Triagem In Vivo CRISPR/Cas9 para avaliar simultaneamente a função genética na pele do rato e na cavidade oral

Resumo

Aqui descrevemos uma metodologia rápida e direta de triagem in vivo CRISPR/Cas9 utilizando ultrassom guiado em injeções lentiviras embrionárias uterobrionárias para avaliar simultaneamente funções de vários genes na pele e cavidade oral de camundongos imunocompetrente.

Resumo

Modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMM) têm sido fundamentais na avaliação da função genética, modelagem de doenças humanas e servindo como modelo pré-clínico para avaliar caminhos terapêuticos. No entanto, sua natureza de tempo, trabalho e custo-intensivo limita sua utilidade para análise sistemática da função genética. Os recentes avanços nas tecnologias de edição de genomas superam essas limitações e permitem a rápida geração de perturbações genéticas específicas diretamente dentro de órgãos específicos do mouse de forma multiplexada e rápida. Aqui, descrevemos um método baseado em CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) para gerar milhares de clones de knock-out genéticos dentro do epitélio da pele e cavidade oral dos camundongos, e fornecer um protocolo detalhando os passos necessários para realizar uma tela CRISPR direta   para genes supressores tumorais. Essa abordagem pode ser aplicada a outros órgãos ou outras tecnologias CRISPR/Cas9, como a ativação crispr ou a inativação crispr para estudar a função biológica dos genes durante a homeostase tecidual ou em vários ambientes de doenças.

Introdução

Um dos desafios para a pesquisa do câncer na era pós-genômica é minerar a vasta quantidade de dados de genoma para mutações genéticas causais e identificar nós na rede genética que podem ser direcionados terapeuticamente. Embora as análises bioinformáticas tenham ajudado imensamente nesse sentido, estabelecer modelos in vitro e in vivo eficientes é um pré-requisito para decifrar a complexidade dos sistemas biológicos e estados de doenças e para permitir o desenvolvimento de medicamentos. Embora os modelos convencionais de camundongos transgênicos tenham sido usados extensivamente para estudos de genética do câncer in vivo, sua natureza de custo, tempo e trabalho intensivo proibiu em grande parte a análise sistemática das centenas de genes putativos de câncer desvendados pela genômica moderna. Para superar esse gargalo, combinamos uma tecnologia de edição de genes previamente estabelecida no ultrassom na metodologia de injeção do útero^1,2 com uma tecnologia de edição de genes CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)^para induzir e estudar simultaneamente mutações de perda de função de centenas de genes na pele e cavidade oral de um único rato.

A metodologia descrita aqui utiliza injeções guiadas por ultrassom de lentivírus projetados na cavidade amniótica de embriões de camundongos vivos no dia embrionário E9.5. A carga lentiviral contendo componentes CRISPR/Cas9 transduzir o ectoderme de superfície em camada única, que mais tarde dá origem ao epitélio da pele e da cavidade oral. A pele é composta de uma epiderme externa, seguida por membrana do porão e derme. Epiderme é um epitélio estratificado composto por uma camada interna basal, que mantém contato com a membrana do porão e tem capacidade proliferativa e de células-tronco. A camada basal dá origem às camadas diferenciadas acima, como camadas de córneas espinhosas, granulares e^{estratosas 2,4}. Estudos de rastreamento de linhagem mostram que este método in vivo CRISPR/Cas9 manipula geneticamente células-tronco residentes em tecidos dentro da camada basal que persistem durante toda a idade adulta. Como o lentivírus pode ser titulado para transduturar o ectoderm superficial E9.5 na densidade clonal, este método pode ser usado para gerar ratos de mosaico abrigando milhares de clones de knock-out genéticos discretos. O sequenciamento da próxima geração pode então ser usado para analisar o efeito da ablação genética mediada pelo CRISPR/Cas9 dentro desses clones de forma multiplexada⁵.

