Artigo de método

Gerando Modelos Experimentais Agudos e Crônicos de Expressão Tic Motor em Ratos

DOI:

10.3791/61743

⸱

27 de maio de 2021

 ,  , 
1The Leslie & Susan Goldschmied (Gonda) Multidisciplinary Brain Research Center, Bar-Ilan University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apresentamos protocolos para gerar modelos experimentais agudos e crônicos de expressão ática em ratos que se comportam livremente. Os modelos são baseados na implantação de cânula striatal e subsequente aplicação antagonista GABAA. O modelo agudo utiliza injeções transitórias, enquanto o modelo crônico utiliza infusões prolongadas através de uma mini-bomba osmótica implantada subcutânea.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os tiques motores são movimentos repentinos, rápidos e recorrentes que são os principais sintomas da síndrome de Tourette e outros distúrbios tiques. A fisiopatologia da geração ática está associada à inibição anormal do gânglio basal, particularmente sua estrutura primária de entrada, o estriato. Em modelos animais de roedores e primatas não humanos, a aplicação local de antagonistas GABAA, como bicucullina e picrotoxina, nas partes motoras do estriado induz a desinibição local resultando na expressão de tiques motores.

Aqui, apresentamos modelos agudos e crônicos de tiques motores em ratos. No modelo agudo, microinjeções bicucullinas através de uma cânula implantada no estriado dorsal provocam a expressão de tiques que duram por curtos períodos de tempo de até uma hora. O modelo crônico é uma alternativa que permite a extensão da expressão ática para períodos de vários dias ou até semanas, utilizando a infusão contínua de bicuculina através de uma mini-bomba sub-cutânea mini-osmótica.

Os modelos permitem o estudo dos mecanismos comportamentais e neurais da geração ática em toda a via gânglio cortico-basal. Os modelos suportam a implantação de dispositivos adicionais de gravação e estimulação, além das cânulas de injeção, permitindo assim uma grande variedade de usos, como estimulação elétrica e óptica e gravações eletrofisiológicas. Cada método tem diferentes vantagens e deficiências: o modelo agudo permite a comparação das propriedades cinemáticas do movimento e das mudanças eletrofisiológicas correspondentes antes, durante e depois da expressão ática e os efeitos dos moduladores de curto prazo na expressão ática. Este modelo agudo é simples de estabelecer; no entanto, está limitado a um curto período de tempo. O modelo crônico, embora mais complexo, viabiliza o estudo da dinâmica ática e dos efeitos comportamentais na expressão ática em períodos prolongados. Assim, o tipo de consulta empírica impulsiona a escolha entre esses dois modelos complementares de expressão tique.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os tiques são o sintoma definidor da síndrome de Tourette (TS) e outros distúrbios tiques. Os tiques são descritos como movimentos repentinos, rápidos e recorrentes (tiques motores) ou vocalizações (tiques vocais)1. A expressão tic normalmente flutua em sua temporal (frequência)2 e espacial (intensidade, localização corporal)3 propriedades em múltiplas escalas de tempo (horas, dias, meses e anos). Essas mudanças são afetadas por diferentes fatores, como características ambientais4,5, estados comportamentais6,7e supressão voluntária e temporária8.

Embora o mecanismo neuronal que rege os tiques motores ainda não seja totalmente compreendido, um número crescente de estudos teóricos e experimentais têm fornecido novas evidências quanto à sua natureza9. Atualmente, acredita-se que a fisiopatologia da geração ática envolva o laço cortico-basal gânglio (CBG), e especificamente está associada à inibição anormal do estriado, o núcleo de entrada basal basal primário10,11,12. Estudos anteriores em roedores e primatas demonstraram que o estriado pode ser desinibido pela aplicação local de diferentes antagonistas gabaA, como bicucullina e picrotoxina13,14,15,16,17,18. Esta intervenção farmacológica leva à expressão motora transitória no lado contralateral da injeção, estabelecendo assim um modelo agudo robusto de distúrbios áticos com validade facial e de construção. O modelo agudo é simples de induzir e permite estudar os efeitos da modulação de curto prazo, como estimulação elétrica e óptica simultânea com gravações eletrofisiológicas e cinemáticas antes, durante e depois da expressão ática. No entanto, o modelo agudo é limitado ao curto período de tempo após a injeção. Com base no modelo agudo, propusemos recentemente um modelo crônico de geração ática em ratos que utiliza uma infusão prolongada de taxa fixa de bicuculina ao estriato através de uma mini-bomba osmótica subcutânea implantada19. Este modelo estende o período de expressão tic para vários dias/semanas. A liberação constante da bicucullina durante um longo período de tempo permite o exame dos efeitos de uma variedade de fatores, como tratamentos farmacológicos e estados comportamentais na expressão ática.

