Determinação rápida da afinidade anticorpo-antígeno por fotometria em massa

Resumo

Descrevemos uma abordagem de molécula única para medições de afinidade antígeno-anticorpos usando fotometria em massa (MP). O protocolo baseado em MP é rápido, preciso, usa uma quantidade muito pequena de material, e não requer modificação de proteína.

Resumo

As medidas da especificidade e afinidade das interações antígeno-anticorpos são criticamente importantes para aplicações médicas e de pesquisa. Neste protocolo, descrevemos a implementação de uma nova técnica de molécula única, fotometria em massa (MP), para este fim. MP é uma técnica livre de rótulos e imobilização que detecta e quantifica massas moleculares e populações de anticorpos e complexos de anticorpos de antígeno em um nível de molécula única. Mp analisa a amostra de anticorpos de antígeno em poucos minutos, permitindo a determinação precisa da afinidade vinculante e simultaneamente fornecendo informações sobre a estequiometria e o estado oligomérico das proteínas. Trata-se de uma técnica simples e simples que requer apenas quantidades de picomole de proteína e sem consumíveis caros. O mesmo procedimento pode ser usado para estudar a ligação proteína-proteína para proteínas com uma massa molecular maior que 50 kDa. Para interações proteicas multivalentes, as afinidades de múltiplos locais de ligação podem ser obtidas em uma única medição. No entanto, o modo de medição de molécula única e a falta de rotulagem impõem algumas limitações experimentais. Este método dá os melhores resultados quando aplicado às medições de afinidades de interação submicílar, antígenos com uma massa molecular de 20 kDa ou maiores, e amostras relativamente puras de proteína. Descrevemos também o procedimento para a realização das etapas necessárias de montagem e cálculo usando o software básico de análise de dados.

Introdução

Os anticorpos tornaram-se ferramentas onipresentes da biologia molecular e são usados extensivamente em aplicações médicas e de pesquisa. Na medicina, eles são criticamente importantes em diagnósticos, mas suas aplicações terapêuticas também estão se expandindo e novas terapias baseadas em anticorpos estão sendo constantemente desenvolvidas^1,2,3,4. As aplicações científicas dos anticorpos incluem muitas técnicas laboratoriais indispensáveis, como a imunofluorescência^5,a imunoprecipitação^6,a cit....

Protocolo

1. Prepare as câmaras de fluxo

1. Limpe as tampas de vidro
   1. Utilizando garrafas de lavagem com água destilada, etanol e isopropanol, enxágue as tampas de 24 mm x 50 mm na seguinte ordem: água, etanol, água, isopropanol, água. Seque as tampas com um fluxo de nitrogênio limpo. É importante enxaguar as tampas de cima para baixo, segurando o canto inferior com fórceps de ponta macia. Seque a tampa na mesma direção para evitar a transferência de contaminação das fórceps(Figura 2A).
   2. Da mesma forma, enxágue as tampas de 24 mm x 24 mm com água destilada, etanol e água destilada. Seque as tampas com um fluxo de nitrogênio ....

Resultados

Examinamos anteriormente a interação do humano α-trombina (HT) e do anticorpo anti-trombina monoclonal (AHT) usando o ensaio baseado em MP¹¹. Uma vez que a massa molecular do HT (37 kDa) está abaixo do limite de detecção de 40 kDa, a concentração máxima da amostra pode exceder a limitação de concentração de 50 nM MP sem afetar negativamente a resolução das distribuições de massa. O experimento foi planejado como uma série de titulação com o anticorpo AHT em uma concentração fixa de 25 nM, e o HT e.......

Discussão

O protocolo baseado em Fotometria em Massa descrito aqui fornece um método rápido e preciso de medir afinidades de ligação de anticorpos de antígeno. A análise de MP usa uma quantidade muito pequena de material e informações adicionais — incluindo estequiometria, oligomerização e pureza — podem ser avaliadas a partir dos mesmos dados(Figura 5). Sem modificações, este método é aplicável às medições de constantes de dissociação na faixa de aproximadamente 5 nM a 500 nM, e para moléculas de lig.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
AcquireMP	Refeyn		Software de coleta de dados MP
Anti-trombina humana	Haematologic Technologies	AHT-5020	RRID: AB_2864302
Aplicadores com ponta de algodão	Cotonetes ópticos de algodão	Thorlabs	CTA10
de lentes Lamínulas 24x24 mm	Globe Scientific	1405-10
Lamínulas 24x50 mm	Fisher Scientific	12-544-EP
DiscoverMP	Refeyn		Software de processamento de dados MP
Fórceps	Microscopia Eletrônica Sciences	78080-CF	fórceps de ponta macia para manuseio de lamínulas
Tecnologias hematológicas humanas		HCT-0020
Óleo de imersão	Thorlabs	MOIL-30
Isopropanol	Alfa Aesar	36644
Microsoft Excel	Planilha Microsoft
OneMP	Refeyn		Instrumento de fotometria de massa
Origin	OriginLab		software gráfico científico
PBS	Corning	46-013-CM	10x estoque
Filtro de seringa	Millipore	SLGSR33SS	tampão e amostra filtragem

para limpeza