Recentemente, utilizamos este método para avaliar a função de 484 genes que mostram mutações recorrentes no Carcinoma de Células Escamosas de Cabeça e Pescoço Humano (HNSCC)⁵. O HNSCC é um câncer devastador com uma alta taxa de mortalidade de 40 a 50% e é o^6º câncer mais comum em todo o mundo⁶. O HNSCC surge em forros mucosas das vias aéreas superiores ou da cavidade oral e está associado ao consumo de tabaco e álcool ou infecção por papilomavírus humano (HPV). Carcinoma de Células Escamosas Cutâneas (CCS) são tumores de pele e representam o segundo câncer mais comum em humanos⁷. O CCS cutâneo e o HNSCC são histologicamente e molecularmente muito semelhantes, com um alto percentual de casos apresentando alteração em TP53, PIK3CA, NOTCH1 e HRAS⁸. Embora haja apenas um punhado de genes mutados em alta frequência, há centenas de genes encontrados mutados em baixa frequência (< 5%), um fenômeno comumente referido como a distribuição de cauda longa. Como a maioria dos genes de cauda longa não tem validação biológica ou clínica, usamos esta tecnologia de triagem in vivo CRISPR para modelar a perda de função desses genes em camundongos propensos a tumores com mutações sensibilizantes em p53, Pik3ca ou Hras e identificamos vários novos genes supressores de tumores que cooperam com p53, Pikca ou Hras para desencadear o desenvolvimento do tumor⁵.

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para gerar bibliotecas sgRNA lentiviral sgRNA multiplexed sgRNA e executar telas de knock-out de genes CRISPR/Cas9 no ectoderme da superfície do mouse. Note-se que essa metodologia pode ser adaptada para incorporar outras tecnologias de manipulação genética, como a ativação crispr (CRISPRa) e a inativação CRISPR (CRISPRi) ou modificada para atingir outros sistemas de órgãos no mouse para estudar funções genéticas.

Protocolo

Este protocolo foi aprovado e realizado de acordo com o IACUC da Universidade de Toronto.