Aqui, apresentamos protocolos para gerar os modelos agudos e crônicos de expressão tique em ratos. Em função da questão específica da pesquisa, os protocolos permitem o ajuste fino dos parâmetros, incluindo implantação unilateral versus bilateral, o local dos tiques (de acordo com a organização somatotópica do estriado)18 e o ângulo da cânula do implante (dependendo da localização de dispositivos implantados adicionais). O método utilizado no modelo crônico é parcialmente baseado em produtos comerciais, mas com ajustes críticos para se adequar ao modelo tique. Este artigo detalha os ajustes necessários para adaptar a alfaiataria personalizada desses modelos tic.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os procedimentos foram aprovados e supervisionados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais e aderiram ao Guia Nacional de Atenção e Uso de Animais de Laboratório e às Diretrizes da Universidade Bar-Ilan para o Uso e Cuidado de Animais laboratoriais em Pesquisa. Este protocolo foi aprovado pelo Comitê Nacional de Experimentos em Animais de Laboratório do Ministério da Saúde.

NOTA: Este protocolo utiliza ratos long-evans femininos (modelos agudos e crônicos) e ratos esvais fêmeas Sprague Dawley (modelo agudo) com idades entre 3 e 10 meses, 280-350 g. A implementação desses modelos em outras cepas, pesos ou idades deve ser testada cuidadosamente para diferentes reações.

