Perfil celular de alto rendimento de compostos de degradação de proteínas direcionadas usando linhas celulares CRISPR HiBiT

A degradação proteica direcionada emergiu como uma das áreas de crescimento mais rápido na descoberta de medicamentos de pequenas moléculas, reforçada grandemente pelo sucesso terapêutico de compostos de cola molecular imunomoduladores (por exemplo, IMiD) para o tratamento do câncer e promissores dados de ensaios clínicos iniciais de compostos de quimera de proteólise direcionada a quimera 1,2,3,4,5,6,7,8^{, 9,10,11,12}. Os compostos de degradação proteica direcionada funcionam aproximando-se uma proteína-alvo com proteínas de máquinas de ligase E3 ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12} . Este recrutamento induzido por composto da proteína-alvo para a ligase E3 leva à ubiquitinação e degradação da proteína-alvo através da via proteassómica da ubiquitina (UPP)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Historicamente, os programas de triagem de descoberta de medicamentos de pequenas moléculas têm contado com ensaios bioquímicos iniciais para avaliar a atividade e classificar os compostos de ordem. Isso, no entanto, tem apresentado um desafio significativo para os degradadores de proteínas alvo cuja atividade final, a degradação através do proteassoma, depende de uma cascata de eventos celulares 1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17^{, 18}. As múltiplas vias e a complexidade dos complexos proteicos necessários para o sucesso da degradação do alvo requerem abordagens de ensaio celular para triagem precoce e triagem de compostos iniciais. Atualmente, a disponibilidade de tecnologias para monitorar a degradação de proteínas-alvo de forma de alto rendimento no contexto do ambiente celular é severamente deficiente¹⁴. Aqui apresentaremos protocolos para avaliação da atividade de degradação lítica cinética de células vivas cinéticas ou endpoint em tempo real usando linhagens celulares alvo de HiBiT endogenamente marcadas CRISPR/Cas9 18,19,20 para monitorar a perda da proteína-alvo via medição luminescente após tratamento com compostos degradantes^10,11,18,19.

Para alcançar a degradação bem-sucedida de alvos terapêuticos e expandir o proteoma medicamentoso, surgiram inúmeras abordagens e tipos de degradadores que podem atingir uma ampla gama de proteínas para destruição, incluindo aquelas localizadas na membrana plasmática ou na membrana plasmática, lisossomos, membranas mitocondriais, citoplasma e núcleo^21–57. As duas classes primárias de compostos mais amplamente estudadas são colas moleculares e proteínas direcionadas a cimeras ^{2,4,5,6,7,12,26}. As colas moleculares são monovalentes, portanto, tipicamente menores em tamanho, e facilitam uma nova interface de interação proteína:proteína com uma proteína-alvo ao se ligar a um componente da ligase E3 ^2,12,26. Eles são mais comumente degradadores que se ligam ao componente 2,12,26,55,56,56,56,57 ^da ligase Cereblon (CRBN). Recentemente, novos exemplos empolgantes utilizando outras máquinas de ligase E3, como DCAF15 ^58,59,60 e CDK / Cyclin recrutamento para DDB1⁴⁵ mostram o potencial de expansão desta classe de compostos. Em contraste, os PROTACs são moléculas maiores e bivalentes, consistindo de um ligante de ligação alvo, na maioria das vezes um inibidor, ligado através de um ligador químico a um cabo de ligase E3 1,3,4,5,7,13. Como tal, esses compostos são capazes de se ligar diretamente tanto à ligase E3 quanto à proteína-alvo 1,3,4,5,7,13. Numerosas proteínas têm se mostrado degradadas por meio dessas moléculas bivalentes, e os manipuladores de ligase E3 mais utilizados recrutam CRBN ou Von Hippel Lindau (BVS)1,3,4,5,7,13. No entanto, o número de alças disponíveis para o recrutamento de ligase E3 em quimeras visando o projeto de proteólise está crescendo rapidamente, expandindo as capacidades dessa classe de compostos com o potencial de degradar diversas classes-alvo^, bem como melhorar a especificidade do tipo celular ou tecidual 24,48,61,62 . Combinado com o requisito mínimo de envolver uma proteína-alvo, mesmo com afinidade marginal, os compostos de degradação são promissores para expandir o proteoma medicamentoso.