1. Design e clonagem de bibliotecas CRISPR agrupadas

1. Selecione 4-5 sgRNAs visando genes de interesse do mouse de recursos como o designer sgRNA (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) do Broad Institute ou o servidor CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no). Selecione um número igual de sgRNAs não direcionados de por exemplo, Sanjana et al.⁹ para gerar uma biblioteca de controles de gRNA de controles não direcionados igualmente dimensionados.
2. Ao construir as bibliotecas sgRNA, certifique-se de que há cobertura suficiente para cada sgRNA no sistema de órgãos direcionado. Para a pele do camundongo, a epiderme em E9.5 é uma única camada que contém ~150.000 células, a maioria das quais têm capacidade de células-tronco⁴. Se a transdução lenti-viral resultar em 15-20% de infectividade, apenas 18.000-24.000 células serão transduzidas em E9.5. Dimensione o experimento de acordo.
3. Para clonagem e amplificação dessas bibliotecas sgRNA, adicione os locais de restrição de enzimas BsmBI, bem como as sequências de DNA de ligação de primer a 5' e 3' finais do sgRNA e solicite os oligos de comprimento total resultantes como chip de oligonucleotídeo agrupado(Figura 1A).
   1. Para multiplex diferentes bibliotecas em um chip, adicione sequências específicas de primer da biblioteca.
   2. Usando os pares de primer apropriados, amplie cada biblioteca separadamente do chip oligo agrupado. Em um tubo PCR, misture 25 μL de 2x mistura mestre de polimerase, 20 μL de água livre DNase/RNase, 5 ng de DNA de chip oligo, 2,5 μL de primer dianteiro apropriado e 2,5 μL de primer reverso apropriado. Use 12-15 ciclos e amplie com desnaturação de 98 °C, 63-67 °C de ressarificação, parâmetros de extensão de 72 °C para cada ciclo na máquina PCR.
   3. Execute o produto PCR em um gel de 2,5% de agarose e purifique ~100 bp de produto PCR usando um kit de limpeza de DNA de gel.
4. Prepare a espinha dorsal plasmid.
   1. Digerir 5 μg do Cre-recombinase contendo pLKO-Cre stuffer v3 plasmid com 2 μL de BsmBI em 50 μL mistura de reação por 1 h a 55 °C, seguido por 1 μL de incubação de fosfatas alcalinas para 45 min a 37 °C de acordo com as instruções do fabricante.
      NOTA: Cre-recombinase contendo pLKO-Cre stuffer v3 plasmid é um plasmídeo à base de lenti viral que contém enzima Cre-recombinase para remover Lox-Stop-Lox em células de mouse e também tem um promotor U6 para conduzir a expressão de sgRNA e tracrRNA. Uma versão com Cas9 e sem Cas9 pode ser usada e disponível na Addgene #158030 e #158031.
   2. Execute o DNA digerido em um gel de 1% de agarose e purifique a faixa vetorial linearizada de 7 kb usando um kit de limpeza de DNA de gel. Note-se que uma banda de enchatar 2 kb também deve ser visível indicando um digestor bem sucedido.
5. Configure a reação de ligadura para gerar uma biblioteca de plasmídeos sgRNA.
   1. Misture 1 μg de vetor purificado e 30 ng de inserção PCR purificada com 2 μL de BsmBI, 5 μL de ligase de DNA T4, 10 μM ATP e 1x tampão específico para BsmBI. Incubar a mistura de ligadura durante a noite a 37 °C. Use um tubo adicional contendo todos os materiais acima, exceto a inserção PCR como um controle negativo.
   2. Na manhã seguinte, purifique a mistura de ligadura usando o kit de limpeza oligo e elute em 7 μL de água livre RNase/DNase.
6. Eletroporar a biblioteca em células competentes.
   1. Adicione 2 μL de biblioteca de sgRNA eluted ou mistura de ligadura de controle negativo a 25 μL de células eletrocompetente descongeladas em cuvetas pré-refrigeradas (1,0 mm) no gelo. Eletroporato seguindo o protocolo do fabricante (10 μF, 600 Ohms, 1800 Volts). Ao cuvette adicione 975 μL de meio de recuperação (ou meio SOC) dentro de 10 s do pulso.
   2. Transfira células eletroporadas para um tubo de cultura e incubar por uma hora a 37 °C em uma incubadora de agitação bacteriana a 300 rpm.
7. Estimar a eficiência da transformação e a cobertura da biblioteca por sgRNA.
   1. Prepare uma diluição de 100 vezes transferindo 10 μL da reação de transformação contendo células eletroporadas com biblioteca sgRNA ou ligadura de controle negativo para 990 μL de Recovery Medium e misture bem.
   2. Placa 10 μL da mistura de transformação diluída em uma placa de ágar pré-aquecida de 10 cm LB + ampicillina (100 μg/L). Isso resulta em uma diluição de 10.000 vezes dos transformadores e usar esta placa para calcular a eficiência da transformação. Realizar incubação das placas a 30 °C para 14-16 h.
8. Plaque o resto da reação de transformação espalhando 100 μL de células recuperadas em cada placa de um total de 10 placas de ágar pré-aquecidas de 15 cm LB + ampicillin. Incubar as placas por 14-16 h a 30 °C. Note-se que o crescimento a 30 °C minimiza a recombinação entre as duas repetições de terminal longo dentro do plasmídeo viral.
9. Para avaliar o sucesso da clonagem, calcule a eficiência da transformação. Conte o número de colônias na placa de diluição contendo transformadores da biblioteca sgRNA ou ligadura de controle negativo (placas de 10 cm, passo 1.8.2). A mistura de controle negativo não deve ter nenhuma ou poucas colônias. Para obter o número total de colônias, multiplique o número de colônias em 10.000.
   NOTA: O número total contado de colônias representa uma cobertura de biblioteca que deve ser mínima de 200x colônias por sgRNA.
   1. Certifique-se de que uma biblioteca com 2000 sgRNAs terá pelo menos 400.000 colônias. Caso não haja colônias suficientes, repita e configure mais eletroporação.
10. Controle de qualidade: A partir da placa de diluição, escolha 20 colônias e adicione cada colônia a um tubo de cultura individual contendo 3 mL de mídia LB + ampicillina. Incubar todos os 20 tubos durante a noite a 30 °C tremendo a 250 rpm. Purifique o DNA plasmídeo usando o kit mini-prep de acordo com as instruções do fabricante e sanger sequencia todas as 20 amostras de DNA plasmida para verificar que cada amostra tem uma sequência sgRNA diferente usando o primer U6 (5'GAG GGC CTA TTT CCC ATT ATT CC-3').
11. Colher as colônias de cada placa de 15 cm.
    1. Adicione 7 mL de meio LB, em seguida, raspe as colônias da placa lb agar com um espalhador de células. Use uma pipeta de 10 mL para transferir as células para um frasco cônico estéril de 2 L. Repita para todas as placas e bactérias da piscina no frasco de 2 L. Incubar o frasco por 2-3 h tremendo a 30 °C. Centrifugar a cultura e coletar a pelota.
    2. Purificar DNA plasmídeo usando um kit de purificação maxi-plasmida.
12. Controle de qualidade adicional: Use 1ng de DNA plasmídeo da biblioteca maxi-prep e execute uma reação pcr usando primers de sequenciamento de próxima geração de acordo com as instruções do fabricante. A representação de todas as sgRNAs na biblioteca pode ser verificada por uma plataforma de sequenciamento profundo.