1. Modelo agudo

  1. Preparação pré-cirurgia
    1. Preparação implant-cânula
      NOTA: A cânula do implante permite injeções de bicucullina local no estriado.
      1. Corte um tubo de ultranula de aço inoxidável de 25 G (OD 0,02'', ID 0,015'') para obter um implante-cânula(Figura 1, dispositivo #1). Use uma ferramenta rotativa para alcançar bordas retas. O comprimento da cânula depende da profundidade do alvo de implantação, do ângulo de implantação da cânula e da altura final da tampa cimentada. A profundidade do alvo de implantação precisa ser 2 mm (0,079'') maior do que a meta final de injeção para evitar danos teciduais.
        NOTA: O objeto mais alto implantado determina a altura da tampa.
      2. Areia e suavizar as bordas do implante-cânula, prevenindo atrito mecânico adicional ao cérebro. Insira uma agulha de 30 G (0,01') através dela para remover quaisquer obstruções internas.
    2. Preparação manequim
      NOTA: O boneco é um fio interno removível colocado dentro da cânula implantada. O boneco sela a cânula implantada, evitando assim sua obstrução.
      1. Faça um boneco cortando um fio de 0,013'' com uma ferramenta rotativa. O boneco deve ser 3 mm (0,118'') mais longo do que o comprimento da cânula do implante(Figura 1, dispositivo #2).
      2. Insira o boneco na cânula do implante até chegar ao final. Dobre o excesso de arame apertando-o contra a cânula. A parte dobrada deve estar alinhada com a cânula do implante para evitar que o boneco caia da cânula implantada, e para evitar que o rato a remova.
    3. Preparação do injetor
      NOTA: O injetor, composto por um tubo flexível e uma cânula de injeção(Figura 1, dispositivo #3), permite a injeção direta de bicucullina no estriado.
      1. Corte um tubo flexível de microbore polímero flexível de 70 cm (OD 0,06'', ID 0,02')(Figura1,dispositivo #3.1).
        NOTA: O comprimento do tubo flexível é definido pela distância entre a gaiola experimental e a localização da máquina da bomba de infusão. Deve ser tempo suficiente para permitir a livre circulação do rato durante o período de injeção, mas não muito longo, para evitar que o rato fique preso nele (ver Figura 3A).
      2. Corte um tubo de ultranula de aço inoxidável de 30 G (OD 0,012'', ID 0,007'') para obter injeção-cânula(Figura 1, dispositivo #3.2). Use uma ferramenta rotativa para alcançar bordas retas. Deve medir 5 mm (0,197'') mais longo do que a cânula do implante: 2 mm (0,079'') mais longo do que a cânula implantada dentro do cérebro para atingir o alvo final de injeção, e 3 mm (0,118'') para inseri-lo no tubo flexível.
      3. Areia e suavizar a ponta da cânula de injeção, prevenindo atrito mecânico adicional ao cérebro. Insira um fio medindo 0,005'' de diâmetro para verificar se ele está desobstruído.
      4. Insira 3 mm (0,118'') da cânula de injeção no tubo flexível e cole a articulação entre eles, para obter um injetor. Use cola cianoacrilato (CA) e acelerador CA.
      5. Coloque uma seringa com agulha de 25 G (0,018') cheia de água estéril ao injetor e lave-a. Isso garante que a orientação de fluxo que sai da cânula de injeção seja reta e sem esforço. Crucialmente, se o fluxo não estiver reto, use a ponta da agulha de 30 G (OD 0,01'') para remover quaisquer obstruções e aumentar o orifício da cânula de injeção e verificar o fluxo.
    4. Preparação do portador da cânula
      NOTA: O suporte à cânula está conectado ao braço estereotaxista e segura a cânula do implante durante a implantação. O suporte à cânula consiste em base portador de cânula e chumbo portador de cânula, que são colados(Figura 1, dispositivo #4). Durante a implantação, a base portadora de cânula é anexada ao braço estereotaxista, e o chumbo portador de cânula é anexado à cânula do implante.
      1. Base portadora de cânula: Corte 10 cm (3.947'') de aço inoxidável, 22 G (OD 0,028'', ID 0,017'') hipo-tubo(Figura 1, dispositivo #4.1).