Caracterizar a dinâmica celular da perda de proteínas, bem como a potencial recuperação de proteínas pós-tratamento, é fundamental para a compreensão da função e eficácia do composto de degradação. Embora seja possível estudar as mudanças endógenas do nível de proteína em sistemas celulares relevantes com ensaios de anticorpos western blot ou espectrometria de massa, essas abordagens são difíceis de adaptar a formatos de triagem de alto rendimento, têm capacidade limitada de quantificação ou capacidade de medir mudanças cinéticas em muitos pontos de tempo¹⁴. Para enfrentar esses desafios, desenvolvemos um sistema luminescente celular baseado em placas para monitorar mudanças nos níveis endógenos de proteína, que utiliza a inserção genômica via CRISPR/Cas9 da tag de 11 aminoácidos, HiBiT, aos loci de quaisquer alvos chave de degradação^18,19,20. Este peptídeo complementa com alta afinidade ao seu parceiro de ligação, LgBiT, para produzir luminescência brilhante na presença de seu substrato 18,19,20,63, tornando essas proteínas endógenas marcadas luminescentes em células ou lisados 18,19,20,63 . As unidades de luz relativa (RLUs) medidas com um instrumento de luminômetro são diretamente proporcionais aos níveis de proteína-alvo marcados 18,19,20,63. Com o desenvolvimento de substratos de luciferase estabilizados, medidas do nível cinético de proteína em tempo real ao longo de períodos de 24-48 h são possíveis 18,53,64. Isso permite a determinação de um perfil de degradação completo para qualquer alvo em qualquer concentração de composto, incluindo análise quantitativa da taxa de degradação inicial, do máximo de degradação (Dmax) e da recuperação após o tratamento do composto^18,53. Se a triagem de grandes bibliotecas de compostos de degradação, no entanto, a análise de desfecho também pode ser prontamente realizada no formato de 384 poços em várias concentrações de drogas e horários designados.

Os protocolos apresentados neste manuscrito representam estratégias de triagem celular para compostos de degradação proteica direcionados, aplicáveis a todos os tipos de degradadores. O uso de linhagens celulares HiBiT CRISPR juntamente com esses protocolos, no entanto, não se limita à degradação proteica, mas são ferramentas gerais para o monitoramento de qualquer nível endógeno de proteína-alvo que poderia ser modulado pós-tratamento para estudar o impacto de compostos ou mesmo mecanismos de resistência 20,65,66. Um pré-requisito para esses métodos de detecção baseados em luminescentes é uma linhagem celular alvo HiBiT endogenamente marcada CRISPR, o que é crítico, pois permite a detecção luminescente sensível, mantendo a expressão endógena do alvo e a regulação do promotor nativo^18,19,20. Avanços significativos têm sido realizados na utilização de CRISRP/Cas9 para inserção de tags genômicas, particularmente na escalabilidade 20 e com alta sensibilidade de detecção, em diversos formatos, incluindo pools CRISPR ou clones com inserções alélicas heterozigotas ou homozigotas^18,19,20. O uso de expressão exógena de HiBiT ou outras fusões de repórteres em células em vez de marcação endógena é possível, mas deve-se ter cautela significativa usando sistemas com superexpressão proteica^14,18. Estes podem levar a artefatos na compreensão da verdadeira potência do composto e da dinâmica de recuperação de proteínas^14,18, incluindo potenciais loops de feedback transcricional ativados após a degradação do alvo. Além disso, compostos em estágio inicial com baixa potência podem ser perdidos e se apresentam como falsos negativos na triagem. Como a perda de proteína pode resultar da toxicidade induzida por compostos e da morte celular, os protocolos descritos aqui contêm ensaios luminescentes ou fluorescentes de viabilidade celular altamente recomendados, mas opcionais, emparelhados com o protocolo de degradação. Existem duas seções principais para o protocolo, o ponto de extremidade lítico e a triagem cinética de células vivas. Dentro de cada uma dessas seções, são incluídas opções para medições de viabilidade celular multiplexada em formatos de ponto final ou cinéticos. O monitoramento das mudanças da proteína endógena marcada requer complementação com LgBiT nas células. Portanto, a seção de triagem cinética referencia protocolos importantes para a introdução deste, que pode ser alcançado via expressão transitória ou estável e é essencial para a realização das medições luminescentes de células vivas. Todas as abordagens aqui apresentadas permitem a rápida ordenação de classificação e avaliação da atividade dos compostos, permitindo esforços de triagem de compostos em estágio inicial e identificação mais rápida de degradadores de chumbo.