2. Produção de lentivírus de alta titer adequado para transdução in vivo

NOTA: Execute todas as etapas nesta seção do protocolo em uma instalação BSL2+ em um gabinete de biossegurança classe II, Tipo A2. 293FT e especialmente as células de embalagem 293NT permitem maior produção de vírus. Use células de baixa passagem (

1. Prepare células de embalagem virais.
   1. No dia 1, as células placa HEK293T em 6 placas de poli-L-lysina revestidas de 15 cm a 35% de confluência em mídia de crescimento (DMEM + 10% FBS + 1% solução antibiótico penilina-estreptomicina (w/v)). Incubar células durante a noite a 37 °C, 5% de CO₂.
   2. Uma vez que as células banhadas sejam 70-80% confluentes e uniformemente espalhadas, substitua a mídia de crescimento por 25 mL de mídia DMEM sem soro e antibióticos.
   3. Adicione a mídia lentamente aos lados dos frascos ao se alimentar, pois as células HEK293T e 293NT podem se desprender facilmente do plástico da cultura tecidual
2. Prepare a mistura de transfecção.
   1. Adicione 65 μg de plasmídeos de embalagem lentiviral psPAX2, 43 μg de envelope expresso VSV-G plasmid pMD2.G, 65 μg de plasmídeo de biblioteca sgRNA e 240 μL de polietileneimina de 1 mg/mL (PEI) a 6 mL de DMEM e vórtice.
      NOTA: Use sempre uma garrafa de DMEM aberta ou muito recentemente aberta para a transfecção, pois o pH nesta etapa é crítico, e o DMEM torna-se mais básico ao longo do tempo uma vez aberto.
   2. Incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. Esta mistura de transfecção é suficiente para células banhadas em placas de 6 x 15 cm com 870 cm² de superfície. Dimensione a mistura de transfecção de acordo com os requisitos do experimento.
3. Transfecção de células de embalagem virais.
   1. Após 15 minutos de incubação, transfete cada uma das placas de 15 cm adicionando 1 mL da mistura de transfecção em toda a placa. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ por 8 h.
   2. Após a incubação, remova a mídia livre de soro contendo a mistura de transfecção e adicione 30 mL de mídia de cultura regular às placas de 15 cm e cultura por 48h a 37 °C, 5% CO₂.
4. Após 48 h, colete o supernanato viral e filtre através de 0,45 μm filtro PVDF. Mantenha 1 mL do supernanato viral e armazene a -80 °C para controle de qualidade e titulação viral.
5. Concentre o supernatante viral por centrifugação de sárose-gradiente em centrífuga de alta velocidade usando cabeça de rotor SW28.
   1. Tubos ultracentrífugas prime lavando-os com 70% de etanol, seguido por 3 enxágues com PBS. Distribua uniformemente aproximadamente 30 mL do supernanato viral em cada um dos tubos de 6 ultracentrifuus.
   2. Pipeta suavemente para o fundo de cada tubo 4 mL da solução de 20% de sacarose (20 g de sacarose em 100 mL de PBS). Coloque os seis tubos de ultracentrifuuagem nos seis baldes de balanço SW28 e equilibre precisamente cada par de baldes opostos adicionando ou removendo o supernatante viral.
   3. Centrífuga viral supernante a 4 °C por pelo menos 2h e até 4h a 80.000 x g e 4 °C. Uma vez feito a centrifugação, descarte cuidadosamente o supernatante.
   4. Escorra o restante do supernatante colocando tubos ultracentríficos de cabeça para baixo em papel toalha macia estéril por pelo menos 2 minutos e limpe todas as gotas de supernascido dentro do tubo usando uma toalha de papel macio para se livrar de qualquer meio residual. Uma pequena pelota branca acinzentado pode ser visível na parte inferior do tubo.
   5. Adicione 20-25 μL frio, PBS fresco a cada tubo. Veda tubos com filme de parafina e incubar tubos eretos no gelo com agitação suave em um agitador de plataforma orbital por ~2 h.
   6. Utilizando uma pipeta de 20 μL, desaloja cuidadosamente e resuspenda a pelota do primeiro tubo, tomando cuidado para não formar bolhas. Transfira o meio para o próximo tubo e repita o processo até que todas as pelotas do vírus tenham sido desalojadas e combinadas em um tubo de aproximadamente 120-150 μL de volume. Incubar esta suspensão viral de alta titer para mais ~2 h no gelo com agitação suave.
   7. Transfira a suspensão viral em um tubo de microcentrífa de 1,5 mL e gire o tubo a 4 °C em uma centrífuga de mesa refrigerada e pré-resfriada a 12.000 x g por 2 min. Aliquot o supernatante viral claro cuidadosamente como 10 μL alíquotas em tubos separados de 0,2 mL e armazene a -80 °C. Descarte a pelota na parte inferior do tubo, pois isso entupirá a agulha durante as injeções embrionárias.
6. Titulação da biblioteca de lentivírus CRISPR agrupada
   NOTA: A suspensão viral resultante deve produzir uma concentração aproximada de 2.000 vezes e a solução resultante do vírus e deve ter um título viral de 10⁷-10⁹, o que é bom o suficiente para mais de 100 cirurgias E9.5 descritas abaixo.
   1. Seed R26-Lox-STOP-Lox-tdTomato mouse fibroblasts embrionários (MEFs) ou R26-Lox-STOP-Lox-tdTomato queratinócitos primários ou qualquer outra linha celular Cre-reporter em uma placa de poço 2 x 6.
   2. Uma vez que a célula atinja ~40% de confluência, as células estão prontas para a transdução. Nesse momento, determine o número de células dentro de um poço para permitir o cálculo do título viral mais tarde. Mude a mídia das células Cre-reporter para mídia de crescimento complementada com polibrene de 10 μg/mL (=brometo de hexadimetrina).
   3. Diluir 1 μL de vírus concentrado com 2 mL de mídia de crescimento. Adicione 0, 10, 50, 200 μL de suspensão viral diluída e 50, 200 μL de vírus não concentrado da etapa 2.4 e misture placas e incubar durante a noite a 37 °C, 5% DE CO₂.
   4. Remova a mídia de crescimento contendo vírus no dia seguinte, lave as células com PBS e substitua por mídia de crescimento normal. O supernasce ainda é considerado lixo viral e deve ser descartado de acordo com as normas institucionais do BSL2.
   5. Aproximadamente 36-48 h após a transdução, avalie a recombinação mediada por Cre do Lox-STOP-Lox e expressão de tdTomato pela FACS. Calcule o título viral. Calcular unidades de formação de colônias (cfu)/mL usando a seguinte fórmula:
      
