Artigo de método

Preparação de amostra de um pote assistida por transportador para análise proteômica direcionada de um pequeno número de células humanas

DOI:

10.3791/61797

⸱

6 de novembro de 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, 2NHC Key Laboratory of Cancer Proteomics, Department of Oncology, Xiangya Hospital, Central South University, 3Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 4Department of Critical Care Medicine, The First Affiliated Hospital of Nanchang University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uma preparação de amostra de um pote assistida por transportador de proteína, juntamente com cromatografia líquida (LC) - monitoramento de reação selecionada (SRM) denominado cLC-SRM, é um método conveniente para análise proteômica direcionada multiplexada de um pequeno número de células, incluindo células únicas. Ele capitaliza o uso excessivo de proteína exógena como transportador e LC-SRM de alta especificidade para quantificação direcionada.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A análise de proteínas de um pequeno número de células humanas é obtida principalmente por proteômica direcionada com imunoensaios baseados em anticorpos, que têm limitações inerentes (por exemplo, baixo multiplex e indisponibilidade de anticorpos para novas proteínas). A proteômica direcionada baseada em espectrometria de massa (MS) surgiu como uma alternativa porque é livre de anticorpos, altamente multiplex e tem alta especificidade e precisão de quantificação. Avanços recentes na instrumentação de MS tornam possível a proteômica direcionada baseada em MS para quantificação multiplexada de proteínas altamente abundantes em células únicas. No entanto, há um desafio técnico para o processamento eficaz de células únicas com perda mínima de amostra para análise de MS. Para resolver esse problema, desenvolvemos recentemente uma conveniente preparação de amostra de um pote assistida por transportador de proteína, juntamente com cromatografia líquida (LC) - monitoramento de reação selecionada (SRM) denominado cLC-SRM para análise proteômica direcionada de um pequeno número de células humanas. Este método capitaliza o uso da proteína exógena excessiva combinada como transportador e processamento de um pote de baixo volume para reduzir bastante as perdas de adsorção na superfície, bem como LC-SRM de alta especificidade para abordar efetivamente o aumento da faixa de concentração dinâmica devido à adição de proteína transportadora exógena. Sua utilidade foi demonstrada pela quantificação precisa das proteínas mais moderadamente abundantes em um pequeno número de células (por exemplo, 10-100 células) e proteínas altamente abundantes em células individuais. Os recursos fáceis de implementar e a não necessidade de dispositivos específicos tornam esse método prontamente acessível à maioria dos laboratórios de proteômica. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para análise cLC-SRM de um pequeno número de células humanas, incluindo classificação de células, lise e digestão celular, análise LC-SRM e análise de dados. São necessárias melhorias adicionais na sensibilidade de detecção e no rendimento da amostra para a análise proteômica de célula única direcionada. Prevemos que o cLC-SRM será amplamente aplicado à pesquisa biomédica e à biologia de sistemas com o potencial de facilitar a medicina de precisão.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Avanços tecnológicos recentes em genômica (transcriptômica) permitem uma análise abrangente e precisa do genoma (transcriptoma) em células individuais 1,2,3. No entanto, as tecnologias proteômicas de célula única estão muito atrasadas, mas são tão importantes quanto as tecnologias genômicas (transcriptômicas) 4,5,6,7,8. Além disso, a abundância de proteínas não pode necessariamente ser inferida da abundância de mRNA9, e o proteoma é mais complexo e dinâmico do que o transcriptoma10. Dados esses desafios, um grande número de populações mistas de células (ou seja, células em massa) são geralmente usadas para gerar dados abrangentes de proteoma11 , 12 , 13 . No entanto, essas medições em massa calculam as variações estocásticas de células individuais, obscurecendo assim a importante variabilidade célula a célula (ou seja, heterogeneidade celular) 4 , 14 . As limitações de tais medições em massa tornam-se ainda mais severas quando as células de interesse representam apenas uma pequena parte das populações totais de células (por exemplo, células-tronco cancerígenas dentro de tumores em estágio inicial). Portanto, há uma enorme lacuna de conhecimento entre a proteômica de célula única e a genômica (transcriptômica).

Os imunoensaios baseados em anticorpos (por exemplo, citometria de fluxo ou de massa) são predominantemente usados para análise proteômica direcionada de células únicas 6,7,15,16,17,18. No entanto, eles sofrem de baixo multiplex, especificidade limitada e indisponibilidade de anticorpos para novas proteínas de interesse. A proteômica direcionada baseada em espectrometria de massa (MS) surgiu como uma alternativa para quantificação precisa de proteínas por ser livre de anticorpos, alta multiplexidade (≥150 proteínas em uma única análise19), alta precisão de quantificação (quantidades ou concentrações absolutas) e alta especificidade e reprodutibilidade (≤10% CV) 20 , 21 , 22 , 23. O recente progresso significativo na preparação de amostras tornou possível a proteômica de célula única baseada em EM para análise quantitativa de proteínas altamente abundantes de células humanas individuais. No entanto, a proteômica de célula única baseada em EM ainda está no estágio inicial da infância. Por exemplo, a plataforma MS mais avançada, juntamente com taxas de fluxo RPLC de fluxo ultrabaixo, só pode permitir a detecção e quantificação de MS sem marcação de ~ 670-870 proteínas do total de ≥ 12.000 proteínas em células HeLa únicas24,25.

