Summary
Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) ger en kraftfull plattform för bakteriestudier, vilket gör det möjligt att uppnå nanoskalaupplösning. Båda, kartläggning av subcellulära förändringar (t.ex. vid celldelning) samt jämförande studier av kemisk sammansättning (t.ex. som härrör från läkemedelsresistens) kan utföras på en enda cellnivå i bakterier.
Abstract
Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) är en ny kombinatorisk teknik som möjliggör samtidig karakterisering av fysiska egenskaper och kemisk sammansättning av prov med nanoskalaupplösning. Genom att kombinera AFM med IR övervinns den rumsliga upplösningsbegränsningen för konventionell IR, vilket gör det möjligt att uppnå en upplösning på 20–100 nm. Detta öppnar dörren för ett brett spektrum av nya tillämpningar av IR mot sondering av prover som är mindre än flera mikrometer, tidigare ouppnåeliga med hjälp av konventionell IR-mikroskopi. AFM-IR är i högsta grad lämplig för bakterieforskning och ger både spektral- och rumslig information på encellig och intracellulär nivå. De ökande globala hälsoproblemen och den ogynnsamma framtida förutsägelsen om bakteriella infektioner, och särskilt den snabba utvecklingen av antimikrobiell resistens, har skapat ett akut behov av ett forskningsverktyg som kan fenotypisk sondering på encellig och subcellulär nivå. AFM-IR erbjuder potential att tillgodose detta behov genom att möjliggöra detaljerad karakterisering av kemisk sammansättning av en enda bakterie. Här tillhandahåller vi ett komplett protokoll för provberedning och datainsamling av enstaka spektra och kartläggningsmodalitet, för tillämpning av AFM-IR mot bakteriestudier.
Introduction
Bakterier är encelliga prokaryota organismer, som förekommer i olika former och storlekar, vanligtvis i intervallet flera hundra nanometer till mikrometer. De finns i en mängd olika livsmiljöer och är avgörande för livets existens. Inom människokroppen är majoriteten av bakterierna som finns i tarmen ofarliga och många är faktiskt fördelaktiga1. Flera bakteriearter är dock patogena och orsakar en rad infektionssjukdomar. Bakteriella infektioner kan leda till utveckling av sepsis och septisk chock: ett livshotande tillstånd, som härrör från kroppens svar på en infektion2. Sepsis är ett globalt stort hälsohot, med hög prevalens över hela världen och svår dödlighet. Bara under 2017 registrerades uppskattningsvis 50 miljoner fall av sepsis över hela världen, och 11 miljoner av dem ledde till döden (cirka 20 %)2. Dessutom visade sig en minskning av patientens överlevnadschanser, på grund av fördröjd behandling, inträffa på etttimligt sätt 3,4.
Bakteriella infektioner behandlas med antibiotika. Svårighetsgraden av potentiella konsekvenser av bakteriella blodomlopp infektioner (BSIs), tillsammans med en tydlig betydelse av snabb inledandet av antimikrobiell terapi, uppmanar behovet av omedelbar antibiotika administration. Men eftersom de nuvarande diagnostiska metoderna som används i klinisk praxis (t.ex. blododling) kräver en relativt lång tid, sker antibiotika administrering ofta före positiv BSI-diagnos5. Denna faktor leder till omfattande överanvändning av antibiotika, vilket tillsammans med överdriven antibiotikaanvändning inom andra sektorer som jordbruk skapar ett allvarligt evolutionärt tryck mot utvecklingen av antimikrobiell resistens (AMR)6,7. Amr är för närvarande en av de mest akuta globalahälsoproblemen 7,8 och beräknas 2050 bli den ledande dödsorsaken9. Utvecklingen av resistens, tillsammans med spridningen av ANTIR-stammar sker i en alarmerandetakt 7,8,9 och överstiger överlägset upptäcktshastigheten för nya antibiotika10. Nya resistenta fenotyper växer ständigt fram över hela världen, medan
forskning som är avsedd att förstå de förändringar som rör den nya forskningen ofta är långsam och begränsad av tillgängliga metoder11. Dessutom fokuserar de vanliga metoderna, såsom polymeraskedjereaktion (PCR) och hela gensekvensering (WGS), endast på genotypiska förändringar. Dessa är inte tillräckliga för att avslöja mekanismerna för resistens11, vilket leder till ett brådskande behov av ett forskningsverktyg som gör det möjligt att förstå bakteriernas kemiska sammansättning.
Infraröd spektroskopi (IR) ger en molekylär karakterisering av provet och är därmed en lovande kandidat för fenotypisk bakteriell sondering. Sedan dess tidigatillämpningar 12, visades en stor magnitud av exempel på dess användning ilitteraturen 13,14. Dessa inkluderar fenotypisk-baserad identifiering av bakterier påsläkte 15,art16, och stam17,18 nivå. Den rumsliga upplösningen av konventionell IR är dock begränsad till flera mikron på grund av våglängdsdiffraktionsgränsen för rumsligupplösning 19. Eftersom storleken på majoriteten av bakterierna ligger under den gränsen (t.ex. Staphylococcus aureus ≈ 400 nm i diameter) är konventionell IR inte tillämplig för sondering på encellig eller intracellulär nivå.
Begränsningen av rumslig upplösning övervanns nyligen genom att kombinera IR-spektroskopi med Atomic Force Microscopy (AFM-IR). I det här fallet detekteras IR-absorptionen indirekt, genom termisk expansion av materialet19,20,21,22. I korthet resulterar absorptionen av IR-strålning i en lokal temperaturökning. Detta kan mätas antingen direkt23 eller genom mätning av svängning av AFM-kantileversonden, som härrör från kraftimpuls skapad av IR-absorption20,21. Den kombinatoriska AFM-IR-tekniken gör det möjligt att uppnå rumslig upplösning som närmar sig 20 nm, vilket ger samtidig information om lokala fysiska egenskaper hos ett prov (AFM) och dess kemiska sammansättning (AFM-IR). Samling av båda, enstaka spektra från utvalda platser och kartläggning av intensiteten hos valda vågnummervärden inom ett valt område är möjliga.
