn Gulf Coast Consortium for Chemical Genomics.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
17β EstradiolSigma-AldrichE2257Número CAS 50-28-2
Ambion SSC (20X) Tampone, Rnase-freeThermoFisher ScientificAM9770
Corning DMEM com L-Glutamina e 4,5 g/L de GlicoseFisher ScientificMT10017CVFabricado pela Invitrogen
DAPISigma-AldrichD8417Sem piruvato de sódio
Sulfato de Dextrano, Solução Estéril a 50%Sigma-Aldrich3730-100ML
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++Corning21030CVFabricado pela Calbiochem
Ethanol, 200 Proof (100%)Fisher Scientific07-678-005
Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture PlateCorning353047Fabricado pela Decon
Laboratories Fetal Soro Bovino (FBS), 500 mLFisher Scientific50-753-2978Fabricado pela Gemini Bio Products
GE Healthcare DeltaVision LIVE Microscópio de Deconvolução de Alta Resolução GEHealthcare
Hyclone Water, Óleode Imersão SH3053802Científica Fisher Scientific
1.516GE Healthcare Life Sciences29162940Fabricado pela GE
Solução de L-glutaminaFisher ScientificMT25005ClFabricado pela Corning
Células MCF-7ATCCHTB-22
Formamida de Grau MolecularPromegaPAH5051
Olympus 60x/1.42 NA ObjetivoOlympus
ParafilmBemis Company, Inc.52858-076Distribuído pela VWR
Paraformaldeído, Solução a 16%,Microscopia Eletrônica15710
Solução de Penicilina-EstreptomicinaFisher ScientificMT3001ClFabricado pela Corning
Ribonucleosídeo Vanadyl ComplexVWR101229-716Fabricado pela New England Biosciences
RNase AwayAmbion9780
Piruvato de sódio, 100 mMFisher Scientific11-360-070Fabricado pela Gibco
Thermo Scientific Glass Covers, #1.5Fisher Scientific12-545-81P
Triton X-100, 100 mLFisher ScientificBP151-100Fabricado pela Fisher BioReagents
Tripsina-EDTA Solution 0.25%Sigma-AldrichT4049-500ML
Meio de Montagem Antidesbotamento Vectashield 10 mLNC9265087 Fisher ScientificFabricado pela Vector Laboratories
Ciências de de Grau EM

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. iGenetics: A Mendelian Approach. , Pearson Education, Inc. 331-352 (2006).
  2. Darnell, J. E. Variety in the level of gene control in eukaryotic cells. Nature. 297, 365-371 (1982).
  3. Köhler, A., Hurt, E. Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 761-773 (2007).
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