Neste artigo, descrevemos o isolamento de células-tronco derivadas de tecido adiposo (ADSCs) derivadas de macacos rhesus usando um protocolo de digestão de tecido enzimático. Em seguida, descrevemos a proliferação de ADSC, que inclui descolamento, contagem e chapeamento celular. Por fim, a diferenciação do ADSC é descrita usando agentes indutores adipogênicos específicos. Além disso, descrevemos técnicas de coloração para confirmar a diferenciação.
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Artigo de método
Isolamento, Proliferação e Diferenciação de Células-Tronco Derivadas de Adiposos de Macacos Rhesus
Neste artigo
Resumo
Resumo
O tecido adiposo fornece uma fonte rica e acessível de células-tronco multipotentes, que são capazes de se auto-renovar. Essas células-tronco derivadas de tecido adiposo (ADSCs) fornecem um sistema celular ex vivo consistente que é funcionalmente semelhante ao dos adipócitos in vivo. O uso de ADSCs em pesquisas biomédicas permite a investigação celular da regulação e função metabólica do tecido adiposo. A diferenciação ADSC é necessária para a expansão adequada dos adipócitos, e a diferenciação subótima é um dos principais mecanismos da disfunção adiposa. Compreender as mudanças na diferenciação da ADSC é crucial para entender o desenvolvimento de disfunção metabólica e doença. Os protocolos descritos neste manuscrito, quando seguidos, produzirão adipócitos maduros que podem ser usados para vários testes funcionais in vitro para avaliar a função metabólica da ADSC, incluindo, entre outros, ensaios que medem a captação de glicose, lipólise, lipogênese e secreção. Os macacos Rhesus (Macaca mulatta) são fisiologicamente, anatomicamente e evolutivamente semelhantes aos seres humanos e, como tal, seus tecidos e células têm sido amplamente utilizados em pesquisas biomédicas e para o desenvolvimento de tratamentos. Aqui, descrevemos o isolamento do ADSC usando tecido adiposo subcutâneo e omental fresco obtido de macacos rhesus de 4 a 9 anos de idade. Amostras de tecido adiposo são digeridas enzimaticamente em colagenase seguidas de filtração e centrifugação para isolar ADSCs da fração vascular estromal. ADSCs isolados são proliferados em meio estromal seguidos por aproximadamente 14-21 dias de diferenciação usando um coquetel de 0,5 μg/mL de dexametasona, 0,5 mM de isobutilmetilxantina e 50 μM de indometacina em meio estromal. Os adipócitos maduros são observados em aproximadamente 14 dias de diferenciação. Neste manuscrito, descrevemos protocolos para isolamento, proliferação e diferenciação de ADSC in vitro. Embora tenhamos nos concentrado em ADSCs do tecido adiposo de macacos rhesus, esses protocolos podem ser utilizados para tecido adiposo obtido de outros animais com ajustes mínimos.
Introdução
O tecido adiposo é composto por uma mistura heterogênea de células, adipócitos predominantemente maduros e uma fração vascular estromal, incluindo fibroblastos, células imunes e células-tronco derivadas de tecido adiposo (ADSCs)1,2,3. As ADSCs primárias podem ser isoladas diretamente do tecido adiposo branco e estimuladas a se diferenciar em adipócitos, cartilagens ou células ósseas4. Os ADSCs exibem características clássicas de células-tronco, como manutenção da multipotência in vitro e auto-renovação; e são aderentes ao plástico na cultura
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Protocolo
Todos os tecidos e procedimentos obtidos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais no Centro de Ciências da Saúde da Louisiana State University e foram realizados de acordo com as diretrizes do Instituto Nacional de Saúde (publicação do NIH No. 85-12, revisada em 1996).
1. Preparação de tampões e soluções
- Preparar solução estéril de lavagem salina tamponada com 5-fosfato (5-PBS) adicionando 5% de penicilina/estreptomicina (pen/estreptopsia) e 0,25 μg/mL de inibidor fúngico a 1x PBS. Preparar solução estéril de tampão de lavagem 2-PBS (2-PBS) adicionando 2% de caneta/estreptococo e 0,25 μg/mL de inibido....
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Resultados
Os ADSCs isolados de amostras de tecido adiposo de macacos rhesus foram semeados em placas de cultura e são mostrados na Figura 1. No dia do plaqueamento, as células não aderem e flutuam no prato de cultura, como mostra a Figura 1A. Dentro de 72 h, os ADSCs se tornarão 80% confluentes e estarão prontos para a diferenciação de adipócitos (Figura 1B). Os ADSCs exibem fortes características adipogênicas após a indução química. Após 14 .......
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Discussão
Os protocolos de isolamento, proliferação e diferenciação do ADSC são simples e reprodutíveis, mas exigem técnica cuidadosa para garantir isolamento adequado, expansão saudável e diferenciação eficiente. Um ambiente de trabalho estéril é fundamental para todos os experimentos de cultura de células. Bactérias ou fungos podem ser introduzidos em culturas de células através de ferramentas, meios ou ambientes de trabalho contaminados. A contaminação fúngica é indicada pelo crescimento de esporos na cultura, enquanto a contam.......
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Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Curtis Vande Stouwe por sua assistência técnica. A pesquisa subjacente ao desenvolvimento dos protocolos foi apoiada por doações do Instituto Nacional de Abuso de Álcool e Alcoolismo (5P60AA009803-25, 5T32AA007577-20 e 1F31AA028459-01).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,4% azul de tripano | Thermo-Fisher | 15250061 | |
| tubo de microcentrífuga de 1,5 ml | Dot Scientific | 707-FTG | |
| 100% isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1838-P | |
| Placa de cultura de células de 100 mm | Corning | 430167 | |
| 3-Isobutil-1-metilxantina | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 50-mL tubo cônico de plástico | Fisher Scientific | 50-465-232 | |
| 70-µ filtro de células m | Corning | CLS431751 | |
| a-MEM | Thermo-Fisher | 12561056 | |
| folha de alumínio | Reynolds Wrap | ||
| BODIPY | Thermo-Fisher | D3922 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma-Aldrich | 05470 | |
| Centrífuga | Eppendorf | 5810 R | |
| Colagenase, Tipo I | Thermo-Fisher | 17100017 | |
| Dexametasona-Solúvel em Água | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| Dimetil sulfóxido, DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Água destilada | Thermo-Fisher | 15230162 | |
| Soro Fetal Bovino, aprovado pelo USDA | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fungizone/Anfotericina B (250 ug/mL) | Thermo-Fisher | 15290018 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14175095 | |
| Hemacitômetro com lamínula | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Indometacina | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Microscópio de luz invertida | Nikon | DIAPHOT-TMD | |
| L-glutamina (200 mM) | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Balancim de laboratório, 0,5 a 1,0 Hz | Modelo Científico Confiável | 55 Balanços | |
| Formalina tamponada neutra (10%) | Pharmco | 8BUFF-FORM | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Paraformeldeído | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4 | Tampão de | Thermo-Fisher 10010023 | |
| Pipetas sorológicas | |||
| C, 5% CO2 | Sanyo | MCO-17AIC | |
| Tripsina-EDTA (0,25%) | Thermo-Fisher | 25200056 |
Referências
- Fain, J. N. Release of interleukins and other inflammatory cytokines by human adipose tissue is enhanced in obesity and primarily due to the nonfat cells. Vitamins and Hormones. 74, 443-477 (2006).
- Ibrahim, M. M.
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Reimpressões e permissões