Med tanke på den uppnåeliga rumsliga upplösningen av AFM-IR är det uppenbart att tekniken öppnar möjligheten till kemisk/ fenotypisk sondering av enstaka bakterieceller och deras intracellulära sammansättning24. Hittills har flera exempel på tillämpningen av AFM-IR för enskilda bakterier visats i litteraturen19,20,21,22,25,26,27,28. Dessa omfattar enkelspektral analys19,21,22 och kartläggning på subcellulärnivå 19,22,25,26,27,28. Till exempel har förmågan att upptäcka intracellulära lipid vesiklar27 och virus28 inom enstaka bakterie beskrivits. Dessa resultat visar nyttan av AFM-IR för nanoskala studier av enskilda bakterier och kliniskt relevanta patogener19.
Därför presenterar vi en provberednings- och insamlingsmetod för AFM-IR-data av multilager,monoskikt och encelliga bakteriella prover. Protokollet som beskrivs häri tillämpades för att studera olika arter av bakterier22 och förändringarna i deras kemiska sammansättning. I synnerhet undersöktes in vivo utveckling av vancomycin resistens och daptomycin icke-mottaglighet i kliniska par av S. aureus19. Båda, vancomycin intermittent resistens och daptomycin icke-mottaglighet i S. aureus (VISA och DpR) framkom relativt nyligen, efter ökad användning och införande av dessa antibiotika till kliniker, utgör ett betydande medicinskt problem. Dessutom är mekanismen för daptomycin icke-mottaglighet fortfarande svårfångad, vilket hinder för alternativ läkemedelsutveckling19,29. Det presenterade protokollet fokuserar på tillhandahållande av tillförlitliga AFM-IR-spektra av enskilda bakterier, som ytterligare kan analyseras med hjälp av en mängd olika kemometriska metoder, enligt de experimentella målen. Det inkluderar dessutom kartläggningsmetoden, som är tillämplig för intracellulära studier.
Protocol
Allt arbete som utförs med patogena bakterier bör utföras med lämpliga säkerhetsåtgärder på plats. Dessa inkluderar arbete i ett laboratorium med adekvat biosäkerhetsnivå och i en biosäkerhetshytt (PC2) samt noggrann dekontaminering av arbetsområdet med lämpligt desinfektionsmedel, t.ex. 80% etanollösning. Lämplig personlig skyddsutrustning måste bäras hela tiden.
1. Beredning av lösningsmedel och material
- Lösningsmedel: Använd ultrapurvatten som lösningsmedel. Använd renat vatten, autoklaverat före försöket för att undvika eventuell korskontaminering.
- Substrat: Använd något av dessa substrat för AFM-IR, t.ex. ZnSe, CaF2,BaF2,etc. Eftersom AFM-IR i princip är en icke-destruktiv teknik kan man tillämpa en mängd andra forskningsverktyg på samma prov efter AFM-IR-analys. Till exempel kan korrelation av resultaten med Raman spektroskopi utföras om Raman grade CaF2 eller BaF2 bilder används.
- Använd glasflaskor istället för plaströr eftersom plast kan förorena provet.
2. Provberedning för AFM-IR
- Tillväxt/inkubation av prov
- Odla bakterier i flytande media eller på fasta plattor. Välj typ av medium, tillväxtförhållanden (t.ex. temperatur, tillgång till syre) och tillväxttid enligt de specifika kraven för de arter av bakterier som under utredning. Till exempel, för S. aureus Heart Infusion (HI) agar plattor kan användas, med tillväxt för 16 h i 37 °C under aeroba förhållanden.
OBS: För att uppnå bästa resultat bör tillväxten/inkubationen ge tillräckligt med bakterier som skulle möjliggöra insamling av en mikropellets av prov. Det specifika antalet kolonibildande enheter eller bakterieceller beror på bakteriens typ och storlek.
- Odla bakterier i flytande media eller på fasta plattor. Välj typ av medium, tillväxtförhållanden (t.ex. temperatur, tillgång till syre) och tillväxttid enligt de specifika kraven för de arter av bakterier som under utredning. Till exempel, för S. aureus Heart Infusion (HI) agar plattor kan användas, med tillväxt för 16 h i 37 °C under aeroba förhållanden.
- Provdeposition
- Använd en steril slinga, samla försiktigt bakterier från kolonierna på agarplattan och överför dem till ett glasrör. Samla bakterier endast från toppen av kolonierna. Om du samlar in prover från en flytande odling, med hjälp av en pipett, överför du cirka 1 ml bakteriell suspension till ett glasrör. Volymen kan modifieras beroende på bakteriebelastningen.
OBS: Det är viktigt att försöka att inte samla (eller minimera så mycket som möjligt samlingen av) något medium under kolonin. De efterföljande stegen i provberedningen syftar till att avlägsna eventuella rester av media. Minimering av det potentiella mediet rester från början möjliggör spektralförvärv av data från renade bakterieceller. Steg 2.2.2 och 2.2.3 skall tillämpas på prover som framställs av agarplattor. För prover som framställs av flytande media, gå till steg 2.2.4. - Tillsätt 1 ml ultrapurevatten till röret. Virvel tills den insamlade bakteriepelleten inte längre är synlig längst ner på röret (vanligtvis 1–2 min).
- Uppskatta den grova grumligheten hos lösningen med hjälp av t.ex. McFarland-standarder genom visuell jämförelse30 mellan den beredda lösningen och McFarland-standarderna. Om grumligheten hos bakteriell suspension verkar vara mycket låg, tillsätt fler bakterier från plattan med en steril slinga och virvel igen. Upprepa tills lösningens grova grumlighet är jämförbar med McFarland-standarderna 0,5 och 1. Detta kommer i allmänhet att ge en bra mängd bakteriepellets.
- Centrifugera bakteriesuspensionen vid 3 000 x g i 5 minuter för att få en pellet.
OBS: Centrifugeringsparametrar kan modifieras för att erhålla bakteriepellet. Försiktighet bör iakttas om man ökar g-kraften, för att inte inducera brott av bakterier (särskilt vid gramnegativa bakterier). - Använd en pipett och ta försiktigt bort supernaten ovanför pelleten. Tillsätt 1 ml ultrapurevatten till röret och virveln för att suspendera pelleten igen. Därefter centrifuga provet enligt steg 2.2.4.
- Upprepa tvättproceduren (steg 2.2.2 och 2.2.4) minst tre gånger. Vid insamling av det första provet från flytande medier, upprepa proceduren minst fyra gånger (borttagning av media följt av tre tvättar).