Este protocolo é projetado para o estudo de compostos de degradação em conjunto com uma linhagem celular CRISPR HiBiT. Protocolos para geração de inserções de CRISPR HiBiT para inúmeros alvos têm sido delineados em diversas publicações recentes^18,19,20.

1. Estudos de degradação do desfecho com proteínas-alvo CRISPR HiBiT em formato lítico com análise opcional de fluorescência de viabilidade celular

1. Preparação e chapeamento de linhagens celulares aderentes ou em suspensão de mamíferos
   1. Ajustar a densidade celular para 2,22 x 10⁵/mL por diluição em meio celular apropriado usado para passagem e crescimento celular.
   2. Dispensar células em placas com um mínimo de 3 poços por condição experimental e de controle. Dispensar 90 μL (20.000 células) por poço de suspensão celular em placas brancas de 96 poços. Para o formato de 384 poços, dispense 36 μL (8.000 células) por poço de suspensão celular em placas brancas de 384 poços.
2. Preparação e adição de compostos
   1. Preparar placas de ensaio PROTAC ou degradador diluídas em série a uma concentração final de 1.000x em DMSO a 100%. Em seguida, dilua-o até a concentração final de 10x no meio de cultura celular. Adicione um volume igual de DMSO ao meio, para ser usado como um controle DMSO sem composto.
   2. Para o formato de 96 poços, adicione 10 μL de 10x composto e soluções de controle a 90 μL de células. Para o formato de 384 poços, adicione 4 μL de 10x composto e soluções de controle a 36 μL de células.
   3. Incubar as placas em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ pelo tempo desejado ou em condições ideais para o seu crescimento.
      NOTA: Como este é um ensaio de ponto de extremidade, o teste de vários pontos de tempo exigirá a preparação de placas de degradação separadas para cada ponto de tempo, conforme descrito na etapa 1.1.2 acima. Os tempos de incubação para detectar a degradação mediada por compostos são altamente variáveis e também são provavelmente dependentes da concentração do composto. Os horários iniciais sugeridos seriam 6 h e 24 h.
   4. Se a medição da deteção luminescente do ponto de extremidade sem a medição opcional da viabilidade celular, avance diretamente para o passo 1.3 abaixo. Se estiver a realizar a multiplexação com medição da viabilidade celular, avance para a secção 1.4 seguinte abaixo.
3. Medição lítica de células
   1. Imediatamente antes das medições líticas de HiBiT, prepare 2x reagente de detecção lítica adicionando 20 μL de substrato lítico e 10 μL de proteína LgBiT por cada 1 mL do tampão lítico. Prepare um reagente de detecção 2x suficiente para o número de poços a serem ensaiados, incluindo volume extra para explicar o erro de pipetagem (ou seja, número de poços + 10%).
   2. Adicione o reagente de detecção lítica preparado às células. Para o formato de 96 poços, adicione 100 μL de 2x reagente de detecção lítica a cada poço contendo 100 μL de células. Para o formato de 384 poços, adicione 40 μL de 2x reagente de detecção lítica a cada poço contendo 40 μL de células. Misture a placa em um misturador de vórtice de microplaca por 10-20 min a 350 rpm.
   3. Meça a luminescência em um luminômetro capaz de ler a luminescência em uma placa de 96 ou 384 poços.
4. Multiplexação opcional de viabilidade celular
   NOTA: Esta etapa é executada usando um kit CellTiter-Fluor (CTF) disponível comercialmente (consulte Tabela de Materiais).
   1. 30-40 min antes da medição do desfecho desejado, prepare uma solução de reagente de detecção de viabilidade celular 6x adicionando 10 μL do substrato a 2 mL do tampão de ensaio. Prepare 6x reagente suficiente para cada poço a ser ensaiado, incluindo volume extra para erro de pipetagem (ou seja, número de poços + 10%).
   2. Adicione o reagente preparado aos poços. Para o formato de 96 poços, adicione 20 μL de reagente 6x a cada poço que já contenha um volume de 100 μL. Para o formato de 384 poços, adicione 8 μL de reagente 6x a cada poço contendo 40 μL de células. Misture brevemente em um misturador de vórtice de microplacas e, em seguida, incube a placa por 30 min em uma incubadora de 37 °C.
   3. No ponto final desejado de medição (ou seja, 6 ou 24 horas após o tratamento, etapa 1.2.3), meça a fluorescência em um instrumento capaz de ler a fluorescência (380-400nm_Ex/505nm_Em) no formato de 96 ou 384 poços.
   4. Preparar 2x reagente de detecção lítica adicionando 20 μL de substrato lítico e 10 μL de proteína LgBiT por 1 mL de tampão lítico. Prepare um reagente de detecção 2x suficiente para o número de poços a serem ensaiados, incluindo volume extra para explicar o erro de pipetagem (por exemplo, número de poços + 10%).
   5. Adicione o reagente de detecção lítica preparado aos poços. Para o formato de 96 poços, adicione 120 μL de 2x de reagente de detecção lítica a cada poço que já contenha um volume de 120 μL. Para o formato de 384 poços, adicione 48 μL de 2x de reagente de detecção lítica a cada poço que já contenha um volume de 48 μL. Misture a placa em um misturador de vórtice de microplaca por 10-20 min.
   6. Meça a luminescência em um luminômetro capaz de ler a luminescência em placas de 96 ou 384 poços.
5. Quantificação da degradação e viabilidade celular
   1. Média das unidades de luz relativa (RLU) do controle DMSO no ponto de tempo medido. Use esse valor como o nível de proteína basal do alvo para calcular a degradação fracionada normalizando todos os outros tratamentos testados nesse mesmo momento e apontar para esse valor. Por exemplo, se a RLU média para os poços de controle DMSO em 6 h fosse de 10.000, e a RLU para um determinado tratamento composto em 6 h fosse de 5.000, a degradação fracionada seria calculada como 5.000 ÷ 10.000 = 0,5 (Equação 1).
      Equação 1:
   2. Determine a porcentagem de degradação da RLU Fracionária:
      Equação 2:
   3. Plotar RLU fracionada ou % de degradação em pontos de tempo específicos para classificar a atividade dos compostos.
   4. Opcionalmente, analise os dados da unidade relativa de fluoressecência (RFU) para a medição do ensaio de viabilidade celular, comparando os valores de todos os tratamentos com o controle DMSO. Se um declínio significativo na RFU for observado para qualquer tratamento em relação ao controle DMSO, os dados de degradação podem ser adicionalmente normalizados para os dados do ensaio de viabilidade celular para determinar mudanças no nível de proteína em relação às perdas na viabilidade celular.

