Purificação de Afinidade MS2 juntamente com sequenciamento de RNA em bactérias gram-positivas

Resumo

A tecnologia MAPS foi desenvolvida para examinar o targetome de um RNA regulatório específico in vivo. O sRNA de interesse é marcado com um aptamer MS2 permitindo a co-purificação de seus parceiros RNA e sua identificação por sequenciamento de RNA. Este protocolo modificado é particularmente adequado para bactérias Gram-positivas.

Resumo

Embora os PEQUENOs RNAs regulatórios (sRNAs) sejam difundidos entre o domínio bacteriano da vida, as funções de muitos deles permanecem pouco caracterizadas notavelmente devido à dificuldade de identificar seus alvos de mRNA. Aqui, descrevemos um protocolo modificado da Purificação MS2-Affinity, juntamente com a tecnologia RNA Sequencing (MAPS), com o objetivo de revelar todos os parceiros de RNA de um sRNA in vivo específico. Em linhas gerais, o aptamer MS2 é fundido à extremidade de 5' do sRNA de interesse. Essa construção é então expressa in vivo, permitindo que o MS2-sRNA interaja com seus parceiros celulares. Após a colheita bacteriana, as células são mecanicamente cultivadas. O extrato bruto é carregado em uma coluna de cromatografia à base de amilolose previamente revestida com a proteína MS2 fundida à proteína de ligação maltosa. Isso permite a captura específica de MS2-sRNA e RNAs interagindo. Após a elução, os RNAs co-purificados são identificados por sequenciamento de RNA de alto rendimento e análise bioinformática subsequente. O protocolo a seguir foi implementado no Patógeno Humano Gram-positivo Staphylococcus aureus e é, em princípio, transposável para qualquer bactéria Gram-positiva. Resumindo, a tecnologia MAPS constitui um método eficiente para explorar profundamente a rede regulatória de um sRNA específico, oferecendo um instantâneo de todo o seu targetome. No entanto, é importante ter em mente que as metas putativas identificadas pelo MAPS ainda precisam ser validadas por abordagens experimentais complementares.

Introdução

Centenas, talvez até milhares de pequenas RNAs regulatórias (sRNAs) foram identificadas na maioria dos genomas bacterianos, mas as funções da grande maioria deles permanecem descaracterizadas. No geral, as sRNAs são moléculas curtas sem codificação, desempenhando papéis importantes na fisiologia bacteriana e adaptação a ambientes flutuantes^1,2,3. De fato, essas macromoléculas estão no centro de inúmeras redes regulatórias intrincadas, impactando vias metabólicas, respostas ao estresse, mas também virulência e resistência a antibióticos. Logicamente, sua síntese é desencadeada....

Protocolo

1. Buffers e mídia

1. Para experimentos maps, prepare os seguintes buffers e mídia:
   - Buffer A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl₂ e 1 mM DTT)
   - Buffer E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltose, 0,1% Triton, 1 mM MgCl₂ e 1 mM DTT)
   - Tampão de carregamento de RNA (0,025% cianol de xileno e 0,025% azul bromofenol em 8 M de ureia)
   - Infundição do Coração Cerebral (BHI) médio (12,5 g de cérebro de bezerro, 10 g de peptone, 5 g de coração de carne bovina, 5 g de NaCl, 2,5 g de Na₂HPO₄ e 2 g de glicose para 1 L)
   - Caldo de Lysogeny (LB) médio (10 g de peptone, 5 g de extrato ....

Resultados

Os resultados representativos são originários do estudo do RsaC targetome em S. aureus²⁹. RsaC é um sRNA não convencional de 1.116 nt-long. Seu final de 5' contém várias regiões repetidas, enquanto seu final de 3' (544 nt) é estruturalmente independente e contém todos os locais de interação previstos com seus alvos mRNA. A expressão deste sRNA é induzida quando o manganês (Mn) é escasso, o que é frequentemente encontrado no contexto da resposta imune hospedeira. Utilizando a tecnologia MA.......