- Efter den slutliga tvätten, ta bort supernaten, tillsätt ultrapurevatten och virvel i minst 2 minuter. Därefter deponering 5 μL av provet på substratet (t.ex. Raman grade CaF2).
- Om provets önskade tjocklek är ett multilager av bakterier, låt provet lufttorka.
- Om den önskade tjockleken är monoskikt eller enskilda bakterier tillsätt omedelbart efter deponering av provet (steg 2.2.7) mellan 20–100 μL ultrapurevatten och blanda försiktigt med en pipettspets. Låt lufttorka.
OBS: Den exakta vattenvolymen kan variera mellan experiment eftersom den är beroende av många faktorer (t.ex. organismens storlek, pelletsens densitet etc.) och bestäms därför bäst empiriskt. Beredning av en serie prover med olika volymer ultrapure vatten tillsatt gör det möjligt att välja ett prov med önskad tjocklek / densitet av bakterier. Bakteriernas tjocklek/densitet kan lätt visualiseras via AFM i de efterföljande stadierna. Exempel på AFM-bilder från monoskikt och encelliga prover visas i figur 1A–H. - Montera substratet på en AFM-metallprovskiva med dubbelhäftande tejp.
- Använd en steril slinga, samla försiktigt bakterier från kolonierna på agarplattan och överför dem till ett glasrör. Samla bakterier endast från toppen av kolonierna. Om du samlar in prover från en flytande odling, med hjälp av en pipett, överför du cirka 1 ml bakteriell suspension till ett glasrör. Volymen kan modifieras beroende på bakteriebelastningen.
3. Förberedelse av instrument
OBS: De instrumentella procedurer som beskrivs här är för det instrument som anges i materialförteckningen. Det detaljerade instrumentella förfarandet kan skilja sig något från det som beskrivs här om man använder en nyare modell av AFM-IR-instrumentet.
- Slå på och initiera instrumentet genom att trycka på knappen Initiera. Se till att laserluckan är i öppet läge för lasertestet.
- Om ett reningssystem är inställt rensar du instrumentet med N2 genom att slå på flödet på N2. Justera kväverening för att uppnå en stabil fuktighetsnivå (till exempel 20%). Se till att luftfuktigheten inte fluktuerar under mätningar och mellan insamling av bakgrundsdata och provdata. Att tillåta cirka 20 min för fuktighetsnivåerna att stabiliseras rekommenderas.
- Ladda provet i provkammaren genom att trycka på lastknappen. Provinläsning sker via programvaruguiden. När du använder programvaruguiden fokuserar du först på spetsen, använder pilar för att flytta mikroskopsteget i Z-riktningen och klickar på Nästa. För det andra justerar du datainsamlingsplatsen med hjälp av pilar som styr rörelsen i planet och justerar AFM-lasern och AFM-detektorn med hjälp av rattarna på toppen av AFM-huvudet. Fokusera därefter på provytan genom att flytta mikroskopsteget i Z-riktning.
OBS: Detaljerade illustrationer av varje steg av provladdning finns i programvaruhandboken31. Fokusering på provet bör utföras med försiktighet. När du närmar dig provytan i Z-riktningen, använd en långsam motorhastighet. - Närma dig exemplet utan att engagera genom att klicka på knappen Inflygning.
4. Insamling av uppgifter
- Bakgrund
- Innan datainsamling, samla in bakgrunden. För bakgrundsinsamling, se till att laser slutaren är i öppet läge. Välj spektralområde och upplösning (beroende på analysens syfte) och antalet skanningar och antalet medgenomsnitt av bakgrunden. Dessa rekommenderas i allmänhet att vara höga (t.ex. 1024 skanningar och 3 co-averages).
OBS: I allmänhet rekommenderas spektralupplösning på 4 cm-1 eller 8 cm-1 och spektralintervall på 3 200 cm-1–2 800 cm-1 och 1 800 cm-1–900 cm-1. - Spara bakgrundsfilen när du har sparat bakgrunden. Filen lagras inte automatiskt. Ändra laser slutarläget till Stäng.
- Innan datainsamling, samla in bakgrunden. För bakgrundsinsamling, se till att laser slutaren är i öppet läge. Välj spektralområde och upplösning (beroende på analysens syfte) och antalet skanningar och antalet medgenomsnitt av bakgrunden. Dessa rekommenderas i allmänhet att vara höga (t.ex. 1024 skanningar och 3 co-averages).
- Prov – enstaka spektra
- Tryck på knappen Aktivera för att koppla till provet. Systemet börjar närma sig provytan tills direktkontakt upptäcks.
Obs: Börspunkten som används i detta arbete varierade mellan 0,15–2 V och feedbackvinsterna (I Gain och P Gain) skulle vanligtvis ställas in på 3 och 10. NIR2 kontaktsonder används ofta med nanoIR2-system (modell: PR-EX-nIR2-10, resonansfrekvens (kHz): 13 +/−4 kHz, fjäderkonstant (N/m): 0,07−0,4 Nm-1). - Samla in en AFM-bild för att visualisera ytan. I första hand skanna ett större område (t.ex. 50 x 50 μm) med lägre rumslig upplösning (t.ex. 200 x 200 punkter) (Figur 1I).
AFM-IR-data samlas alltid in i kontaktläge, men AFM-data kan samlas in i kontakt- eller gängläge. - Välj ett visst intresseområde på AFM-höjd/avböjningsbild och avbilda det igen med högre rumslig upplösning (bild 1J–K). Se till att datainsamlingshastigheten är lämplig, med långsam spetsrörelse (t.ex. skanningshastighet 0,2–0,4 Hz).
- Välj mätpunkt (t.ex. enstaka bakterie) och flytta spetsen till platsen.
- Rikta in IR-lasern. Använd för detta ändamål ett vågvirke som provet kommer att absorberas vid. För biologiska material kan detta t.ex. vara mitt i I (1655 cm-1). Se till att bandpassfiltret är avstängt och klicka på Start IR. Det högra diagrammet i nanoIR-mätaren (FFT för avböjningen som visas som amplitud kontra frekvens) bör visa minst en klar topp och det vänstra diagrammet (avböjning kontra tid) bör ha en periodisk vågform. Om så inte är fallet, fortsätt att optimera IR-fläckarna.