      2. Chumbo portador de cânula: Corte o fio de 0,013'' a um comprimento de 3 mm (0,118'') mais longo do que a cânula de implante desejada(Figura 1,dispositivo #4,2).
      3. Insira o chumbo portador de cânula na base portador da cânula e cole a articulação entre eles, usando cola CA e acelerador CA. O chumbo deve ser 1 mm (0,039'') mais curto que o implante-cânula, para evitar danos teciduais durante a implantação.
    5. Preparação bicuculina: dissolver methiodeto bicucullina em soro fisiológico ou líquido cerebrospinal artificial (ACSF) a uma concentração final de 1 μg/μL. Divida a bicuculina dissolvida em seringas de 1 mL, cubra com papel alumínio e congele a -20 °C até que seja necessário. Quando necessário, descongele a seringa antes de usar.
  2. cirurgia
    1. Induzir anestesia inicial colocando o rato em uma câmara projetada e entregar isoflurane de 4-5% misturado com um oxigênio a uma taxa de 0,5-1 L/min. Em seguida, injete a mistura intramuscular de rato (IM ou IP) com cetamina e xylazina (100 e 10 mg/kg, respectivamente).
    2. Raspe a cabeça do rato usando um cortador elétrico.
    3. Coloque gel de lidocaína nas orelhas do rato. Coloque geleia de petróleo nos olhos do rato para evitar a secagem e o trauma da córnea.
    4. Fixar o rato na estrutura estereotática usando barras de ouvido e barra de dentes.
    5. Limpe o couro cabeludo do rato com iodo povidone e depois com álcool para esterilizar a área. Infiltrar-se ao longo da linha de incisão desejada com solução de lidocaína de 0,5 - 1% subcutânea (SC). Usando uma lâmina de bisturi, faça uma incisão ao longo do couro cabeludo.
    6. Puxe a fáscia em direção às bordas para abrir a área cirúrgica.
    7. Limpe o crânio com soro fisiológico estéril, usando cotonetes de algodão. Em caso de sangramento, use um cauterizador para cauterizar o capilar do sangue. Este passo é crucial para a estabilidade do limite ao longo do tempo.
    8. Fixar a fáscia com quatro hemostatas curvas (duas anteriores, duas posteriores) para ampliar o local cirúrgico.
    9. Meça as coordenadas bregma e lambda. Nivele as coordenadas dorsoventral (DV) dos dois pontos, de modo que estejam dentro de uma faixa de 100 μm.
    10. Utilizando o aparelho estereotaxico, meça e marque as coordenadas das áreas de interesse e dos parafusos de âncora a serem implantados. As coordenadas de cânula de implantação reta para indução ática na área de membros dianteiros são: AP: +1 a +1,5, mL: ±2,5, DV: 3; área de escalada: AP: -0,4 a -0,5, mL: ±3.5, DV:318,20.
      NOTA: No caso da implantação de múltiplos dispositivos que impedem a implantação da cânula reto, altere o ângulo da implantação da cânula e suas coordenadas em conformidade (coordenadas forelimb: AP: +2,7, mL: ±2,5, DV: 3, ângulo 15° de anterior para posterior).
    11. Faça furos no crânio sob o microscópio. Use uma máquina de perfuração dentária com brocas redondas de 1/4-1/2 bits de tamanho. Para minimizar os riscos de lesões cerebrais, ajuste a velocidade da broca de acordo com as habilidades de perfuração e evite qualquer pressão mecânica. Perfurar até que o cérebro esteja visível, por cerca de 1 mm. Absorva qualquer sangue com um cotonete e lave com soro fisiológico estéril.
      NOTA: Os parafusos da âncora servem para estabilizar a tampa. Certifique-se de que os parafusos estão localizados em ambos os hemisférios e ao longo do eixo anterior-posterior.
    12. Implantação de cânula
      1. Enrosque os parafusos da âncora nos orifícios. Use parafusos de aço inoxidável #0 x 1/8.
        NOTA: O número de parafusos de âncora depende do número total de dispositivos implantados. Os parafusos aterrados (por exemplo, para as gravações elétricas ou estimulações elétricas) devem atingir a superfície cerebral.
      2. Coloque o suporte de cânula no braço estereotaxista.
      3. Deslize a cânula de implante no suporte da cânula. Posicione lentamente a cânula-implante acima do orifício até chegar ao cérebro.