2. Degradação cinética em tempo real das proteínas-alvo CRISPR HiBiT e ensaio opcional de luminescência de viabilidade celular

NOTA: A capacidade de realizar triagem cinética e degradação requer a co-expressão da proteína LgBiT na célula, o que já foi descrito anteriormente^18,19,63. Isso pode ser alcançado através da transfecção transitória de um vetor LgBiT, uso de BacMam LgBiT, ou realizando a inserção de CRISPR HiBiT em uma linhagem celular estável LgBiT.

1. Banhamento de linhagens celulares aderentes.
   1. Remover o meio do balão celular por aspiração, lavar as células com DPBS, dissociar as células com tripsina-EDTA a 0,05% e permitir que as células se dissociem do fundo do frasco. Para as linhas de células de suspensão, passar ao ponto 2.2.
   2. Neutralize a tripsina usando meio de cultura celular contendo soro, misture para coletar e ressuspender as células e transfira a suspensão celular para um tubo cônico.
   3. Gire as células a 125 x g por 5 min. Rejeitar o meio de cultura celular e ressuspender num volume igual de meio de cultura de células frescas.
   4. Células de placa em placas de ensaio com um mínimo de poços triplicados por condição experimental e de controle. Para a contagem do formato de 96 poços para estimar a densidade celular, ajuste a densidade para 2 x 10⁵ células/mL em meio de ensaio e dispense 100 μL (20.000 células) por poço em uma placa de 96 poços. Para a contagem do formato de 384 poços para estimar a densidade celular, ajuste a densidade para 4,44 x 10⁵ células/mL no meio de ensaio e dispense 18 μL (8.000 células) por poço.
   5. Incubar as placas a 37 °C, 5% de CO₂ durante a noite ou em condições ideais para o seu crescimento.
2. Chapeamento de células de suspensão
   1. Ajustar a densidade celular para 2,22 x 10⁵ células/mL em meio independente de CO₂ suplementado com 10% FBS e 1x Endurazina (diluição 1:100 do reagente de estoque).
   2. Células de placa em placas de ensaio com um mínimo de 3 poços por condição experimental e de controle. Para o formato de 96 poços dispense 90 μL (20.000 células) por poço. Para o formato de 384 poços, dispense 36 μL (8.000 células) por poço.
      NOTA: Para linhas de células de suspensão que têm baixa luminescência de sinal para fundo (S:B), por exemplo, ao trabalhar com pools CRISPR em vez de clones, é possível aumentar a luminescência aumentando o número de células chapeadas, até 100.000 células/poço no formato de 96 poços ou 40.000 células/poço no formato de 384 poços.
3. Ensaios de degradação cinética usando células CRISPR HiBiT expressando LgBiT
   1. Para as células de suspensão que já contenham Endurazina, que foi incluída na fase de chapeamento do ponto 2.2., passar directamente para a fase 2.3.3. Para linhagens celulares aderentes preparar solução de Nano-Glo Endurazine. Para o formato de 96 poços, prepare uma solução 1x de Endurazina diluindo o reagente de estoque 1:100 em meio independente de CO₂ suplementado com 10% de FBS. Para o formato de 384 poços, prepare uma solução 2x de Endurazina diluindo o reagente de estoque 1:50 em meio independente de CO₂ suplementado com 10% de FBS.
   2. Adicione a solução de endurazina a cada poço de células aderentes. Para o formato de 96 poços, aspirar o meio e adicionar 90 μL de 1x solução de Endurazina. Para o formato de 384 poços, adicione 18 μL de solução de endurazina 2x a 18 μL de células. Não aspirar o meio, pois o ensaio de degradação é realizado em uma mistura 50:50 de meio de cultura e meio independente de CO₂ em formato de 384 poços.