OBS: Även om Snabb Fourier Transform (FFT) och avböjning visar förväntad profil, rekommenderas att genomföra optimeringen av IR-fläckar för minst flera vågnumbers, där band förväntas. - Optimera de heta punkterna för IR-datainsamlingen med de valda vågnumrerade värdena. Det kan vara bra att använda ett konventionellt IR-spektrum av bakterierna (t.ex. ATR-spektrum av bakteriepellet) för att identifiera bandens positioner och använda dem för att optimera hot spots. Välj olika vågnummervärden (t.ex. 8–10) från olika spektralregioner.
OBS: Om konventionellT IR-spektrum av bakterier av intresse inte kunde samlas in före insamling av AFM-IR-data, kan bakteriespektra som finns i litteraturen användas som en grov vägledning. Resultatet av optimeringen av en IR-plats är en bild som visar en karta över FFT-magnitudsignalen på varje x- och y-plats. Platsen med den största signalen väljs automatiskt. Exempel på sådana bilder ges i programvaruhandbok31. - När du har optimerat IR-fläckarna för valda vågnumbervärden definierar du parametrarna för spektraldatainsamling: spektralregion, spektralupplösning, antal skanningar och tillämpad kraft och mata in dessa i lämpliga fönster i programvaran. Spektralresolutionen bör matcha bakgrundsresolutionen och spektralregionen bör ligga inom den spektralregion för vilken bakgrunden samlades in.
OBS: En generisk inledande uppsättning parametrar kan vara: spektralområde: 3200 cm-1-2800 cm-1 och 1800 cm-1–900 cm-1, spektralupplösning: 4 cm-1 eller 8 cm-1, antal skanningar: 512–2048. - Justera vid behov lasereffekten beroende på signalen. I allmänhet bör värden mellan 8–10% av lasereffekten vara tillräckliga för god signalkvalitet. Högre värden kan användas med försiktighet, eftersom de kan leda till provskador.
OBS: Den procentiga lasereffekten kan variera beroende på typen av IR-laser. De procentvärden som anges här är för OPO-laser. - Klicka på Skaffa för att samla IN AFM-IR-spektrum.
- Samla in AFM-data från samma område efter insamling av AFM-IR-spektrumet. Detta rekommenderas starkt eftersom det kommer att avslöja eventuella drift och / eller destruktiv påverkan på provet.
- Om AFM-IR-spektrumet är tillfredsställande och inget destruktivt inflytande på provet observeras, fortsätt med datainsamlingen. Om det behövs definierar du en serie punkter för datainsamling med alternativet Matris och insamlad AFM-höjd- eller avböjningsbild. Det här alternativet gör det möjligt att samla in spektra i följd från varje punkt med samma spektralparametrar som definieras för ett enda spektrum.
- Om AFM-bilden som samlats in efter insamling av AFM-IR-spektrum avslöjar destruktiv påverkan på provet (vanligtvis en bränd fläck), minska kraften; välj en annan plats och upprepa steg 4.3.8–4.3.11.
- Om signalen i AFM-IR-spektrumet inte är tillfredsställande, kontrollera att optimeringen av IR-fläckar är korrekt (steg 4.3.6). Om den är korrekt, öka lasereffekten något och upprepa steg 4.3.7–4.3.11. Detta kan upprepas tills tillfredsställande signal uppnås.
- Tryck på knappen Aktivera för att koppla till provet. Systemet börjar närma sig provytan tills direktkontakt upptäcks.
- Exempel – bildbehandlingsmetod
OBS: Det rekommenderas starkt att spela in ett enda AFM-IR-spektrum av bakterien innan du samlar in en intensitetsfördelningsbild för ett valt vågnummervärde.- Spela in en AFM-bild av det valda exempelområdet. För att göra detta, samla först AFM-bild av ett större område med lägre rumslig upplösning (t.ex. 50 x 50 μm, 200 x 200 poäng), välj sedan en region av intresse och samla en AFM-bild med ökad rumslig upplösning (som illustreras i figur 1I-K).
- Välj vågnummervärdena för AFM-IR-avbildning.
- Se till att laserns IR-punkt är optimerad för de valda vågnumreringsvärdena (steg 4.3.6). Om IR-platsen inte är optimerad för vissa vågnruttar (inget klart maximum), optimera den för dem.
- Definiera parametrarna för det bildade området: bredd och höjd, antal datapunkter i X- och Y-riktning.
OBS: Om det på varandra följande urvalet av fläckar från de tidigare AFM-bilderna tillämpas (som visas i figur 1I–K)fylls bredd- och höjdfälten automatiskt upp vid markeringen av området. - Definiera parametrarna för spektralsignalförvärv: våglängd, antal skanningar och laserkraft.
OBS: Antalet skanningar måste hållas inom skäl. 64 eller 32 skanningar tillåter vanligtvis en tillräcklig mängd signal. - Definiera parametrarna för AFM-spetsrörelser genom att klicka på skanningsfrekvensen. Ju högre antalet skanningar i föregående steg och antalet datapunkter i X-riktning, desto långsammare blir spetsrörelserna. Brist på justering mellan dessa parametrar resulterar i för snabb rörelse av spetsen, vilket förhindrar det faktiska förvärvet av definierat antal skanningar från varje punkt.
OBS: För en lämplig samling IR-signal med 64 samtillskott och 200 punkter ställer du till exempel in skanningshastigheten som 0,07 kHz. - Kontrollera att rutan Aktivera IR-avbildning är markerad.
- Börja avbildning. AFM-IR för signalintensiteten vid det valda vågnumret kommer att samlas in samtidigt med AFM-data från det området.
OBS: När OPO-lasern används är det möjligt att dessutom samla in samtidig kontaktresonanstoppulsbild. Detta kan användas för att få information om provet relativt styvhet på olika platser. - Använd fönstret Insamlingssekvens för att ange en på varandra följande samling AFM-IR-data från samma område med samma parametrar, men för olika vågnummervärden. Det gör du genom att öppna fönstret Insamlingssekvens, skriva in varje vågnrutförande och definiera den tillämpade lasereffekten (för varje vågnrutförande).
- Exportera insamlade data (AFM och AFM-IR, enstaka spektra och bildbehandling) till olika format och analysera dem med hjälp av metoder som är lämpliga för specifika forskningsmål.