      4. Meça as coordenadas dv a partir da superfície cerebral. Abaixe a cânula do implante até o alvo de implantação. Absorva qualquer sangue que sai do buraco com um cotonete, lave com soro fisiológico e depois seque completamente.
      5. Cole a cânula implantada no crânio usando cola de gel. Espere até secar.
      6. Aplique cimento dentário ao longo da cânula implantada para anexá-lo ao crânio. Deixe 2 mm (0,079'') estender-se a partir de sua extremidade superior para permitir a inserção manequim. Espere até secar.
        NOTA: Não coloque cimento no suporte da cânula.
      7. Levante o suporte de cânula, deixando a cânula implantada no lugar.
      8. Insira o boneco na cânula implantada.
      9. Implante todos os outros dispositivos, como conjuntos de gravação, fibras ópticas, eletrodos de estimulação etc. Aplique cimento dentário sobre o resto do crânio, cobrindo todos os implantes.
      10. Injete 3 mL de temperatura ambiente Solução ringer e carprofen 5 mg/kg SC21.
      11. Monitore o rato até que ele recupere a consciência (o animal está ereto, tem controle de suas vias aéreas e não corre perigo de aspiração). Devolva o rato para sua gaiola para recuperação total.
  3. Microinjeções
    NOTA: Durante a injeção, é crucial verificar se o fluxo da bicucullina está intacto. Isso pode ser feito deixando uma pequena bolha de ar se formar no injetor e monitorando seu movimento. O volume restante do injetor pode ser preenchido com soro fisiológico, de modo que nenhuma bicucullina seja desperdiçada.
    1. Conecte o injetor a uma seringa bicuculina com uma agulha de 25 G (OD 0,018''). Encha ~1/3-1/2 do injetor e remova a seringa, permitindo a formação de uma pequena bolha de ar.
    2. Conecte o injetor a uma seringa estéril cheia de soro fisiológico com uma agulha de 25 G (OD 0,018''). Encha o injetor até que a bicucullina chegue ao final e uma pequena gota saia dele.
    3. Remova o êmbolo de uma microsinga de vidro de precisão de 10 μL.
    4. Corte e conecte um tubo de polímero flexível curto (~3 cm, 1.181')) à microsinga de vidro de precisão.
    5. Conecte a outra extremidade do tubo flexível curto a uma seringa de 1 mL, agulha de 25 G (OD 0,018'') cheia de água estéril.
    6. Injete água através do tubo curto-flexível no microsinge de vidro de precisão até que a água saia dele. Desconecte o tubo flexível curto.
    7. Reinserir o êmbolo até atingir a marca de ~7 μL na microsiringe de vidro de precisão.
    8. Insira o microsinge de vidro de precisão no slot destinado na máquina da bomba de infusão.
    9. Conecte o injetor à microsiinge de vidro de precisão e configure as configurações a uma taxa de 0,35 μL/min e um volume total de 0,35 μL.
    10. Coloque um lenço de papel sob a ponta do injetor. Marque a localização da bolha de ar no injetor, inicie a máquina da bomba de infusão e verifique se uma gota de bicucullina aparece. Após a injeção, marque novamente a localização da bolha de ar.
      NOTA: A diferença entre as duas marcas corresponde à diferença desejada durante a injeção experimental.
    11. Coloque o rato na gaiola experimental e remova o boneco.
    12. Insira o injetor na cânula implantada até a extremidade (ver Figura 3A).
    13. Ligue a máquina da bomba de infusão. Verifique se a bolha de ar está se movendo. Inicie o cronômetro para acompanhar os tempos de iniciação e término do tique.
    14. Um minuto após a injeção, remova o injetor e reinsera lentamente o boneco.
      NOTA: Inserir o boneco após a injeção empurra a bicucullina para dentro do alvo de injeção.
  4. Pós-injeção
    1. Desconecte o injetor da microsinga de vidro de precisão.
    2. Lave a solução restante do injetor, usando uma seringa cheia de ar. Limpe o injetor com água estéril e depois drene-o injetando ar através do injetor.
    3. Desconecte o microsinge de vidro de precisão da máquina da bomba de infusão e limpe-a com água estéril.