      NOTA: A comparação entre a suspensão viral concentrada com seu supernanato viral não cocentrado permitirá estimar o sucesso da (1) produção viral, bem como (2) da concentração viral. Alternativamente, o título viral pode ser estimado usando o método qRT-PCR¹⁰. A produção em larga escala e a concentração de lentivírus também podem ser realizadas usando uma concentração de duas etapas com concentração de cartuchos seguidos de ultracentrifugação como descrito anteriormente².

3. Cirurgia guiada ultrassom e injeção

NOTA: Esta tecnologia foi adaptada a partir de^4,11. A microinjeção voltada para a transdução do epitélio superficial deve ser realizada no dia embrionário E9.5, quando o ectoderme superficial consiste em uma única camada e antes da formação do periderm a partir do E10, o que impediria a transdução desta camada basal. Preferencialmente configurar ratos na sexta-feira, para que o primeiro dia possível com embriões E9.5 seja na segunda-feira seguinte. Use ratos Rosa26-Lox-STOP-LOX-Cas9-GFP (Jackson Laboratory #024857) para obter uma eficiência ótima de CRISPR/Cas9¹².

1. Configure camundongos masculinos e femininos apropriados para gestações cronometradas 10 dias antes da data desejada da cirurgia.
   1. Plug-check ratos nos dias seguintes para identificar camundongos potencialmente grávidas. Confirme a gravidez um dia antes da cirurgia planejada (ou seja, E8.5) usando ultrassom.
2. Prepare a placa de Petri modificada.
   1. Usando a fita adesiva de dois lados, cole a membrana de silicone na parte inferior da placa de Petri cobrindo a abertura circular. Usando uma tesoura afiada, corte uma abertura oval de 2 x 10 mm na membrana de silicone.
3. Preparação do sistema de microinjeção
   1. Prepare agulhas de injeção de um capilar de vidro de paredes grossas usando um puxador de micropipette com as seguintes configurações: Pressão = 200; Calor = 769; Puxar = 0; Velocidade = 140; Tempo = 100.
   2. Usando uma tesoura fina para cortar a ponta da agulha no nível onde seu diâmetro é ~30 μm. Coloque a agulha usando afiador de agulha a 20° em uma placa abrasiva de grau fino com molhar regularmente por 20 minutos.
   3. Esterilize a agulha de microinjeção empurrando 70% de etanol usando uma seringa de 10 mL com uma agulha de 26 G1/2. Utilizando uma seringa de 10 mL e agulha de 26 G1/2 carregada com óleo mineral, enchimento da agulha de microinjeção. Certifique-se de que não há bolhas na agulha de microinjeção.
   4. Monte a agulha do microinjetor no micromanipulador de acordo com as instruções do fabricante.
4. Carregue a agulha com biblioteca sgRNA viral.
   1. Pipeta 10 μL de suspensão viral em um parafilme fixado em uma superfície plana.
   2. Usando micromanipulador, expulse o óleo mineral. A presença de um pequeno volume de óleo na agulha impedirá que o lentivírus entre em contato com o pistão. Carregue cerca de 4-5 μL de suspensão viral por aspiração lenta sem bolhas de ar.
5. Anestesiar o rato grávida usando a câmara de indução de isoflurane. Defina o regulador de oxigênio para 1 L/min e vaporizador de isoflurano para 2%. Para determinar se o animal está anestesiado, verifique por pinça do dedo do dedo após ~3-5 min na câmara de indução de isoflurane.
6. Coloque o lado ventral animal anestesiado para cima na fase de cirurgia aquecida (40 °C) e aplique fitas cirúrgicas para segurar as patas no lugar com o tubo de anestesia do nariz-cone para fornecimento constante de isoflurano e oxigênio até que a cirurgia seja concluída.
7. Confirme a gravidez E9.5 se não foi feita na E8.5.
   1. Aplique uma pequena quantidade (~ 1/2 colher de sopa) de um creme de depilação no abdômen e espalhe-o sobre uma área de 3 x 3 cm usando um aplicador de ponta de algodão.
   2. Depois de 2-3 min, retire suavemente o creme com gaze ou tecido e limpe a área limpa usando PBS e 70% de etanol.
   3. Usando a sonda de ultrassom e o gel, verifique o rato grávida para o dia embrionário E9.5. Note-se que isso também pode ser feito no dia anterior na E8.5 para economizar tempo no dia da cirurgia real.
   4. Remova o gel de ultrassom e limpe a área usando BPS e depois 70% de etanol para desinfetar.
8. Injete 0,02 cc de Buprenorphine analgesic subcutâneamente na barragem do rato.
9. Expor cirurgicamente o útero
   1. Usando fórceps estéreis e tesouras, faça uma incisão vertical de ~2 cm na pele do rato.
   2. O uso de fórceps contundentes separa a pele ao redor da incisão do peritônio.
   3. Usando fórceps estéreis e tesouras, corte o peritônio.
   4. Usando fórceps contundentes, puxe suavemente o chifre do útero esquerdo e direito e conte os embriões.
