Este protocolo experimental descreve o isolamento de CBSCs de amostras de células e tecidos de câncer de mama, bem como os ensaios in vitro e in vivo que podem ser usados para avaliar o fenótipo e a função do CBSC.
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Artigo de método
Isolamento e Avaliação Funcional de Células-Tronco de Câncer de Mama Humano de Amostras de Células e Tecidos
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células-tronco do câncer de mama (CBSCs) são células cancerígenas com características hereditárias ou adquiridas semelhantes a células-tronco. Apesar de sua baixa frequência, eles são os principais contribuintes para o início do câncer de mama, recaída, metástase e resistência à terapia. É imperativo entender a biologia das células-tronco do câncer de mama, a fim de identificar novos alvos terapêuticos para tratar o câncer de mama. As células-tronco do câncer de mama são isoladas e caracterizadas com base na expressão de marcadores únicos da superfície celular, como CD44, CD24 e atividade enzimática da aldeído desidrogenase (ALDH). Essas células CD44+CD24-altasde ALDH constituem a população de CBSC e podem ser isoladas por classificação celular ativada por fluorescência (FACS) para estudos funcionais a jusante. Dependendo da questão científica, diferentes métodos in vitro e in vivo podem ser usados para avaliar as características funcionais dos CBSC. Aqui, fornecemos um protocolo experimental detalhado para o isolamento de BCSCs humanos de populações heterogêneas de células de câncer de mama, bem como tecido tumoral primário obtido de pacientes com câncer de mama. Além disso, destacamos ensaios funcionais in vitro e in vivo a jusante, incluindo ensaios de formação de colônias, ensaios de mamosfera, modelos de cultura 3D e ensaios de xenoenxerto tumoral que podem ser usados para avaliar a função do CBSC.
Introdução
Compreender os mecanismos celulares e moleculares das células-tronco do câncer de mama humano (CBSCs) é crucial para enfrentar os desafios encontrados no tratamento do câncer de mama. O surgimento do conceito de CBSC remonta ao início doséculo 21, onde uma pequena população de células CD44+CD24-/baixo câncer de mama foi capaz de gerar tumores heterogêneos em camundongos 1,2. Posteriormente, observou-se que as células de câncer de mama humano com alta atividade enzimática da aldeído desidrogenase (ALDHalta) também apresentaram propriedades semelhantes às células-tronc....
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Protocolo
A coleta de amostras cirúrgicas ou de biópsia derivadas de pacientes diretamente de pacientes com câncer de mama consentidas foi realizada sob protocolo de ética humana aprovado pelo conselho de ética institucional. Todos os camundongos usados para gerar modelos de xenoenxerto derivados do paciente foram mantidos e alojados em uma instalação animal aprovada pela instituição. O tecido tumoral de modelos de xenoenxerto derivados de pacientes usando camundongos foi gerado de acordo com o protocolo de ética aprovado pelo comitê institucional de cuidados com animais.
1. Preparação de linhagens celulares
- Realizar todos os procedimentos ....
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Resultados
O protocolo descrito permite o isolamento de BCSCs humanos de uma população heterogênea de células de câncer de mama, seja de linhagens celulares ou de tecido tumoral dissociado. Para qualquer linhagem celular ou amostra de tecido, é crucial gerar uma suspensão celular única uniforme para isolar BCSCs na pureza máxima, pois a contaminação de populações não-BCSC pode resultar em respostas celulares variáveis, especialmente se o objetivo do estudo for avaliar a eficácia de agentes terapêuticos direcionados aos BCSCs. A apl.......
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Discussão
A metástase do câncer de mama e a resistência à terapia tornaram-se a principal causa de mortalidade em mulheres em todo o mundo. A existência de uma subpopulação de células-tronco do câncer de mama (CBSCs) contribui para o aumento da metástase 26,43,44,45,46 e da resistência à terapia 21,47,48.