2. Modelo crônico

  1. Preparação pré-cirurgia
    1. Preparação do guia de cânula
      NOTA: O guia de cânula faz parte do tubo de infusão e é usado para anexar a cânula de infusão ao suporte de cânula durante a implantação.
      1. Corte 12 mm (0,472'') de aço inoxidável, 25 G (OD 0,02'', ID 0,015'') hipo-tubo para obter uma guia de cânula(Figura 2, dispositivo #1). Use uma ferramenta rotativa para alcançar bordas retas.
      2. Prepare um suporte de cânula conforme descrito na etapa 1.1.4. Insira o suporte de cânula no guia da cânula para verificar se está bem preso e remova-o.
    2. Preparação infusão-cânula
      NOTA: A infusão-cânula também faz parte do tubo de infusão. É implantado no alvo final do estriado e permite a infusão focal de bicucullina.
      1. Corte de aço inoxidável, 30 G (OD 0,012'', ID 0,007'') hipo-tubo para obter uma infusão-cânula. Use uma ferramenta rotativa para alcançar bordas retas. O comprimento total da infusão-cânula é a soma da profundidade de implantação desejada mais um fator de segurança (~1-2 mm, 0,039'''-0,079''), a parte dobrada da infusão-cânula (2 mm, 0,079''), a sobreposição com a guia cânula (3 mm, 0,118'') e a parte horizontal (4 mm, 0,157'')(Figura 2, dispositivo #2).
        NOTA: Ao contrário do modelo agudo, a profundidade de implantação é igual ao alvo final de infusão.
      2. Insira um fio de 0,005'' de diâmetro na cânula de infusão e dobre-os em uma forma L no local pretendido. A parte vertical corresponde à profundidade de implantação desejada mais 4-5 mm (0,157''-0,197''), e a parte horizontal é de 4 mm (0,157'') de comprimento.
        NOTA: A inserção do fio interno evita a obstrução da cânula durante a dobra.
    3. Preparação flexível de tubos de cateter
      NOTA: É também um componente do tubo de infusão. Conecta a infusão-cânula à bomba mini-osmótica através de um adaptador de tubulação.
      1. Corte 8 cm (3.149'') de tubos de polietileno (PE)-10 (ID 0,011'', OD 0,025'')(Figura 2, dispositivo #3).
        NOTA: O comprimento do cateter é determinado pela distância entre o alvo de implantação e o local da bomba, permitindo a livre circulação da cabeça e pescoço do rato (ver Figura 3B).
    4. Montagem do tubo de infusão
      NOTA: O tubo de infusão conduz a bicuculina da mini-bomba osmótica para o cérebro. Consiste no guia de cânula, na infusão-cânula, no cateter flexível, no adaptador de tubulação e no moderador de fluxo(Figura 2).
      1. Remova o fio interno da cânula de infusão. Inspecione a cânula sob o microscópio para certificar-se de que suas bordas estão abertas e limpas em ambos os lados; se não, use uma agulha de 30 G (OD 0,01'') para abri-la.
      2. Cole a guia de cânula na seção vertical da cânula de infusão, perto da parte dobrada, na sobreposição de 3 mm (0,118''), utilizando cola CA e acelerador CA.
      3. Insira a parte horizontal da infusão-cânula no cateter flexível. A sobreposição deve ser de pelo menos 2 mm (0,079').
      4. Ejete a tampa translúcida do moderador de fluxo da bomba. Isso revelará o tubo de cânula de aço inoxidável curto(Figura 2, dispositivo #5.1).
        NOTA: O moderador de fluxo faz parte do kit de bomba mini-osmótica. É composto por uma tampa translúcida, uma pequena parte de cânula, uma flange branca e uma longa parte de cânula. A longa parte da cânula é inserida na bomba mini-osmótica e a parte cânula curta é conectada ao cateter-tubing via adaptador de tubulação.
      5. Mergulhe o adaptador de tubos(Figura 2, dispositivo #4) em 70% de álcool. Aguarde vários minutos para permitir que o material incha.
      6. Conecte o adaptador de tubulação à parte cancula curta do moderador de fluxo, até que toque na flange branca(Figura 2, dispositivo #5.2). O adaptador de tubulação encolherá no ar para formar uma conexão selada apertada.
      7. Insira o cateter flexível na extremidade aberta do adaptador de tubulação, até que toque a pequena parte da cânula do moderador de fluxo.
      8. Segure a longa canula-parte(Figura 2, dispositivo #5.3) usando um suporte de clipe e cole todas as conexões. As conexões estão entre o adaptador de tubulação e flange branca, o adaptador de tubulação e o tubo flexível do cateter, e finalmente o cateter flexível e a parte horizontal da infusão-cânula. Aguarde várias horas até que a cola esteja completamente seca (dependendo do tipo de cola).
        NOTA: Use adesivo compatível com PE para evitar que as conexões se soltem.
      9. Injete água estéril através da longa parte da cânula do tubo de infusão, usando uma seringa com uma agulha cega de 27 G (0,014''). Verifique se a água flui suavemente através da cânula de infusão. Injete ar através do tubo de infusão para drenar a água.
    5. Priming da mini-bomba osmótica
      NOTA: O escoramento é um procedimento de partida que permite que a bomba inicie a infusão imediatamente após a implantação.
      1. Encha um banho de aquecimento com água à temperatura corporal (~37 °C). Encha um pequeno béquer com soro fisiológico e coloque-o no banho de aquecimento.
      2. Enrole a mini bomba osmótica com uma limpeza de papel e fixe-a verticalmente com a abertura voltada para cima, usando um suporte de clipe.
      3. Encha a bomba com ACSF usando uma seringa com uma agulha cega de 27 G (0,014''). Ao remover a seringa, continue injetando o ACSF para evitar que o ar entre. Uma bolha ACSF aparecerá na abertura da bomba.