Representative Results
Det beskrivna protokollet gör det möjligt att erhålla en rad olika typer av cellfördelningar av bakterier på substratet, beroende på den ursprungliga koncentrationen av provet och mängden tillsatt vatten. Figur 1 illustrerar exemplen på AFM-bilder (höjd och avböjning) som registrerats från monoskikt och encelliga prover som framställts med hjälp av det beskrivna protokollet från grampositiva (S. aureus) och gramnegativa (Escherichia coli) bakterier.
Protokollet som beskrivs här kan användas för AFM-IR-avbildning av intra- och extracellulära strukturer av enskilda bakterier. Ett exempel på detta program visas i figur 2, som visar resultaten av övervakningen av de rumsligt lokaliserade kemiska förändringar som inträffar under delningen av en S. aureus-cell. Även om lufttorkning allmänt betraktas som en fixeringsmetod för bakteriell beredning, visar bakterier till sin natur mycket hög resistens mot yttre faktorer som temperatur och rapporterades överleva uttorkning32. Resultaten som presenteras här förvärvades från ett lufttorkat prov. Bildandet av ett septum, som inträffade före celldelningen observerades och övervakades via AFM imaging (Figur 2A-D) genom samling av 12 bilder av samma område i följd (samling av en enda bild ≈ 20 min). Bild 2A–D visar 4 valda AFM-bilder, med tid mellan samlingen av varje bild på cirka 40 minuter. Den bildade strukturen (septum) är 45 nm hög. Det bildade septumet är tydligt synligt i AFM-höjd och avböjningsbilder (Figur 2E-F). Afm-IR-spektrat som registrerats från cell- och septumområdet (figur 2G, ursprungspunkter märkta i figur 2F) normaliserades till amid I-bandet före jämförelsen, för att minimera påverkan av varierande provtjocklek mellan punkter för datainsamling. AFM-IR-spektrumet av septum kännetecknas av högre relativ intensitet av band vid 1240 och 1090 cm-1 jämfört med AFM-IR-spektrum som samlats in från cellområdet. Dessa tillskrivs kolhydrat- och fosfodiestergrupper av cellväggskomponenter (inklusive t.ex. peptidoglykan och teichosyra)22.
Det beskrivna protokollet kan också användas för jämförelse av ett enda spektra mellan ett antal olika prover. Ett exempel på detta program tillsammans med resultaten visas i figur 3 och figur 4. Syftet med studien är att fastställa de kemiska förändringar som uppstår till följd av in vivo-utveckling av vankomycin intermittent resistens i S. aureus (VISA). För detta ändamål samlades kliniska par av prover in från patienter, med föräldrastammen isolerad vid införsel till sjukhuset och före antibiotikabehandling (vankomycin mottaglig S. aureus, VSSA) och dotterstammen isolerad från samma patient efter införsel av antibiotika och klinisk svikt. Proverna odlades vidare på agarmedium och utarbetades enligt protokollet (figur 3A–B). AFM-IR-spektrat samlades in från flera enskilda bakterier (och flera prover) för VSSA och VISA och analyserades därefter med hjälp av flera kemometriska metoder (figur 3C).
Inga morfologiska skillnader observerades mellan VSSA- och VISA-celler (figur 4A–C). Afm-IR-spektrat(figur 4D,F) ochderas andra derivat(figur 4E.G)visade dock en tydlig skillnad i den kemiska sammansättningen mellan resistenta och mottagliga stammar. Den relativa intensiteten hos de band som är associerade med kolhydrat- och fosfodiestergrupper från cellväggskomponenter (i synnerhet bandet vid 1088 cm-1) ökade tydligt i den resistenta stammen jämfört med den mottagliga motsvarigheten. Noter är det faktum att alla omkodade spektra (VISA: 81, VSSA: 88) visar en liten standardavvikelse. Detta visar på god reproducerbarhet av data som registrerats från olika prover som framställts av samma stam, eftersom det inte var möjligt att diskriminera spektra som registrerats från olika prover av samma stam. De observerade skillnaderna indikerade en ökad tjocklek på cellväggen i resistenta stammar, jämfört med den mottagliga motsvarigheten, som förblir i samförstånd med andralitteraturrapporter 33,34.
Figur 1: Representativa AFM-bilder av olika bakterieprover för AFM-IR-mätningar. Beroende på utspädningen på substrat tillåter protokollet en att få multilager och monolager av bakterier samt encelliga prover. Representativa AFM-bilder av: (A–D)monoskikt och (E–H) encellsprov för (A,B,E,F) Grampositiv(S. aureus) och (C,D,G,H) Gramnegativa (E. coli) bakterier. (A,C,E,G) demonstrerar höjdbilder och (B,D,F,H) visar motsvarande avböjningsbilder. Storlek på bildområden: (A-D,G,H) 20 x 20 μm, (E,F) 50 x 50 μm. (I-K) på varandra följande urval av ett område för AFM-IR-kartläggning. Detta uppnås med hjälp av AFM imaging med ökande rumslig upplösning i exemplet med en enda S. aureus cell. Varje bild samlas in genom att ta prover på 200 x 200 punkter, med ökande rumslig upplösning på grund av minskningen av storleken på det bildade området. Storlek på bildområden: (I) 40 x 40 μm, (J) 20 x 20 μm och (K) 2,24 x 2,24 μm. Den svarta fyrkanten i (I) markerar det område som avbildas i (J). Den svarta fyrkanten i (J) markerar det område som avbildas i (K). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Övervakning av S. aureus celldelning via AFM-IR. (A–D) AFM-bilder av S. aureus cell som visar bildandet av septum före celldelning. Storlek på avbildat område: 2 x 2 μm. Bilderna valdes från en större serie (12 bilder inspelade var 20:e minut) och representerar data som registrerats var40:eminut. Storlek på det bildade området 1,17 x 1,15 μm. Höjden på den nybildade strukturen är 45 nm. (G) AFM-IR-spektra inspelat från cellområde (svart) och septumområde (rött) (markerat i (F)), inom intervallet 1400–900 cm-1. Båda spektra normaliserades till amiden jag band och visar en ökning av den relativa intensiteten av cellvägg komponenter från septum. Denna siffra har ändrats från K. Kochan et al.22. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: En översikt över den experimentella utformningen för AFM-IR-studie av antimikrobiell resistens. A)Provursprung och första preparat: mottaglig föräldrastam samlades in från en patient före antibiotikabehandling och den dotterresistenta stammen kom från samma patient efter antibiotikabehandling och klinisk svikt (in vivo-resistensutveckling). Bakterier isolerades och odlades på hjärtinfusion (HI) agar i 16 h i 37 °C. B)Efterföljande provberedning för AFM-IR, inklusive insamling av provet följt av tvättning av bakteriell pall (3×) och provdeponering. (C) INSAMLING och analys av AFM-IR-data: AFM-höjd och AFM-IR-spektrum (1800–900 cm-1). Storlek på det avbildade AFM-området: 1,7 x 1,4 μm. AFM-IR-spektrumet samlades in från mitten av cellen. Data analyserades därefter med hjälp av kemometriska metoder, inklusive hierarkisk kluster analys. Denna siffra har ändrats från K. Kochan et al.19. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: AFM- och AFM- IR- resultat av studier av kemiska förändringar i vankomycin intermediate S. aureus (VISA) jämfört med vankomycin mottaglig S. aureus (VSSA) i kliniska par. AFM-bilder av( A–B) VISA och (C) VSSA encelliga prover. Storlek på de bildade områdena: (A,C) 40 x 40 μm, (B) 2,56 x 2,45 μm. (D–E) Genomsnittlig AFM-IR-spektra och deras (F-G) andra derivat för: (D,F) VISA och (E,G) VSSA-celler, i spektralområdet 1800–900 cm-1. Det spektra som presenteras är i genomsnitt 81 (VISA) och 88 (VSSA) enskilda spektra och presenteras tillsammans med standardavvikelse (SD). Medelvärdet genomfördes efter normalisering av alla enskilda spektra tillsammans. De stora banden är märkta i (F–G). Denna siffra har ändrats från K. Kochan et al.19. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 5: Bilddrivare över på varandra följande registrering av AFM-IR-kartor vid valda vågnumbervärden för S. aureus-cellen. (Översta raden): AFM-bilder spelades in samtidigt med motsvarande(nedre raden)AFM-IR-kartor baserat på intensiteten hos IR-signalen vid valda vågnummervärden. Vågnumbervärdena (966, 1055, 1079, 1106, 1234, 1398, 1454, 1540, 1656, 1740 cm-1)kommenteras ovanför den nedre raden. Varje uppsättning (AFM-bild och AFM-IR-karta) spelades in direkt efter föregående bild (cirka 40 min per uppsättning). Storleken på det bildade/kartlagda området: 1,54 x 1,57 μm. En tydlig drift syns mellan bilderna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Discussion
Nyttan av IR-spektroskopi för karakterisering av ett brett spektrum av biologiska prover i samband med deras kemiska sammansättning är väl etablerad. Under det senaste decenniet har IR-spektroskopi dykt upp som ett lovande verktyg för bakteriestudier12,13,14,15,16,17. Det fortsätter att locka stort intresse inom mikrobiologi, som en av de få tekniker som möjliggör en fenotypisk karakterisering genom den kemiska kompositionen. I detta sammanhang ligger den största nackdelen med konventionell FTIR-mikroskopi i begränsad rumslig upplösning, vilket förhindrar encelliga och subcellulära studier av bakterier. Faktum är att den lilla storleken på bakterier utgör ett hinder inte bara för IR, men för de allra flesta tekniker. Således är de tillgängliga forskningsverktygen för encelliga och subcellulära studier av bakterier signifikant begränsade. Kombinationen av AFM med IR gör det möjligt att övervinna den rumsliga upplösningsbegränsningen för IR-spektroskopi, vilket ger ett nytt verktyg för bakterieforskning, som kan avläsa den kemiska sammansättningen i nanoskala.
Tekniken är inte begränsad till encellsstudier och gör det möjligt att undersöka en mängd olika prover, som sträcker sig i tjocklek. Utan tvekan är ren och noggrann provberedning avgörande för att uppnå högkvalitativa bilder. Protokollet häri ger en metod för att förbereda flerskikts-, monoskikts- och/eller enstaka cellprover av olika bakterier (figur 1). Det beredda provet beror på flera faktorer, inklusive den ursprungliga bakteriebelastningen, utspädning efter tvättning samt ytterligare utspädning på substratet. Den mängd prov som erhålls efter utspädning av de tvättade pelletsen och före nedfallet på substratet gör det vanligtvis möjligt att beredningen av många prover. För att få önskad fördelning av provet på substratet är det därför ofta fördelaktigt att förbereda en serie prover, som sträcker sig i utspädningen. För studier som syftar till insamling av AFM-IR-spektra snarare än subcellulär avbildning kan det vara fördelaktigt att ändra mängden prov (t.ex. från monoskikt till flerskikt) för att öka signalens intensitet.
En annan kritisk aspekt vid provberedning är lämplig avlägsnande av medelstora rester. Beroende på de valda provodlingsmetoderna samlas provet antingen från flytande medium eller från en agarplatta. I båda fallen är det troligt att medelstor resthalt finns i provet, om än i mycket mindre utsträckning vid insamling från agarplattor. Eftersom bakteriella tillväxtmedier innehåller ett överflöd av olika biologiska komponenter är det viktigt att säkerställa lämplig borttagning av medium. Vi rekommenderar tre tvättar med ultrapurevatten för agarplatta prover och minst fyra tvättar för prover som samlats in från medium. Antalet tvättar kan ökas vid behov; För jämförelse mellan olika prover är det dock viktigt att hålla det konsekvent mellan proverna. Det demonstrerade protokollet använder vatten, snarare än lösningsmedel som fosfatbuffertlösning (PBS) eller saltlösning. Både PBS och saltlösning leder till bildandet av kristaller vid lufttorkning, vilket kan skada bakterierna. Dessutom är båda en källa till intensiva IR-band, med PBS, i synnerhet, som innehåller flera band i fingeravtrycksregionen. Bristen på förmåga att använda saltlösning eller PBS, representerar för närvarande en viktig begränsning för tekniken. Vanligtvis orsakar användningen av vatten för tvätt inte någon destruktiv inverkan på bakterierna; Försiktighet bör dock tas, och om möjligt bör tidpunkten för vattenexponeringen begränsas. Om provberedningsprotokollet måste pausas vid tvättningsstadiet, rekommenderas att lämna provet i pelletiserad form efter att vattnet har avlägsnats. Detta är särskilt viktigt för gramnegativa bakterier, som innehåller en tunnare cellvägg eftersom de är mer benägna att brista.