   3. Incubar a suspensão ou as placas celulares aderentes contendo Endurazina durante 2,5 h numa incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ para permitir o equilíbrio da luminescência.
   4. Preparar uma concentração de 10x de titulação PROTAC de ensaio em meio independente de CO₂ e adicionar 10 μL a cada poço de placa de 96 poços ou 4 μL para placa de 384 poços. Para compostos com eficácia desconhecida, recomenda-se uma concentração final de 1-10 μM no ponto mais alto como ponto de partida.
   5. Coletar medições cinéticas de luminescência em luminômetro pré-equilibrado a 37 °C por um período entre 0-48 h. Os incrementos de tempo de medição podem ser personalizados para cada experimento, mas um experimento inicial recomendado seria medições de luminescência a cada 5-15 min por 24 horas ou a quantidade desejada de tempo.
4. Análise multiplex de mesmo poço de viabilidade celular opcional após medição cinética final
   NOTA: Este ensaio é realizado com um kit CellTiter-Glo (CTG) comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais).
   1. Equilibrar o reagente CTG à temperatura ambiente.
   2. Após a medição da degradação no último ponto de tempo da análise cinética, adicionar 100 μL (placa de 96 poços) ou 40 μL (placa de 384 poços) do reagente por poço da placa e misturar em um agitador de placas a 500-700 rpm (placa de 96 poços) ou um misturador de vórtice de microplacas (placa de 384 poços) por 5 min.
   3. Incubar a placa à temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir a lise celular e a têmpera do sinal HiBiT.
   4. Meça a luminescência total em um luminômetro seguindo a recomendação do fabricante.
5. Quantificação dos perfis de degradação cinética
   1. Usando as medições de luminescência cinética coletadas, normalize os RLUs brutos para cada concentração de PROTAC para a condição DMSO média replicada em cada ponto de tempo para explicar as mudanças na concentração de furimazina livre ao longo do tempo. Calcule a RLU Fracionada usando a Equação 1.
      Equação 1:
   2. A partir das curvas de degradação, ajuste um modelo de decaimento exponencial de componente único usando a Equação 2 à porção de degradação inicial de cada curva até o ponto em que os dados atinjam um platô.
      NOTA: Pode ser útil excluir do ajuste os primeiros pontos de dados, pois pode haver um breve atraso antes que a degradação seja observada.
      Equação 2:
   3. A partir da Equação 2, determine o parâmetro ƛ, que representa a constante da taxa de degradação e o Planalto, que representa a menor quantidade de proteína restante.
   4. Calcule Dmax, que é a quantidade fracionada máxima de proteína degradada e é calculada como 1-Plateau.
   5. Gráfico Dmax para cada concentração de PROTAC para determinar uma curva de potência de degradação independente do tempo.
   6. Determinar o valor de Dmax₅₀ para a parcela em 2.3.5 para analisar a eficácia dos compostos.
      NOTA: Para determinar um DC₅₀ em um ponto de tempo específico, plote a porcentagem de degradação calculada para cada concentração no momento escolhido. Isso pode ser especificado como DC 50 t=4 h ou DC₅₀ t=12 h.