   5. Reinsira a maioria dos chifres uterinos, mas deixe a extremidade distal de um chifre uterino contendo 3 embriões expostos.
   6. Usando fórceps contundentes, empurre suavemente e puxe o útero com os 3 embriões através da abertura na membrana de silicone da placa de Petri modificada.
   7. Estabilize a placa de Petri usando cubos de argila modeladora.
10. Estabilize o útero com os três embriões dentro da placa de Petri usando um molde de silicone. Achate o plugue de silicone na lateral dos embriões usando uma faca afiada.
11. Encha a placa de Petri com PBS estéril. Lave a membrana de silício na parte inferior da placa de Petri com a barriga da represa grávida, evitando assim qualquer vazamento.
12. Mova a cabeça do ultrassom para a placa de Petri ~0,5 cm em cima do embrião superior e ajuste o estágio para que a cavidade amniótica se torne claramente visível na visão do ultrassom.
13. Alinhe a agulha injetora cuidadosamente na placa de Petri modificada. Usando o micromanipulador, coloque a ponta da agulha dentro de ~5 mm do embrião superior. Em seguida, alterne a agulha para frente e para trás e mova-se para o plano onde sua ponta aparece mais brilhante na imagem de ultrassom.
14. Usando o micromanipulador empurre a agulha através da parede uterina para a cavidade amniótica.
15. Injete lentivírus contendo biblioteca sgRNA.
    1. Pré-programe o injetor a 62 nL e velocidade de injeção lenta. O microinjetor pode ser programado para injetar volumes específicos a uma velocidade lenta ou rápida.
    2. Pressione o botão Injetar 8 vezes para um total de 496 nL por embrião. Ajuste o volume às necessidades necessárias e ao título viral. Um título viral de 1 x 10⁸ pfu/mL e 496 nL de volume de injeção resultará em aproximadamente 30% de infectividade.
    3. Repita o mesmo procedimento para outros dois embriões.
    4. Levante a cabeça do ultrassom e remova o plugue de silicone.
    5. Empurre suavemente os 3 embriões para dentro do abdômen do rato usando uma troca de algodão estéril.
    6. Retire suavemente os próximos 3 embriões e repita o procedimento de injeção até que o número desejado de embriões seja injetado.
       NOTA: Não exceda 30 minutos de anestesia, pois as barragens grávidas são muito mais propensas a abortar seus embriões além desse tempo. Um cirurgião experiente pode injetar até 12 embriões dentro de 30 minutos de cirurgia.
16. Levante a cabeça do ultrassom, remova o micromanipulador com a agulha, aspire o PBS e remova a placa de petri. Usando lenços estéreis, absorva qualquer PBS que possa ter se acumulado na cavidade abdominal.
17. Feche a incisão peritoneal usando suturas absorvíveis. Use dois grampos para fechar a incisão na pele abdominal.
    NOTA: Ao realizar o ultrassom guiado em cirurgias do útero, deve-se tomar o máximo cuidado para manter um ambiente limpo, manter a esterilidade o máximo possível e evitar possíveis contaminantes. Se mais de uma cirurgia deve ser feita no mesmo dia, é importante esterilizar os instrumentos de dissecção usando um esterilizador de contas e limpar outros aparelhos que encontram tecido de rato limpo com etanol. Isso aumenta muito a maior sobrevida dos embriões pós-cirurgia. A taxa de sobrevivência do método cirúrgico descrito aqui é consistentemente entre 80-100%.
18. Cuidados pós-cirurgia.
    1. Permita que a fêmea grávida se recupere em uma gaiola aquecida e observe por 15-30 min.
    2. Verifique o canal vaginal para obter sangue, que é um sinal precoce de aborto e complicações. Para alívio da dor pós-operatório, administre o analgésico duas vezes ao dia durante dois dias após a cirurgia.
19. Identifique embriões transduzidos/recém-nascidos Rosa26-Lox-LOX-Lox-Cas9-GFP camundongos usando um microscópio de dissecação fluorescente, uma lanterna de proteína fluorescente e óculos de filtro ou por genotipagem para partículas virais integradas em clipes de ouvido ou cauda.
    NOTA: Os camundongos são melhor identificados usando microscópio fluorescente até o dia 3 pós-natal antes que o cabelo comece a crescer.
20. Para garantir cobertura suficiente para a biblioteca CRISPR, calcule a cobertura com base nos seguintes parâmetros: Ectoderme de superfície do mouse E9.5 consiste em ~150.000 células; a transdução de ~20% resulta em uma taxa mínima de dupla infecção (~1/10 células duplas infectadas)^4,5,11; com 20% de infectividade, cada embrião tem 30.000 células infectadas. Certifique-se de que pelo menos 100 células individuais sejam transduzidas com um determinado sgRNA. Por exemplo, um pool de 2000 sgRNAs requer 2 x 10⁵ células ou 6-7 animais.

