Artigo de método

Mudanças de temperatura incremental para reprodução e desova máxima em Astyanax mexicanus

DOI:

10.3791/61708

⸱

14 de fevereiro de 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Maryland

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo descreve as condições básicas de laboratório e protocolos para um regime de temperatura incremental para estimular a desova máxima no tetra mexicano Astyanax mexicanus, que é um modelo emergente para estudos de desenvolvimento e evolutivos.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O tetra mexicano, Astyanax mexicanus,é um sistema modelo emergente para estudos em desenvolvimento e evolução. A existência de morfas de superfície de olhos (peixes superficiais) e cavernas cegas (peixes-caverna) nesta espécie apresenta uma oportunidade para interrogar os mecanismos subjacentes à evolução morfológica e comportamental. Os peixes das cavernas desenvolveram novos traços construtivos e regressivos. As mudanças construtivas incluem aumentos nas papilas gustativas e mandíbulas, órgãos sensoriais de linha lateral e gordura corporal. As mudanças regressivas incluem perda ou redução de olhos. pigmentação de melanina, comportamento de escolaridade, agressão e sono. Para interrogar experimentalmente essas mudanças, é crucial obter um grande número de embriões gerados. Desde que os peixes originais da superfície de A. mexicanus e peixes das cavernas foram coletados no Texas e no México na década de 1990, seus descendentes têm sido rotineiramente estimulados a procriar e desovar um grande número de embriões bimestriamente no laboratório Jeffery. Embora a reprodução seja controlada pela abundância e qualidade dos alimentos, ciclos claro-escuros e temperatura, descobrimos que as mudanças de temperatura incrementais desempenham um papel fundamental no estímulo à desova máxima. O aumento gradual da temperatura de 72 °F para 78 °F nos primeiros três dias de uma semana de reprodução fornece dois ou três dias consecutivos de desova com números máximos de embriões de alta qualidade, que é seguido por uma diminuição gradual da temperatura de 78 °F para 72 °F durante os últimos três dias da semana de desova. Os procedimentos mostrados neste vídeo descrevem o fluxo de trabalho antes e durante uma semana de reprodução laboratorial para desova estimulada pela temperatura incremental.

Introdução

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O teleost Astyanax mexicanus tem uma forma de habitação superficial (peixes superficiais) e muitas diferentes cavernas cegas (peixes das cavernas)formam 1,2. Os peixes das cavernas evoluíram na escuridão perpétua e sob limitações alimentares, resultando no aparecimento de novos traços construtivos e regressivos3. Os traços construtivos incluem aumentos no gosto e tamanho da mandíbula, órgãos sensoriais da linha lateral e reservas de gordura. Os traços regressivos incluem a perda ou redução da pigmentação de melanina, olhos e comportamentos, como sono, escolaridade e agressão. Um atributo do sistema Astyanax é a fertilidade completa entre as duas formas, permitindo o uso de mapeamento de traço quantitativo loci (QTL) para determinar a região genômica(s) associada à evolução construtiva e regressiva4,5,6,7. A. mexicanus oferece um sistema vantajoso para estudar o desenvolvimento porque pode ser induzido a desovar com frequência em laboratório. Os embriões de A. mexicanus são translúcidos, ligeiramente maiores que os de zebrafish, produzidos em grandes quantidades, e se desenvolvem em adultos sexualmente maduros em aproximadamente 8-12 meses. Seu período de capacidade máxima de desova é de cerca de 5 anos. Este protocolo descreve o fluxo de trabalho necessário em uma instalação de cultura A. mexicanus durante uma semana típica de reprodução e inclui os detalhes da manutenção do sistema de peixes e o regime de controle de temperatura para desova máxima.

A. mexicanus é um peixe tropical que vive em rios originários de calcários (peixes superficiais) e em piscinas em cavernas de calcário (peixes-caverna)8. O calcário dissolve-se para produzir água dura, e A. mexicanus prospera em água dura. Peixes adaptados a condições de água dura podem tolerar uma série de condições salgadas, mas geralmente se reproduzem em específicas9. A indução do comportamento de desova é realizada por uma combinação de fatores. Como os peixes são a sangue frio e dependem de seu ambiente para manter a homeostase, seu metabolismo é sensível às mudanças ambientais e eles reagem mais rapidamente aos estressores10. A. mexicanus deve ser cultivado em sistemas aquáticos sob condições cuidadosamente reguladas de fluxo de água, pH, condutividade, pressão osmótica, iluminação e temperaturas da água.