Atualmente, existem seis abordagens proteômicas de célula única baseadas em MS disponíveis para análise de células únicas de mamíferos, nas quais quatro são para proteômica global (nanoPOTS: preparação baseada em nanopoços em um pote para amostras vestigiais26; iPAD-1: dispositivo integrado de análise de proteoma para análise de célula única27; Análise proteômica de célula única baseada em chip OAD (óleo-ar-gotícula)28; SCoPE-MS: proteômica de célula única por espectrometria de massa29) e as outras duas são para proteômica direcionada (cLC-SRM: cromatografia líquida assistida por portador (LC) - monitoramento de reação selecionada (SRM) 30; cPRISM-SRM: separações de alta pressão e alta resolução assistidas por portador com seleção inteligente e multiplexação acoplada ao SRM31). No entanto, todas essas abordagens têm desvantagens técnicas. nanoPOTS, iPAD-1 e OAD reduzem o volume de processamento de amostras para 2-200 nL e não estão prontos para amplas aplicações de bancada 26,27,28. Para SCoPE-MS, um transportador TMT (tandem mass tag) é adicionado após o processamento de célula única, portanto, não pode prevenir efetivamente as perdas de adsorção de superfície durante o processamento da amostra quando um único tubo é usado para processamento de célula única29, resultando em baixa reprodutibilidade com um coeficiente de correlação de apenas ~ 0,2-0,4 entre as réplicas32. Para cLC-SRM e cPRISM-SRM, o uso de proteínas exógenas como carreadoras é mais adequado para proteômica direcionada porque peptídeos de proteínas exógenas excessivas são frequentemente sequenciados por MS / MS, o que reduz muito a chance de sequenciamento de peptídeos endógenos de baixa abundância30 , 31 . Ao contrário da proteômica global para quantificação relativa, as duas abordagens proteômicas direcionadas podem fornecer análise de proteínas precisa ou absoluta de um pequeno número de células com alta reprodutibilidade usando padrões internos marcados com isótopos pesados em concentrações conhecidas. Quando comparado ao cPRISM-SRM que requer fracionamento prévio de PRISM de alta resolução, resultando em muitas amostras fracionárias que precisam ser analisadas, o cLC-SRM tem uma vantagem significativa no rendimento da amostra sem fracionamento e pode quantificar simultaneamente centenas de proteínas em uma única análise, mas com sensibilidade de detecção relativamente menor30. Portanto, o cLC-SRM é mais acessível e deve ter utilidades mais amplas para análise precisa de proteínas multiplexadas de um pequeno número de células, bem como amostras limitadas em massa.

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para realizar cLC-SRM para análise proteômica direcionada conveniente de um pequeno número de células humanas, incluindo células únicas. O protocolo consiste nas seguintes etapas principais: classificação de células por FACS (classificação de células ativadas por fluorescência), lise celular e digestão processada em tubos de reação em cadeia da polimerase (PCR) simples de baixo volume, coleta de dados LC-SRM e análise de dados SRM usando o software Skyline disponível publicamente (Figura 1). Sua ampla utilidade foi demonstrada junto com nossos ensaios SRM previamente bem estabelecidos por quantificação direcionada absoluta de proteínas da via EGFR / MAPK em 1-100 células MCF7 ou MCF10A e determinação de cópias de proteínas da via por célula em uma ampla faixa dinâmica de concentrações30. Prevemos que, com o protocolo detalhado, a maioria dos pesquisadores de proteômica pode implementar prontamente o cLC-SRM em seus laboratórios para análise precisa de proteínas de amostras ultrapequenas (por exemplo, células tumorais raras) para atender às necessidades de seus projetos.