Para demonstrar a análise de degradação lítica de um único ponto final, várias proteínas-alvo CDK; CDK2, CDK4, CDK7 e CDK10 foram endogenamente marcados com HiBiT em seu terminal C em células HEK293 e tratados com uma concentração de 1 μM do PROTAC à base de pan-quinase Cereblon, TL12-18654 (Figura 1A). O nível de proteína CDK foi medido em diferentes momentos e o RLU fracionado em relação ao controle do DMSO foi determinado (Figura 1A). Cada proteína CDK apresentou diferentes graus de degradação em resposta ao tratamento com composto e aos vários pontos de tempo (Figura 1A). Para entender como as proteínas CDK se compararam diretamente em termos de perda de proteínas, as RLUs fracionárias da Figura 1A foram calculadas como % total de degradação e plotadas para cada ponto de tempo na Figura 1B. Isso mostra que, mesmo nos primeiros momentos, 2 ou 4 h, alguns dos membros da família CDK apresentam altos níveis de degradação que continuam a tender para cima ao longo do tempo (Figura 1B).

Para demonstrar a análise de degradação cinética, cada uma das proteínas dos membros da família BET; BRD2, BRD3 e BRD4 foram endogenamente marcados com HiBiT em seu terminal N em células HEK293 expressando de forma estável a proteína LgBiT18. Estes foram então tratados com três concentrações diferentes dos PROTACs pan-BET; o dBET650 baseado em Cereblon (Figura 2A) e o ARV-77141 baseado em BVS (Figura 2B). As medidas cinéticas foram coletadas durante um período de 24 horas e, a partir dos perfis em cada concentração, as diferenças na resposta dos membros da família BET são prontamente aparentes. A capacidade do BRD2 de iniciar uma resposta de recuperação mais rápida pós-tratamento de compostos de degradação (Figura 2A,B) foi previamente observada com outros PROTACs pan-BET e é provavelmente devido a uma resposta de feedback transcricional competitiva ao processo de degradação18.

Tanto o desfecho quanto a análise cinética podem ser feitos com tratamentos completos de resposta à dose composta. Na Figura 3 são mostrados os perfis cinéticos de degradação da resposta à dose do tratamento de células Ikaros/IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat expressando de forma estável a proteína LgBiT com quatro compostos de cola molecular diferentes 2,26,55,57; lenalidomida (Figura 3A), iberdomida (CC-220) (Figura 3B), talidomida (Figura 3C) e pomalidomida (Figura 3D). Esses degradadores apresentam diferenças significativas na resposta à degradação entre os compostos, bem como entre as séries de concentração (Figura 3).