Discussão

Um protocolo modificado para bactérias Gram-positivas
O protocolo inicial do MAPS foi desenvolvido para estudar o sRNA interactome no organismo modelo E. coli^20,30. Aqui, descrevemos um protocolo modificado que é adequado para a caracterização de redes regulatórias dependentes de sRNA no patógeno humano oportunista S. aureus e é certamente transposável para outras bactérias Gram-positivas, patogênicas ou não.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL	Sarstedt	72.690.001
Tubos de centrífuga de 15 mL Falcon		352070
Tubo de microcentrífuga de 2 mL	Starstedt	72.691
2100 Instrumento Bioanalisador	Agilent	G2939BA	quantidade e qualidade de RNA
Frasco de cultura de 250 mL	Dominique Dutscher	2515074	Bacteriano culturas
Tubos de centrifugação de 50 mL Falcon		352051	Centrifugação de cultura
Etanol absoluto	VWR Chemicals	20821.321	Extração e purificação de RNA
Allegra X-12R Centrífuga	Beckman Coulter		Pelotização bacteriana
Ampicilina (amp)	Sigma-Aldrich	A9518-5G	Meio de crescimento
Resina de amilose	Novo Inglaterra BioLabs	E8021S	MS2-purificação de afinidade
Anti-dioxigenina AP Fragmento Fab	Sigma Aldrich	11093274910	Northern blot
de autorradiografia	ThermoFisher Scientific	50-212-726	Northern blot ensaios
BamHI	ThermoFisher Scientific	ER0051	Construção de plasmídeo
BHI (Infusão de Cérebro e Coração) Caldo	Sigma-Aldrich	53286	Meio de crescimento
Reagente de bloqueio	Sigma Aldrich	11096176001	Ensaios de Northern blot
CDP-Star	Sigma Aldrich	11759051001	Northern blot ensaios (substrato)
Centrífuga 5415 R	e purificação de RNA	Eppendorf
Clorofórmio	Dominique Dutscher	508320-CER	Extração de RNA e purificação
Mistura de marcação DIG-RNA	Sigma-Aldrich	11277073910	Ensaios de Northern blot
DNase I	Roche	4716728001	Tratamento DNase
Eritromicina (ery)	Sigma-Aldrich	Fluka 45673	Meio de crescimento
Dispositivo FastPrep	MP Biomedicals	116004500	Lise mecânica
Tiocianato	de guanídioEnsaios de Northern blot Sigma-Aldrich	G9277-250G
Hibridização Hoven Hybrigene	Techne	FHB4DD	Northern blot
Tubos de hibridização	Techne	FHB16	Northern blot
ensaios Álcool isoamílico	Fisher Scientific	A/6960/08	Extração e purificação de RNA
LB (Caldo de Lisogenia)	Sigma-Aldrich	L3022	Meio de crescimento
Matriz de lise B Bulk	MP Biomedicals	6540-428	Lise mecânica
MicroPulser Electroporator	BioRad	1652100	Construção de plasmídeo
Dispositivo de água Milli-Q	ultrapura	Millipore	Z00QSV0WW
Espectrofotômetro NanoDrop	ThermoFisher Scientific		Quantidade e qualidade
de RNA/DNAMembrana de nitrocelulose	Dominique Dutsher	10600002	ensaios de Northern blot
Phembact Neutre	PHEM Technologies	BAC03-5-11205	Limpeza e descontaminação
Fenol	Carl Roth	38.2	Extração e purificação de RNA
Phusion DNA polimerase de alta fidelidade	New England Biolabs	M0530	Construção de plasmídeo
pMBP-MS2	Addgene	65104	MS2-MBP produção
Poly-Prep coluna de cromatografia	BioRad	7311550	MS2-purificação de afinidade
PstI	ThermoFisher Scientific	ER0615	Construção de plasmídeo
Qubit 3 Fluorômetro	Invitrogen	15387293	quantidade de
RNA Solução	MP Biomedicals	6055050	Lise mecânica
Kit Completo ScriptSeq	Illumina	BB1224	Preparação de bibliotecas de cDNA
Espectrofotômetro Genesys 20	ThermoFisher Scientific	11972278	Culturas bacterianas
Dispositivo de vácuo SpeedVac Savant	ThermoFisher Scientific	DNA120	Extração e purificação de RNA
Stratalinker UV Crosslinker 1800	Stratagene	400672	Northern blot ensaios
T4 DNA ligase	ThermoFisher Scientific	EL0014	Construção de plasmídeo
TBE (Tris-Borato-EDTA)	Euromedex	ET020-C	Ensaios de Northern blot
ThermalCycler T100	BioRad	1861096	Construção de plasmídeo
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416-100ML	Northern blot
ensaios Processador de filme de raios-X	hu.q	HQ-350XT	Ensaios de Northern blot
Filmes de raios-X Super RX-N	FujiFilm	4741019318	Northern blot

ensaios Extração Água