        NOTA: A infusão inicial de ACSF permite que o rato se recupere totalmente da cirurgia antes que os tiques sejam induzidos. Opcionalmente, a bomba cheia de bicucullina pode ser implantada durante a cirurgia primária para evitar a substituição da bomba seguinte, mas não é ótima19.
      4. Conecte uma seringa, 27 G (0,014'') agulha cega à longa parte da cânula do tubo de infusão e injete ACSF através dela. Ao remover a seringa, continue injetando o ACSF, para evitar que o ar entre. Uma bolha ACSF aparecerá na longa parte da cânula.
      5. Insira a longa parte da cânula na bomba, bolha para bolha. Uma bolha ACSF deve aparecer na ponta da cânula de infusão.
      6. Coloque a bomba no béquer. Prime a bomba, presa ao tubo de infusão, por pelo menos 4-6 horas (a ~37 °C) antes da implantação da bomba. Certifique-se de que apenas a bomba entra em contato com o soro fisiológico.
    6. Cirurgia de implantação da bomba
      1. Anestesiar o rato de acordo com o protocolo de anestesia. Veja o passo 1.2.1.
      2. Raspe a cabeça e as costas do rato, usando um cortador elétrico, ligeiramente posterior à escápula.
      3. Realizar as etapas básicas da cirurgia, conforme descrito nas etapas 1.2.3-1.2.11. A incisão deve ser ao longo do couro cabeludo até o osso occipital.
      4. Esterilize um hemostat grande (~14 cm de comprimento, 5.512'') em autoclave. Insira o hemosta através da incisão e crie um bolso subcutâneo nas costas do rato, abrindo-o alternadamente e fechando-o sob a pele através da linha midscapular.
        NOTA: O bolso deve ser grande o suficiente para conter a bomba e permitir que ela se mova ligeiramente.
    7. Mini-bomba osmótica e implantação do tubo de infusão
      1. Coloque o suporte de cânula no braço estereotaxista e coloque-o na posição desejada para implantação.
      2. Retire a bomba do banho de aquecimento e coloque-a nas costas do rato coberta com uma limpeza de papel.
      3. Deslize a canânula-guia do tubo de infusão no suporte da cânula.
      4. Segure a bomba com um hemostat e insira-a suavemente no bolso subcutâneo.
      5. Implante os parafusos da âncora.
        NOTA: Implante os parafusos da âncora após a inserção da bomba, para evitar o bloqueio da abertura do bolso e antes da implantação da cânula para evitar o deslocamento da cânula.
      6. Implante a cânula de infusão no alvo e cole-a no crânio usando cola de gel. Espere até secar. As coordenadas para indução de membros dianteiros são: AP: +1 a +1,5, mL: ±2,5, DV: 5.
      7. Aplique cimento dentário ao longo da cânula de infusão para fixá-lo no crânio. Espere até secar.
      8. Levante o suporte de cânula deixando a cânula implantada no lugar.
      9. Implante todos os outros dispositivos. Aplique cimento dentário no resto do crânio, cobrindo todos os implantes. Deixe tubos flexíveis suficientes no bolso subcutâneo sem fixação para permitir a livre circulação do rato.
        NOTA: Certifique-se de que não há áreas expostas entre o crânio e a abertura do bolso, e que o cateter não está dobrado.
      10. Finalize a cirurgia conforme detalhado nas etapas 1.2.12.10-1.2.12.11.
  2. Cirurgia de substituição da bomba
    NOTA: Cada tipo de bomba mini-osmótica tem seu próprio período de infusão de entrega predeterminada. Assim, a cirurgia de substituição da bomba deve ser realizada antes da data de validade.
    1. Preparação pré-cirurgia
      1. Repetição de passos 2.1.5.1-2.1.5.2.
      2. Encha a bomba com bicucullina usando uma seringa com uma agulha cega de 27 G (0,014''). Ao remover a seringa, continue injetando bicucullina, para evitar que o ar entre.
      3. Insira o moderador de fluxo (ligado à tampa translúcida) dentro da bomba.
      4. Coloque a bomba no béquer. Prime a bomba por pelo menos 4-6 horas (a ~37 °C) antes da substituição da bomba.
    2. cirurgia
      1. Anestesiar o rato (ver passo 1.2.1.1) e raspar as costas usando um cortador elétrico.
      2. Limpe as costas do rato com iodo povidone e depois com uma limpeza de álcool para esterilizar a área. Infiltrar-se ao longo da linha de incisão desejada com uma solução de lidocaína de 0,5-1% (SC).
      3. Faça uma incisão na pele acima da bomba implantada. Lave o bolso com ACSF de temperatura ambiente e seque com gazes. Use cortinas descartáveis autoclavadas para cobrir a área próxima à incisão.
      4. Retire a bomba preenchida pelo ACSF do moderador de fluxo usando um hemostat e descarte.
      5. Remova a bomba cheia de bicucullina do banho de aquecimento. Despegue e descarte o moderador de fluxo da bomba cheia de bicucullina.
      6. Conecte suavemente a bomba cheia de bicucullina ao moderador de fluxo implantado. Evite tocar na pele circundante.
        NOTA: As etapas 2.2.2.4-2.2.2.6 devem ser executadas rapidamente para evitar bolhas de ar. No entanto, a bomba deve ser inserida lentamente para evitar a entrada rápida de bicucullina no cérebro.
      7. Pressione as duas margens da incisão juntas, usando fórceps. Cole a linha de incisão com um adesivo de tecido. Como alternativa, feche a incisão usando suturas.
      8. Cotonize a área com iodo povidone e finalize a cirurgia conforme detalhado nas etapas 1.2.12.10-1.2.12.11.