No laboratório Jeffery, os peixes são mantidos em dois sistemas de água corrente: (1) um "sistema de bebês" para peixes adultos jovens antes da maturidade sexual e (2) um sistema adulto (ou principal) para adultos sexualmente maduros e reprodutores. O "sistema baby" consiste em tanques de 8 L e 15 L fornecidos com água corrente. O "sistema de bebês" é semeado por jovens jovens metamorfosizados cultivados a partir de larvas em tanques menores (1-10 L), nos quais a água é trocada semanalmente. Larvas, fritas e juvenis são extremamente dependentes de alimentos e devem ser alimentadas com comida viva (camarão salgado) uma vez por dia para garantir uma alta taxa de sobrevivência. Jovens jovens do "sistema de bebês" são colocados no sistema adulto após cerca de 1-1,5 anos. Em um primeiro momento, são alimentados com flocos de tetra pulverizados, e após um crescimento adicional são transferidos para o regime regular de alimentação de adultos. A maturidade sexual pode ser avaliada pelo volume abdominal em mulheres, e os métodos para determinar o sexo foram descritos11. No sistema adulto, a água é trocada automaticamente em tanques de 42 L 3 vezes por período de 24 horas. O sistema adulto é monitorado diariamente por inspeção visual e leituras automáticas de temperatura, pH e condutividade de sondas. O pH ideal é em torno de 7,4 e pode variar entre 6,8-7,5, a temperatura base do sistema é de 72/73 °F, e a condutividade ideal varia entre 600-800 mS. Leituras automáticas são exibidas em uma tela controladora, e verificações visuais da pressão da água são lidas em medidores de fluxo distribuídos por todo o sistema. Verificações independentes sobre a qualidade da água são feitas semanalmente testando a temperatura e medindo parâmetros de qualidade da água para pH, amônia e nitrato usando um teste colorimétrico. Os níveis de amônia e nitrato são mantidos em ou perto de zero, adicionando bactérias benéficas (por exemplo, Ciclo Nutafin) ao sistema. A iluminação da sala é controlada por um temporizador ajustado a períodos de luz e 10 horas escuras de 14 horas. Além dos parâmetros gerais de qualidade da água mencionados acima, as seguintes considerações precisam de atenção especial durante uma semana de reprodução.

A primeira consideração é o fotoperóuodo, pois os peixes (até mesmo peixes-caverna em laboratório) dependem de ciclos de luz para definir seu relógio circadiano. Os ritmos circadianos podem afetar tudo, desde a reprodução e alimentação até a saúde do sistema imunológico12,13 e devem ser consistentes para o máximo de benefícios para a saúde. Os peixes são mantidos em um sistema de água corrente em um fotoperíodo escuro de 14 horas e luz. Os peixes superficiais geralmente começam a desovar uma hora após o sistema ter sido escurecido, e a luz introduzida durante este período pode interferir e terminar a desova. A desova de peixes cegos das cavernas é menos perturbada pela luz. Em comparação com a desova de peixes superficiais, a desova de peixes das cavernas é adiada, geralmente começando de quatro a cinco horas após o sistema ter sido escurecido.

A segunda consideração é a nutrição. Peixes adultos são normalmente alimentados com uma dieta de tetra flocos uma vez por dia. Antes da desova, os peixes são alimentados com uma dieta rica em proteínas complementada com quantidades extras de flocos de tetra e outros alimentos: flocos de gema de ovo e ocasionalmente vermes-pretos da Califórnia vivos(Lumbriculus variegatus) para compensar a perda de proteínas devido à produção de ovos durante o ciclo anterior de desova. Durante a semana de reprodução, os peixes são alimentados duas vezes por dia, uma pela manhã e outra à tarde/noite. A alimentação de peixes apenas uma vez por dia, mas com uma única porção muito grande de alimentos deve ser evitada, pois isso pode causar desnutrição14.

A terceira consideração é o espaço. Os requisitos do espaço baseiam-se na massa corporal média de um adulto, bem como em considerações comportamentais, como se os peixes têm comportamento de escolaridade ou comportamento agressivo. Tanques superlotados ou sub-aglomerados podem levar a uma maior agressão e estresse constante, tornando os peixes vulneráveis a ferimentos de seus companheiros de tanque e relutantes em participar na desova15. Normalmente abrigamos 10-20 peixes por tanque 42 L.

A quarta consideração é a temperatura. Como mencionado acima, os peixes são animais de sangue frio e dependem do meio ambiente para manter a temperatura corporal. Como a temperatura tem um efeito direto nos processos metabólicos, mudanças de temperatura podem desencadear alterações comportamentais em peixes16. Este programa de reprodução consiste em ciclos de duas semanas de temperatura: a primeira semana introduz um pico de temperatura para 78 °F, e a próxima semana mantém uma temperatura estática de 72 °F. Durante a primeira semana (de reprodução), redes de reprodução com bordas plásticas são colocadas no fundo dos tanques todas as noites. As redes de reprodução servem como uma barreira entre os peixes nos tanques e os ovos desovados, que de outra forma seriam consumidos. A temperatura é elevada de 2 °F por dia para uma máxima de 78 °F até o meio da semana, e a desova é induzida de acordo com o ciclo de luz nas primeiras 2-3 noites desta semana. A temperatura é então reduzida em incrementos de 2 °F para 72 °F durante os demais dias da semana, e a temperatura base é mantida até o início da próxima semana de reprodução. A reprodução geralmente é estimulada não mais do que duas vezes por mês para permitir que o peixe se recupere.