4. Procedimento de sequenciamento profundo

1. Após ponto final experimental, como formação de tumor ou qualquer outro fenótipo, sacrifique o camundongo e colide o tecido de interesse. Use o kit de extração de DNA de sangue e tecido para purificar o DNA genômico seguindo o protocolo do fabricante. Antes de iniciar a extração de DNA de tumores, limpe o banco de trabalho com apagamento de DNA e trabalhe longe da área de laboratório onde plasmídeos são manipulados.
   NOTA: É importante gerar uma amostra de referência para permitir o cálculo das alterações do fold sgRNA ao longo do tempo. Embriões transduzidos 3 dias após infecção ou células transduzidas (ver passo 2. 6) podem servir como amostra de referência para determinar a representação do sgRNA na biblioteca original.
2. Use DNA genômico de 100 ng – 1,5 μg como modelo em uma reação PCR 1 pré-amplificação de 50 μL usando os primers externos listados na Tabela 1 e o programa PCR descrito na Tabela 2. Configure reação suficiente para produzir cobertura desejada.
   NOTA: Configure a reação pcr de codificação de barras em uma área dedicada separada do laboratório ou em uma capa de cultura de tecido que é completamente limpa por apagar DNA para evitar qualquer contaminação. Execute o controle negativo para cada placa PCR com água como modelo para ter certeza de que não há contaminação.
3. Acumule toda a reação do PCR 1 e execute 20 μL em um gel de 1,5% de controle para verificar a amplificação bem sucedida de uma banda de 600 bp.
4. Use 5 μL da reação PCR1 agrupada como modelo em uma reação de 50 μL de PCR 2 usando uma combinação única de primer de código de barras listada na Tabela 3 e no programa PCR descrito na Tabela 4. Execute 50 μL de reação PCR 2 em um gel de 2% de agarose e purifique a banda de 200bp usando um kit de extração de gel de acordo com as instruções do fabricante.
   NOTA: A etapa de pré-amplificação só é necessária para a amplificação de um tecido transduzido complexo. Se amplificar um único tumor que presumivelmente desenvolveu formar uma célula clonal e, portanto, contém apenas um único sgRNA, pode-se pular o PCR1 pré-amplificação e prosseguir imediatamente com PCR2.
5. Quantifique a concentração de DNA usando quantificação fluorométrica e enviada para sequenciamento profundo para a instalação de sequenciamento (por exemplo, 1 milhão de leituras por tumor).
6. Use Bowtie v1.2.3, que só permite alinhamentos não mapeados, alinhar leituras sequenciadas à biblioteca sgRNA¹³. Crie um índice de gravata borboleta usando o comando bowtie-build inserindo as sequências sgRNA no formato fasta. Mapeie as leituras usando o comando bowtie com opções -m 2 -v 1, que permite máximo dois desencontros durante o alinhamento de leitura e descarta leituras que alinham mais de uma sequência de sgRNA de biblioteca. Normalmente, mais de 80% das leituras se alinham sob esses parâmetros.
7. Use o comando de contagem MAGeCK para obter a tabela de contagem de leitura usando o arquivo alinhado como entrada¹⁴. a tabela de contagem de sgRNA pode ser usada para análise a jusante, como, determinando o diferencial sgRNA's (MAGeCK) e encontrando genes essenciais (BAGEL).