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Resultados

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Foram apresentados protocolos para geração dos modelos agudos e crônicos de indução ática em ratos. Os protocolos abrangem a preparação completa para cirurgia e experimentos (Figura 1 para o modelo agudo, Figura 2 para o modelo crônico). A aplicação da bicucullina nas áreas motoras do estriato resulta na expressão de tiques motores em curso. Os tiques aparecem no lado contralateral da aplicação e são caracterizados por contrações musculares breves e repetitivas....

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Discussão

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Neste manuscrito, detalhamos os protocolos dos modelos agudos e crônicos para indução ática em um rato que se comporta livremente. Esses protocolos descrevem a preparação de todos os componentes, a cirurgia e o processo experimental que pode ser adaptado para personalização para atender às necessidades específicas da pesquisa. O princípio principal subjacente a esses modelos é a aplicação local direta da bicuculina às áreas motoras do estriato, que é conhecida por desempenhar um papel fundamental na fisiopatologia dos tr...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Este estudo foi apoiado em parte por uma bolsa da Israel Science Foundation (ISF) (297/18). Os autores agradecem a M. Bronfeld por estabelecer o modelo de roedor agudo e M. Israelashvili por seus comentários.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Parafusos de ancoragemMicro FixadoresSMPPS0002#0 x 1/8 - Parafusos de chapa metálica de cabeça cilíndrica
Metiodeto bicuculinoSigma Aldrich14343
Acelerador de cianoacrilato (CA)ZapPT29
Cola de cianoacrilato (CA)BSIIC-2000Esta cola foi considerada mais forte do que outras
Cimento dentárioColteneH00322Material de reparo higiênico Perm Reline Resina autopolimerizável
Cola gelLoctiteUltra Gel Controle
HemostatWPI501242Qualquer hemostático de aproximadamente 14 cm seria suficiente
Hipo-tubo, parede extra-fina 25GEmpresa de fornecimento de componentesHTX-25X
Hipo-tubo, parede regular 22GEmpresa de fornecimento de componentesHTX-22R
Hipotubo, parede regular 30GFornecimento de componentes empresaHTX-30R
Máquina de bomba de infusãoNew Era Pump SystemsNE-1000
Bomba mini-osmóticaALZET20011.0µ l por hora, 7 dias
Adesivo compatível com PECEYSPlásticos difíceis especiais (adequados para PE)
Tubo de cateter PE-10ALZETPE-10ID = 0,28 mm, OD = 0,61 mm
Microsseringa de vidro de precisão, 10µ lHamilton800651701 RNR 10µ l syr (22s/51/3)
Adesivo de tecido3M1469Sb
Vetbond Tubo-adaptadorCMA3409500
Tygon micro furo tubulação, 0,02 polegadas ID * 0,06 ODEmpresa de fornecimento de componentesTND80-020
Fio 0,005 polegadasEmpresa de fornecimento de componentesGWX-0050
Fio 0,013 polegadasEmpresa de fornecimento de componentesGWX-0130

Referências

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