Artigo de método

Isolamento de Histone do tecido da folha de sorgo para perfil de espectrometria de massa de top down de potenciais marcadores epigenéticos

DOI:

10.3791/61707

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4 de março de 2021

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1Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 2DOE-Joint Genome Institute, Lawrence Berkeley Laboratory, 3Kearney Agricultural Research and Extension Center, University of California Agriculture and Natural Resources, 4West Side Research and Extension Center, University of California, 5Department of Plant Sciences, University of California, Davis, 6Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley

Neste artigo

Resumo

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O protocolo foi desenvolvido para extrair efetivamente histonas intactas de materiais de folhas de sorgo para o perfil de modificações pós-translacionais de histona que podem servir como potenciais marcadores epigenéticos para ajudar as culturas resistentes à seca de engenharia.

Resumo

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Histones pertencem a uma família de proteínas altamente conservadas em eucariotes. Eles embalam DNA em nucleosósmos como unidades funcionais de cromatina. Modificações pós-translacionais (PTMs) de histones, que são altamente dinâmicas e podem ser adicionadas ou removidas por enzimas, desempenham papéis críticos na regulação da expressão genética. Nas plantas, fatores epigenéticos, incluindo PTMs histonas, estão relacionados às suas respostas adaptativas ao meio ambiente. Compreender os mecanismos moleculares do controle epigenético pode trazer oportunidades sem precedentes para soluções inovadoras de bioengenharia. Aqui, descrevemos um protocolo para isolar os núcleos e purificar histones do tecido da folha de sorgo. As histonas extraídas podem ser analisadas em suas formas intactas por espectrometria de massa superior para baixo (MS) juntamente com cromatografia líquida de fase invertida on-line (RP) (LC). Combinações e estequiometria de múltiplos PTMs na mesma histona proteoforma podem ser facilmente identificadas. Além disso, o recorte da cauda de histone pode ser detectado usando o fluxo de trabalho LC-MS de cima para baixo, produzindo assim o perfil global PTM de histones centrais (H4, H2A, H2B, H3). Aplicamos este protocolo anteriormente para traçar o perfil de PTMs histítonos a partir de tecido de folha de sorgo coletados de um estudo de campo em larga escala, com o objetivo de identificar marcadores epigenéticos de resistência à seca. O protocolo poderia potencialmente ser adaptado e otimizado para sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina (ChIP-seq), ou para estudar PTMs de histona em plantas semelhantes.

Introdução

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Espera-se que a gravidade e a frequência crescentes da seca afetem a produtividade das culturas cereais1,2. O sorgo é uma cultura de alimentos e energia de cereais conhecida por sua excepcional capacidade de suportar condições limitantes da água3,4. Estamos buscando a compreensão mecanicista da interação entre o estresse da seca, o desenvolvimento das plantas e a epigenética das plantas desorgo bicolor (L.) Moench). Nosso trabalho anterior demonstrou fortes conexões entre microbioma vegetal e rizosfera na aclimatação da seca e respostas no nív....

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Protocolo

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1. Preparando material de folha de sorgo

NOTA: As plantas de sorgo foram cultivadas em solo no campo em Parlier, CA.

  1. Colete folhas de sorgo das plantas em tubos de centrífugas de 50 mL e congele imediatamente o tubo em nitrogênio líquido. Coletar tecido de folha arrancando a terceira e quarta folha totalmente emergida do leme primário.
    NOTA: Mais detalhes sobre condição de campo, crescimento amostral e coleta podem ser encontrados no relatório publicado18.
  2. Moer folhas com nitrogênio líquido e transferir imediatamente para um tubo de centrífuga.
  3. Armazene a folha de terra a -80 °C até u....

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Resultados

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Seguindo o protocolo, as histonas podem ser extraídas e identificadas por meio da análise LC-MS. Os dados brutos e os resultados processados estão disponíveis no MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) via adesão: MSV000085770. Com base nos resultados toppic da amostra representativa (disponível também no MassIVE), identificamos 303 proteoformes histona (106 H2A, 72 H2B, 103 H3 e 22 proteoforms H4). Proteoformes ribossômicos co-purificados também foram detectados, tipicamente elundo no início da LC. Eles geralmente consistem.......

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Discussão

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O protocolo apresentado descreve como extrair histonas de amostras de folhas de sorgo (ou mais geralmente folha de plantas). Espera-se que o rendimento médio da histona seja de 2 a 20 μg por material de folha de sorgo de 4 a 5 g. Os materiais são suficientemente puros para a análise de histona a jusante por LC-MS (principalmente histones com ~20% de contaminação por proteína ribossômica). O rendimento mais baixo pode ser obtido devido a variações amostrais ou possíveis falhas/falhas ao longo do protocolo. Manter a integr.......

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Agradecimentos

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Agradecemos a Ronald Moore e Thomas Fillmore por ajudarem em experimentos de espectrometria em massa, e Matthew Monroe pela deposição de dados. Esta pesquisa foi financiada por subsídios do Departamento de Energia dos EUA (DOE) Pesquisa Biológica e Ambiental através do projeto Controle Epigenético da Resposta à Seca em Sorgo (EPICON) sob o número de premiação DE-SC0014081, do Departamento de Agricultura dos EUA (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D), e através do Joint BioEnergy Institute (JBEI), uma instalação patrocinada pelo DOE (Contrato DE-AC02-05CH11231) entre o Lawrence Berkeley National Laboratory e o DOE. A pesquisa foi realizada utilizando-se o Laboratório de Ciênc....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AcetonitrilaFisher ChemicalA955-4L
Ditiotreitol (DTT)Sigma43815-5G
EDTA, solução de 500mM, pH 8,0EMD Millipore Corp324504-500mL
Ácido fórmicoThermo Scientific28905
Cloridrato de guanidinaSigmaG3272-100G
MgCl2< / sub >SigmaM8266-100G
Fosfato de potássio, coquetel dibásicode inibidorP3786-100G
, comprimidos completosRoche5892791001
Butirato de sódioSigma303410-5GUsado para inibidor de histona desacetilase
Cloreto de sódio (NaCl)SigmaS1888
Sódio FlúorSigmaS7020-100GUsado para inibidor de fosfatase
Ortovanadato de sódioSigma450243-10GUsado para inibidor de fosfatase
SacaroseSigmaS7903-5KG
Tris-HClFisher ScientificBP153-500 g
Triton X-100SigmaT9284-100ML
Resina de troca catiônica fraca, malha 100-200 analítico (BioRex70)Bio-Rad142-5842
DescartáveisColuna de
cromatografia (Bio-Spin)BIO-RAD732-6008
Malha 100 pano de filtroMillipore SigmaNY1H09000Isso faz parte do kit Sigma (catálogo # CELLYTPN1) para extração de núcleos de plantas. Filtros semelhantes com o mesmo tamanho de malha podem ser usados.
Pontas de micropipeta (P20, P200, P1000)Tubo Sigma
, 50mL/15mL, Centrífuga, Tubo CônicoGenesee Scientific28-103
, Microcentrífuga, 1.5/2 mLSigma
Equipment
Balança AnalíticaFisher Scientific01-912-401
Béqueres ( 50mL - 2L)
Microcentrífuga com resfriamentoMicropipetas
Centrífuga de balde oscilante com resfriamentoFisher Scientific
VortexFisher Scientific50-728-002
de protease Sigma Fisher Scientific 13-690-006 Banho-maria Sonicator Fisher Scientific 15-336-120

Referências

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  1. Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
  2. Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Clim....

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