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos aos membros do nosso laboratório por suas discussões úteis e apoio. Nossa pesquisa sobre células-tronco de câncer de mama e o microambiente tumoral é financiada por doações do Instituto de Pesquisa da Sociedade Canadense de Pesquisa do Câncer e do Programa de Câncer de Mama do Departamento de Defesa do Exército dos EUA (Grant # BC160912). V.B. é apoiado por uma Western Postdoctoral Fellowship (Western University), e tanto a A.L.A. quanto a V.B. são apoiadas pela Breast Cancer Society of Canada. C.L. é apoiado por uma Bolsa de Pós-Graduação Vanier Canada do Governo do Canadá.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 7-Aminoactinomicina D (7AAD) | BD | 51-68981E | sugerido: 0,25 µ g/1x106 células |
| de aldeído desidrogenase (ALDH) | Fisher | Stemcell Technologies 1700 Vendido comercialmente como parte do kit de ensaio ALDEFLOUR; siga as instruções do fabricante para a preparação do substrato ALDH Extrato de | |
| membrana de porão (BME) | Corning | 354234 | Vendido sob o nome comercial Matrigel |
| Placas de cultura de células: 6 poços | Corning | 877218 | |
| Placas de cultura de células: 60mm | Corning | 353002 | |
| Placas de cultura de células: 96 poços de fixação ultrabaixa | Corning | 3474 | |
| Filtro de células: 40 mícrons | BD | 352340 | |
| Collagen | Stemcell Technologies | 7001 | Preparar diluição de 1:30 de 3 mg/mL de colágeno em PBS |
| Collagenase | Sigma | 11088807001 | 1x |
| Tubos cônicos: 50 mL | Fisher scientific | 05-539-7 | |
| Cristal violeta | Sigma | C6158 | Use solução de cristal violeta a 0,05% em água para coloração |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7913 | 5U/mL |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | 1x, Com L-glutamina e 15 mM HEPES |
| DNAse | Sigma | D5052 | 0.1 mg/mL concentração final |
| FBS | Avantor Seradigm Lifescience | 97068-085 | < / tubos > fluxo forte |
| : 5ml | BD | 352063 | tubos de fundo redondo de polipropileno |
| Metanol | Fisher | 84124 | |
| anticorpo anti-CD24 humano | BD | 561646 | R-ficoeritrina e corante de cianina conjugado Clone: ML5 |
| anticorpo anti-CD44 humano | BD | 555479 | R-ficoeritrina conjugado, Clone: G44-26 |
| N, N-dietilaminobenzaldeído (DEAB) | Stemcell Technologies | 1700 | Vendido comercialmente como parte do kit de ensaio ALDEFLOUR; siga as instruções do fabricante Preparação DEAB |
| PBS | Wisent Inc | 311-425-CL | 1x, Sem cálcio e magnésio |
| Tripsina-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Mammosphere Media Composição | |||
| B27 | Gibco | 17504-44 | 1x |
| bFGF | Sigma | F2006 | 10 ng/mL |
| BSA | Bioshop | ALB003 | 04% |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | 1x, Com L-glutamina e 15 mM HEPES |
| EGF | Sigma | E9644 | 20 ng/mL |
| Insulina | Sigma | 16634 | 5 µ g/mL |
| 3D Composição de Mídia Organoide | |||
| A8301 | Tocris | 2939 | 500 nM |
| B27 | Gibco | 17504-44 | 1x |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | 1x, Com L-glutamina e 15 mM HEPES |
| EGF | Sigma | E9644 | 5 ng/mL |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 | 1x |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 10 mM |
| N-acetilcisteína | Sigma | A9165 | 1,25 mM |
| Neuregulina β 1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| Nicotinamida | Sigma | N0636 | 5 mM |
| Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
| R-spondin3 | R& D | 3500 | 250 ng/mL |
| SB202190 | Sigma | S7067 | 500 nM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µ O |
Referências
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Shipitsin, M., et al.
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Reimpressões e permissões