Resultados

A Figura 1A mostra o design dos oligonucleotídeos para multiplexar várias bibliotecas CRISPR personalizadas de forma econômica em um único chip oligo de 12k ou 92k. Uma vez selecionados os sgRNAs (código de cor azul), os oligonucleotídeos são projetados com locais de restrição (BsmBI cor laranja) e pares de primer PCR específicos da biblioteca (código de cor verde). Várias bibliotecas podem ser projetadas usando uma combinação única de pares de primer para multiplexing em um único chip oligo...

Discussão

A edição do genoma CRISPR/Cas9 tem sido amplamente utilizada em estudos in vitro e in vivo para investigar funções genéticas e processos celulares. A maioria dos estudos in vivo utiliza células editadas por genes CRISPR/Cas9 enxertadas em um modelo animal (aoenxerto ou xenoenxerto). Embora esta seja uma ferramenta poderosa para estudar a genética do câncer e funções celulares, ela ainda carece do microambiente do tecido nativo e pode provocar ferimentos e/ou respostas imunológicas.

Para supera...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Filtro de 0,45 mícron	Sigma	S2HVU02RE
chip oligo 12k ou 92k	Customarray Inc. (Genscript)
Placas de cultura de células de 15 cm	Corning
293FT	Invitrogen	R70007
293NT	Systems Biosciences	LV900A-1
Fosfatase alcalina	NEB	M0290L
Amplicilina	Fisher Scientific	BP1760-25
ATP	NEB	9804S
BsmBI	NEB	R0580L
Sutura intestinal crômica	Covidien
Sequenciamento profundo (Next-Seq ou Hi-Seq)	Kit
	Zymo Research	D4008
Kit de extração de DNA de sangue e tecido DNAesy	Qiagen	69506
Células eletrocompetentes Endura	Lucigen	60242-1
Capilares de vidro	Drummond	3-000-203-G/X
Células HEK293T	ATCC	CRL-3216
Centrífuga de alta velocidade	Beckman Coulter	MLS-50
LB Agar	Wisent Technologies	800-011-LG
Extrator de micropipeta	Sutter Instrument	P97
Óleo mineral	Sigma	M5904
Mini-prep plasmídeo Kit	Frogga Bio	PDH300
Sistema de anestesia de oxigênio	de camundongo Visual Sonics
Nanoject II micromanipulador	Drummond
NEBuffer 3.1 ( Tampão para BsmBI)	NEB	R0580L
Apontador de agulhas	Sutter Instrument	BV-10
Kit de limpeza de oligo	Zymo research	D4060
PAGE purificado illumina sequenciamento primer	IDT DNA
PEI (polietilenoimina)	Sigma	408727-100ML
Permoplast massa			de modelar
Petrídish com abertura central	Visual Sonics
pMD2.G	Addgene	12259
psPAX2	Addgene	12260
Q5 Polimerase 2x Master mix	NEB	M0494L
Qubit Quantificação Fluorométrica	Invitrogen	Q33327
Plugue de silicone semicircular	Corning
Membrana de silicone	Visual Sonics
T4 DNA ligase	NEB	M0202L
Tubos de ultra-centrífuga	Beckman Coulter	344058
Vevo2000 sistema de ultrassom	Visual Sonics