No geral, este método permite a desova de grandes quantidades de embriões da mais alta qualidade durante um período mais longo de tempo.

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Protocolo

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Este procedimento foi aprovado pelas diretrizes de Cuidados Institucionais de Animais da Universidade de Maryland, College Park (Atualmente IACUC 469 #R-NOV-18-59; Projeto 1241065-1).

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Figura 1. Calendários durante uma semana de reprodução e uma semana sem reprodução. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Segunda-feira

  1. Às 9h10, realize testes de água e etapas 1.1.1-4 abaixo.
    1. Grave as temperaturas da sala, do tanque e do reservatório usando um termômetro.
    2. Registre os níveis de amônia, nitrato e nitrato com um kit de teste colorimétrico.
    3. Regisso o pH do sistema de monitoramento, bem como o kit de teste colorimétrico.
    4. Registosos do monitor carboy e do monitor do sistema principal.
  2. A partir das 10:00, alimente todos os peixes.
    1. Alimente todos os peixes no sistema adulto com flocos de tetra, esmagando os flocos nos tanques com peixes jovens. Alimente apenas tantos flocos quanto um tanque de peixe pode consumir completamente em 3-5 minutos, cerca de uma "pitada de dedo".
  3. Verifique a incubadora usada para abrigar dedos de embriões em desenvolvimento e troque a água, se necessário.
    1. Abra a incubadora de embriões e verifique os níveis de água em todos os reservatórios. Se eles estão ficando sem água, adicione água do sistema. Verifique as configurações de temperatura da incubadora. Levante os embriões a 73-77 °F (23-25 °C).
  4. Alimentação ao vivo limpa.
    1. Para limpar as larvas, remova as bacias de Tupperware descobertas contendo suas culturas da geladeira de alimentação ao vivo e despeje o excesso de água acima dos aglomerados de vermes na pia. Usando água destilada, suspenda e enxágue os vermes repetidamente até que a água de derramamento esteja limpa.
    2. Adicione água limpa suficiente para que os aglomerados de vermes estejam cerca de metade cobertos. Substitua os vermes restantes na geladeira de alimentação ao vivo, descobertos.
  5. Alimente peixes.
    1. Pelo menos 30 minutos após a primeira alimentação, alimente os peixes nos tanques em que a reprodução é desejada com flocos de gema de ovo, vermes negros, ou ambos. Adicione um "dedo" de flocos de gema por tanque. Adicione aglomerados de vermes-negros suficientes para permitir que cada peixe no tanque consuma cerca de 5-10 vermes.
  6. Às 10:00 às 13:00, a temperatura da água é de 74 °F.
  7. Esfregue os tanques de reprodução conforme necessário e coloque as redes de reprodução.
  8. Limpe os tanques e coloque as redes pelo menos uma hora após a última alimentação. Limpe todos os tanques em que as redes são colocadas de antemão. Coloque as redes de reprodução cuidadosamente para não interferir com o fornecimento de ar para o tanque.

2. Terça-feira

  1. Recolhe os embriões e lava todas as redes de reprodução.
    1. Às 9:10 am, remova as redes de reprodução do fundo dos tanques do sistema adulto. Enxágue suavemente os embriões em uma rede portátil usando a mangueira presa ao carboy, e inverta a rede portátil em uma tigela de água limpa do sistema para expulsar os embriões.
    2. Colete e lave cada conjunto de embriões e, em seguida, coloque em uma tigela de água limpa do sistema contendo 0,00003% azul de metileno (água azul). Se houver um número excepcionalmente grande de embriões de um único tanque, separe-os em várias tigelas. A concentração de embriões vivos deve ser de cerca de 100 por 200 mL de água azul em cada dedo.
    3. Estime o tempo de fertilização encenando os embriões sob um microscópio usando a tabela de tempo de desenvolvimento A. mexicanus publicada17.
    4. Monitore as tigelas contendo embriões com frequência. Remova embriões e detritos mortos ou deformados, como alimentos não comidos ou fezes, com uma pipeta Pasteur. Troque a água azul em dedos com frequência.
    5. Coloque as tigelas em uma incubadora por 5-7 dias. Neste momento, a gema tem sido usada e a alimentação de culturas com camarão de salmoura viva é necessária para o desenvolvimento.
  2. Pegue dados de desova.
    1. Para cada tanque que derruba embriões, regisse as seguintes informações.
      1. Regissua a data e o número do tanque.
      2. Regisso número aproximado de embriões caiu (Figura 2):
        Alto (500+)
        Médio (200-500)
        Baixo (<200)
      3. Registo da qualidade dos embriões caiu (Figura 2):
        Alta (>75% viva)
        Médio (25-50% vivo)
        Baixo (<25% vivo)
      4. Estime o tempo original de desova consultando a tabela de encenação astyanax mexicanus 17.
      5. Regissu o recorde da temperatura que o sistema foi definido quando o peixe desovar.
  3. Alimente todos os peixes.
  4. Coloque a temperatura da água em 76 °F.
  5. Prepare a transmissão ao vivo.
  6. Alimente peixes #2.
  7. Colher alimentos e detritos em excesso de tanques e esfregar antes de repor redes.