För att säkerställa korrekta och högkvalitativa AFM-IR-data är flera aspekter i datainsamlingsprotokoll av avgörande betydelse. För det första är korrekt insamling av bakgrund avgörande för datainsamling. I synnerhet är det nödvändigt att upprätthålla stabila fuktighetsnivåer under hela bakgrundsinsamlingen samt mellan bakgrunds- och provsamling. För att säkerställa detta rekommenderar vi att instrumentet renas med kväve och att fuktighetsnivåerna bibehålls inte högre än 25 %. Brist på rensning kan medföra en betydande begränsning, särskilt på platser med hög luftfuktighet. För det andra bör vikten av korrekt optimering av IR-fläckar betonas. För bästa resultat kan en förkunskap om band maximas position vara till nytta. Till exempel kan ett konventionellt IR-spektrum av bakteriepellet användas för att bestämma positioner för band som förväntas från ett prov. Om det inte är möjligt att som ett alternativt tillvägagångssätt förvärva kan användaren använda IR-spektra som finns i litteraturen eller börja optimeringen med hjälp av en bandposition som är rimlig att förvänta sig i bakterien (t.ex. mitt i I och mitt ii). För det tredje, för datainsamling är det viktigt att lyfta fram betydelsen av noggrant kraftval (vilket gör det möjligt att uppnå ett bra S/N-förhållande), eftersom det kan ha en destruktiv effekt. Den rekommenderade kraften beror på provets tjocklek, med grov vägledning tillgänglig i instrumenthandboken31. Vi rekommenderar att empiriskt testa tillståndet för provet efter mätning genom insamling av en AFM-bild, eftersom det kommer att avslöja något destruktivt inflytande. Dessutom fungerar samlingen av AFM-bilder från samma område före och efter insamling av AFM-IR-spektra som en bra bekräftelse på att ingen drift har inträffat och spektrat kommer faktiskt från den valda punkten i cellen. Möjligheten till drift är särskilt viktig vid tillämpning av bildframställningsmodaliteten, genom på varandra följande avbildning av IR-intensitet vid valda vågnumbervärden. Ett exempel på detta illustreras i figur 5. Det avbildade området definierades i början av experimentet och är avsett att vara konsekvent för alla vågnummervärden. En tydlig drift är dock synlig mellan varje AFM-höjd (och motsvarande IR-vågnummerintensitet), med förvärvstid för varje karta på cirka 40 minuter. På grund av detta rekommenderar vi för användare som samlar in bilddata att alltid välja ett område som är något större än urvalet av intresse, för att säkerställa att även vid drift kommer urvalet av intresse att förbli inom det bildade området.
Protokollets potentiella begränsningar inkluderar bristen på förmåga att samla in data i ett hydratiserat tillstånd i fysiologiska lösningar (t.ex. saltlösning eller PBS) som beskrivs ovan. Dessutom, särskilt i områden med hög luftfuktighet, finns det ofta ett behov av kväverening. Dessutom gör protokollet det möjligt att undersöka organismer ner till 100 nm i storlek, med undantag för möjligheten att använda den för mindre strukturer. Även om detta kan övervinnas med hjälp av en annan laser (t.ex. kvantkaskaskalaser som gör det möjligt att uppnå den rumsliga upplösningen på 20 nm), är det också förknippat med begränsat spektralområde samt svårigheter att få en bra signal-till-brusförhållande. Slutligen kan sondering av mjuka ytor utgöra en utmaning med spetsen som inte känner av ytan ordentligt och fortsätter utanför kontaktpunkten tills den går sönder. Även om detta vanligtvis inte är ett problem med bakterieprover, kan det uppstå vid mätningar av mjukare prover. I sådana fall rekommenderas att försöka engagera sig på ren yta av substratet i närheten av provet.
Det beskrivna protokollet kan användas för många typer av bakteriell forskning, inklusive jämförande studier mellan olika prover samt subcellulär undersökning. Data kan analyseras med hjälp av kemometriska metoder för enstaka spektra- och bildframställningsmetoder35, beroende på forskningens syfte. Dessutom kan protokollet också ändras för applicering på annat biologiskt material (såsom svampar, jäst, celler etc.), genom tillsats av fixering.
Disclosures
Vi vill uppmärksamma Bruker för betalning av publiceringsavgift. KK, BRW, AP och PH är uppfinnare av ett internationellt patent (PCTIB2020/052339), som beskriver några av de grundläggande aspekterna av tillvägagångssättet.
Acknowledgments
Vi vill tacka Bruker för deras stöd. Detta arbete stöddes av Monash University Advanceing Women's Success Grant (K. Kochan). A.Y.P bekräftar stöd från Australian National Health and Medical Research Council Practitioner Fellowship (APP1117940). Detta arbete finansierades av australian Research Council Discovery Project DP180103484. Vi vill tacka Mr. Finlay Shanks för hans instrumentala stöd och Ms Xenia Kostoulias för hennes tekniska hjälp med proverna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM metal specimen disc | PST ProSciTech Pty Ltd | GA530-15 | Recommended 15 mm |
| Anasys AFM-IR nanoIR2 | Anaysys Instruments | model: nanoIR2 | |
| Contact mode NIR2 Probes for nanoIR 2 | Bruker / Anasys Instruments | - | Model: Model: PR-EX-NIR2 |
| Heraeus Pico 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | - | - |
| Matlab | Mathworks Inc | - | Multivariate data analysis software |
| Micro-centrifuge tubes, 1.5 mL | Heathrow Scientific | HEA4323 | Can be replaced with any other micro-centrifuge tube |
| NanoIR 2 instrument | Bruker / Anasys Instruments | - | - |
| PLS toolbox | Mathworks Inc | - | GUI for Matlab |
| Selected bacterial medium (e.g. HBA Columbia Plates) | Thermo Fisher | PP2001 | Provided type of medium is an example and can be replaced by others, depending on the type of experiment |
| Selected bacterial strain | - | - | The source depends on the aim of research (patient isolates, ATCC strains, etc.) |
| Substrate (e.g. Raman grade CaF2) | Crystran | CAFP13-2R | Recommended size: 13 mm Ø x 2.0 mm |
| Tip pipette 1000 µl | Axygen | T-1000-B | - |
| Tip pipette 200 µl | Axygen | T-200-C | - |
| Tip pipette 0.5-10 µl | Axygen | T-300-R | - |
| Ultrapure water | - | - | - |
References
- Sears, C. L. A dynamic partnership: celebrating our gut flora. Anaerobe. 11 (5), 247-251 (2005).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), London, England. 200-211 (2020).