Para avaliar quantitativamente a degradação e ordenar os compostos da Figura 3, os perfis de resposta à dose foram utilizados para calcular os principais parâmetros de degradação, incluindo os valores de taxa de degradação (Figura 4A), Dmax (Figura 4B) e Dmax50 (Figura 4B). Essas análises mostram que a iberdomida (CC-220) e a pomalidomida têm taxas de degradação inicial rápidas muito semelhantes (Figura 4A), mas a iberdomida (CC-220) tem a maior potência, como já foi visto anteriormente em estudos ortogonais55,57 (Figura 4B). Uma vez que a iberdomida apresenta uma potência tão elevada, e todas as concentrações testadas apresentam uma degradação superior a 50%, o valor de Dmax50 obtido para a iberdomida representa uma estimativa baseada na limitação no ajuste preciso dos dados. A partir dos gráficos da Figura 3C,D e da Figura 4B, nem a lenalidomida nem a talidomida degradam o alvo Ikaros/IKZF1 até à conclusão nas concentrações mais elevadas testadas. Devido à muito pouca degradação observada com a talidomida, os traços de degradação não puderam ser ajustados com precisão a um modelo de decaimento exponencial, portanto, a taxa de degradação não foi quantificada para este tratamento. Para o degradador mais potente, a iberdomida (CC-220)55,57 (Figura 4B). Os ensaios multiplex de viabilidade celular não mostraram perda na viabilidade celular para as concentrações testadas (Figura 4C).

Figura 1: Degradação e toxicidade do parâmetro CDK com pan-quinase PROTAC, TL12-18654. (A) Selecionar painel de proteínas-alvo CDK endógenas fundidas com HiBiT no terminal C via CRISPR/Cas9 e avaliadas quanto à degradação com 1 μM TL12-186 PROTAC 54 no tratamento de 2 h, 4 h, 8 h e24 h. Os valores são representados como RLU Fracionada em relação a um controle DMSO medido em cada ponto de tempo. As barras de erro representam DP da média de 3 replicações técnicas. (B) Porcentagem de degradação do painel de proteínas-alvo CDK calculada a partir de (A) representando a quantidade de degradação de cada membro da família observada nos momentos de 2, 4, 8 e 24 h. As barras de erro representam DP da média de 3 replicações técnicas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Perfil da seletividade da degradação cinética de membros da família BET com degradadores BET, dBET650 e ARV-77141. Perfis de degradação cinética de membros endógenos da família BET, BRD2, BRD3 e BRD4, marcados com HiBiT no terminal N via CRISPR/Cas9 com tratamento de concentrações únicas de 1 nM (esquerda), 10 nM (meio) ou 100 nM (direita) dBET650 (A) ou ARV-77141 (B) PROTACs. Os valores são representados como RLU Fracionada calculada a partir de um controle DMSO em cada ponto de tempo cinético. As barras de erro representam DP da média de 4 repetições técnicas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Perfis de resposta à dose de degradação cinética de células vivas de Ikaros/IKZF1-HiBiT com um painel de cola molecular 2,26,55,57. As células Jurkat expressando de forma estável a proteína LgBiT foram modificadas usando CRISPR/Cas9 para marcar o terminal C de Ikaros/IKZF1 com o peptídeo HiBiT. As células foram tratadas com uma série de concentrações de resposta à dose de 8 pontos, incluindo DMSO de quatro diferentes compostos moleculares de cola 2,26,55,57: (A) lenalidomida, (B) iberdomida (CC-220), (C) talidomida ou (D) pomalidomida. A luminescência foi medida a cada 5 min para um total de 19,5 h. Os dados da unidade de luz relativa (RLU) de (A-D) foram convertidos em RLU fracionária, conforme descrito na Etapa 2.4.1, e representados graficamente em função do tempo. As barras de erro representam SD de 3 replicações técnicas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Cálculo da taxa de degradação e Dmax50 para Ikaros/IKZF1-HiBiT, e ensaios de saúde celular multiplexadora. Os dados de degradação cinética da Figura 3 foram utilizados para calcular os parâmetros quantitativos de degradação. (A) As taxas de degradação e (B) os valores máximos de degradação (Dmax) são representados graficamente em cada concentração de fármaco para os compostos de cola molecular indicados 2,26,55,57. (B) Os valores de Dmax50 para cada composto foram calculados usando um modelo dose-resposta com inclinação de Hill restrita de 1, que pode ser usado para classificar compostos de degradação de ordem para um alvo. (C) Os ensaios de viabilidade celular com a resposta à dose de degradação da iberdomida (CC-220)55,57 da Figura 3B foram realizados como uma medição final após a conclusão das medições de degradação cinética. As barras de erro representam SD de 3 replicações técnicas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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