3. Quarta-feira

  1. Repita as etapas 2.1-2.2. Colete embriões e lave todas as redes de reprodução.
  2. Pegue dados de desova como antes.
  3. Faça testes de água como antes.
  4. Alimente todos os peixes.
  5. Coloque a temperatura da água em 78 °F.
  6. Prepare a transmissão ao vivo.
  7. Verifique os embriões na incubadora.
    1. Limpe e troque a água dos embriões em dedos que eventualmente serão usados para repor o estoque geral de reprodução de adultos. Use água do sistema tratado com azul de metileno.
  8. Alimente peixes de novo.
  9. Limpe os tanques conforme necessário e reinicie as redes.

4. Quinta-feira

  1. Repita as etapas 2.1-2.2. Coletar embriões e lavar e armazenar redes de reprodução.
  2. Pegue dados de desova como antes.
  3. Coloque a temperatura da água em 76°F.
  4. Limpe a transmissão ao vivo.
  5. Limpe todos os tanques individuais.
  6. Verifique os embriões na incubadora.
  7. Alimente peixes #2.

5. Sexta-feira

  1. Alimente todos os peixes.
  2. Afina a temperatura da água para 74 °F.
  3. Limpe a transmissão ao vivo.
  4. Verifique os embriões na incubadora.

Sábado, 6.

  1. Alimente peixes.

Domingo, 7.

  1. Alimente peixes.

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Resultados

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Nós geralmente criamos e desoríamos os descendentes de peixes superficiais originalmente coletados em Nacimiento del Rio Choy em San Luis Potosi, México (peixe superficial rio Choy) e San Solomon Springs em Balmorhea State Park, Texas (peixes de superfície do Texas) e peixes-caverna derivados de Cueva de El Pachón (peixe da caverna Pachón) em Tamaulipas, México, e Cueva de los Sabinos (los Sabinos peixe das cavernas) e Sotano de la Tinaja (peixe da caverna Tinaja) em San Luis Potosi México.

Ao...

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Discussão

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Astyanax mexicanus é um novo modelo biológico que gera com frequência e pode ser criado facilmente no laboratório1,2. Como estamos interessados nos mecanismos de desenvolvimento que estão por trás de mudanças evolutivas em peixes das cavernas A. mexicanus, a produção e o uso de embriões é vital para nossos objetivos de pesquisa. O objetivo principal de manter um estoque adulto de peixes é a produção de embriões e frituras jovens para uso em expe...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a David Martasian, Diedre Heyser, Amy Parkhurst, Craig Foote e Mandy Ng por contribuições valiosas para o laboratório Jeffery A. mexicanus culture facility. A pesquisa no laboratório Jeffery é atualmente apoiada pela concessão do NIH EY024941.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BlackwormsEastern Aquatics, Lancaster, PANenhum
Redes de reproduçãofeitos sob medida
AquaCave Lake Forest, IL.Nenhum
kit de teste colorimétricoPetcoSKU:11916API Kit de teste de pH de água doce
Flocos de gema de ovoPentair, Minneapolis, MNNenhum
FingerbowlsCarolina Biological Supply741004pratos de cultura, 4,5 pol, 250 mL
Redes portáteisQualquer incubadora de pet shop
para embriõesFisher Scientific51-029-321HPM405 L
Sais marinhos oceânicos instantâneosSpectrum Brands, Blacksburg, VANenhum
Azul de MetilenoSigma-Aldrich, St. Louis, MOM9140
Pipetas PasteurFisher Scientific13-678-205.75 pol.
Solução de imersão líquidaQualquer Pet Store
Nutrafin CycleAmazonNenhumImpulso bacteriano
Geladeira para alimentação ao vivoQualquer fonte
EstereomicroscópioQualquer fonte
TermômetroQualquer fonte
Tetra Tropical CrispsSpectrum Brands, Blacksburg, VANenhum
Ovos de artêmia

Referências

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