- Seymour, C. W., et al. Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis. The New England Journal of Medicine. 376 (23), 2235-2244 (2017).
- Weiss, S. L., et al. Delayed antimicrobial therapy increases mortality and organ dysfunction duration in pediatric sepsis. Critical Care Medicine. 42 (11), 2409-2417 (2014).
- Peker, N., Couto, N., Sinha, B., Rossen, J. W. Diagnosis of bloodstream infections from positive blood cultures and directly from blood samples: recent developments in molecular approaches. Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 24 (9), 944-955 (2018).
- Aminov, R. I. The role of antibiotics and antibiotic resistance in nature. Environmental Microbiology. 11 (12), 2970-2988 (2009).
- Levy, S. B., Marshall, B. Antibacterial resistance worldwide: causes, challenges and responses. Nature Medicine. 10 (12), Suppl 122-129 (2004).
- Roca, I., et al. The global threat of antimicrobial resistance: science for intervention. New Microbes and New Infections. 6, 22-29 (2015).
- O'Neill, J. The review on antimicrobial resistance. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. Wellcome Trust. , (2016).
- Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. The antibiotic resistome: what's new. Current Opinion in Microbiology. 21, 45-50 (2014).
- Piddock, L. J. Assess drug-resistance phenotypes, not just genotypes. Nature Microbiology. 1 (8), 16120 (2016).
- Naumann, D., Helm, D., Labischinski, H. Microbiological characterizations by FT-IR spectroscopy. Nature. 351 (6321), 81-82 (1991).
- Zarnowiec, P., Lechowicz, L., Czerwonka, G., Kaca, W. Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) as a tool for the identification and differentiation of pathogenic bacteria. Current Medicinal Chemistry. 22 (14), 1710-1718 (2015).
- Quintelas, C., Ferreira, E. C., Lopes, J. A., Sousa, C. An overview of the evolution of infrared spectroscopy applied to bacterial typing. Biotechnology Journal. 13 (1), 1700449 (2018).
- San-Blas, E., Cubillán, N., Guerra, M., Portillo, E., Esteves, I. Characterization of xenorhabdus and photorhabdus bacteria by Fourier transform mid-infrared spectroscopy with attenuated total reflection (FT-IR/ATR). Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 93, 58-62 (2012).
- Sousa, C., et al. Discrimination of the acinetobacter calcoaceticus-acinetobacter baumannii complex species by Fourier transform infrared spectroscopy. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 33 (8), 1345-1353 (2014).
- Rodriguez-Saona, L. E., Khambaty, F. M., Fry, F. S., Calvey, E. M. Rapid detection and identification of bacterial strains by Fourier transform near-infrared spectroscopy. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 49 (2), 574-579 (2001).
- Dawson, S. E., et al. Implementation of Fourier transform infrared spectroscopy for the rapid typing of uropathogenic Escherichia coli. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 33 (6), 983-988 (2014).
- Kochan, K., et al. Detection of Antimicrobial Resistance-Related Changes in Biochemical Composition of Staphylococcus aureus by Means of Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy. Analytical Chemistry. 91 (24), 15397-15403 (2019).
- Dazzi, A., Prater, C. B. AFM-IR: Technology and Applications in Nanoscale Infrared Spectroscopy and Chemical Imaging. Chemical Reviews. 117 (7), 5146-5173 (2017).
- Dazzi, A., et al. AFM-IR: combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization. Applied Spectroscopy. 66 (12), 1365-1384 (2012).
- Kochan, K., et al. et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria. Journal of the Royal Society, Interface. 15 (140), (2018).
- Katzenmeyer, A. M., et al. Mid-infrared spectroscopy beyond the diffraction limit via direct measurement of the photothermal effect. Nanoscale. 7 (42), 17637-17641 (2015).
- Bruker Life Science Applications. , Available from: https://www.bruker.com/products/surface-and-dimensional-analysis/nanoscale-infrared-spectrometers/nanoscale-ir-spectroscopy-applications/life-sciences.html (2020).
- Mayet, C., Dazzi, A., Prazeres, R., Ortega, J. M., Jaillard, D. In situ identification and imaging of bacterial polymer nanogranules by infrared nanospectroscopy. Analyst. 135 (10), 2540-2545 (2010).
- Baldassarre, L., et al. Mapping the amide I absorption in single bacteria and mammalian cells with resonant infrared nanospectroscopy. Nanotechnology. 27 (7), 075101 (2016).
- Vitry, P., et al. Combining infrared and mode synthesizing atomic force microscopy: Application to the study of lipid vesicles inside Streptomyces bacteria. Nano Research. 9 (6), 1674-1681 (2016).
- Dazzi, A., et al. Chemical mapping of the distribution of viruses into infected bacteria with a photothermal method. Ultramicroscopy. 108 (7), 635-641 (2008).
- Steenbergen, J. N., Alder, J., Thorne, G. M., Tally, F. P. Daptomycin: a lipopeptide antibiotic for the treatment of serious Gram-positive infections. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 283-288 (2005).
- Garcia, L. S. MacFarlan Standards. Clinical Microbiology Procedures Handbook, 3rd Edition. , American Society of Microbiology. (2010).
- NanolR-2 System Manual. Anasys Instruments. , Available from: https://www.anasysinstruments.com/downloadpr/nanoIR2_s_System_Manual.pdf (2020).
- Whelan, D. R., et al. Detection of an en masse and reversible B- to A-DNA conformational transition in prokaryotes in response to desiccation. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (97), 20140454 (2014).
- McGuinness, W. A., Malachowa, N., DeLeo, F. R.
- Howden, B. P., Peleg, A. Y., Stinear, T. P. The evolution of vancomycin intermediate Staphylococcus aureus (VISA) and heterogenous-VISA. Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 21, 575-582 (2014).
- Perez-Guaita, D., et al. Multispectral Atomic Force Microscopy-Infrared Nano-Imaging of Malaria Infected Red Blood Cells. Analytical Chemistry. 90 (5), 3140-3148 (2018).