figure-introduction-1
Figura 1: Visão geral de todas as etapas do cLC-SRM (cpreparação de amostra de um pote assistida por c juntamente com l iquid chromatografia -sreação eleita monitoring). Digestores de lisado de células não humanas (por exemplo, Shewanella oneidensis) são usados para pré-tratar tubos de PCR para revestir a superfície do tubo. Um pequeno número de células humanas ou células individuais classificadas por FACS são coletados em tubos de PCR pré-tratados. O transportador da proteína BSA (ou proteoma do lisado de células não humanas), o padrão interno pesado (IS) e o TFE (ou DDM) são adicionados aos tubos de amostra sequencialmente para facilitar a lise celular e reduzir as perdas de adsorção na superfície. Conceitualmente, o DDM combinado e o portador de proteoma de lisado de células não humanas funcionarão bem para cLC-SRM. A lise celular é conduzida por sonicação e a desnaturação da proteína é obtida por aquecimento em alta temperatura. Os reagentes DTT e IAA são usados para redução e alquilação, respectivamente (esta etapa é opcional). A tripsina é adicionada para digestão com proporções muito mais altas de tripsina sobre a quantidade de proteína do que para a digestão padrão de tripsina. A tampa do tubo de amostra é removida e, em seguida, o tubo de PCR é inserido no frasco LC para análise direta de LC-SRM. Os dados SRM coletados são analisados usando o software Skyline disponível publicamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: A análise passo a passo do cLC-SRM é mostrada na Figura 1.

1. Pré-tratamento de tubos de PCR

  1. Adicione 100 μL de digestão de lisado de células não humanas (por exemplo, Shewanella oneidensis) a 0,2 μg/μL aos tubos de PCR. Incube em temperatura ambiente durante a noite para revestir a superfície do tubo de PCR.
  2. Remova os digeridos de lisado celular por pipetagem, enxágue os tubos de PCR com água de grau HPLC 3 vezes e, em seguida, seque os tubos de PCR em uma capela de exaustão.
  3. Armazene os tubos de PCR revestidos em um freezer a 4 ° C até uso posterior.

2. Classificação FACS

  1. Alinhe um classificador de células ativadas por fluorescência (FACS) (consulte a Tabela de Materiais) em uma placa de PCR de 96 poços usando esferas fluorescentes com corantes que podem ser excitados pela fonte de laser para fornecer sinais de referência confiáveis.
  2. Verifique se a máquina FACS está bem direcionada para classificar células na parte inferior das placas de PCR.
    1. Defina o ângulo do fluxo de classificação para o mínimo possível para maximizar a taxa de sucesso de que as células serão classificadas no fundo dos poços em vez de atingir os lados.
    2. Para apontar a máquina, use o fluxo de teste para 'classificar' gotículas de tampão PBS (por exemplo, 100 gotículas) no poço de uma placa vazia para garantir que as gotículas coletadas estejam no fundo. Se as gotículas não caírem na posição correta, recalibre o classificador de células e repita até que as gotículas no fluxo de classificação sejam coletadas corretamente.
  3. Coloque os tubos de PCR revestidos em um rack de tubos de PCR de 96 poços.
  4. Classifique o número desejado de células mamárias humanas (MCF7 ou MCF10A) em tubos de PCR pré-revestidos.
  5. Centrifugue imediatamente as células mamárias selecionadas a 100 x g por 10 min a 4 ° C para mantê-las no fundo do tubo para evitar perda potencial de células.
  6. Conservar as células triadas num congelador a -80 °C até uma análise posterior.

3. Adição de transportador de proteína, padrões internos pesados e TFE

  1. Adicione 4 μL de 25 mM NH4HCO3 em tubos de PCR contendo células coletadas.
  2. Adicione 1 μL de albumina de soro bovino (BSA) 10 ng/μL em 25 mM NH4HCO3 em tubos de amostra.
  3. Adicione 0,3 μL de padrões de peptídeos pesados brutos de 100 fmol/μL (total de 30 fmol) em tubos de amostra.
    NOTA: Alíquotas de padrões brutos de peptídeos pesados para proteínas da via EGFR / MAPK são feitas a uma concentração nominal de 100 fmol / μL em 25 mM NH4HCO3. Dispense o pequeno volume de padrões brutos de peptídeos pesados a 100 fmol/μL no meio da solução e certifique-se de que não haja sobras de líquido na ponta da pipeta.
  4. Adicione 9 μL de 100% TFE em tubos de amostra com a concentração final de ~ 60% TFE.
  5. Centrifugue a 1500 x g por 5 min e, em seguida, vore suavemente a 100 x g por 3 min.

4. Lise celular e desnaturação de proteínas

  1. Sonicar células mamárias classificadas por FACS em gelo por 1 min com intervalos de 1 min para um total de 5 ciclos na amplitude de 70% e 0,5 Hz.
  2. Incubar amostras a 90 °C durante 1 h para desnaturação de proteínas utilizando um termociclador PCR com a opção de tampa aquecida.
    NOTA: O TFE é um solvente volátil com um ponto de ebulição de 74 °C e, portanto, a opção de tampa aquecida é selecionada para evitar a secagem completa com perda substancial da amostra.
  3. Resfrie as amostras à temperatura ambiente com centrifugação a 1500 x g por 3 min.

5. Redução e alquilação (opcional)

  1. Adicione 0,6 μL de 50 mM DTT para uma concentração final de 2 mM.
    NOTA: A solução de TDT precisa ser preparada a cada vez. Pesar 77,5 mg de TDT e depois dissolver em 1 mL de 25 mM NH4HCO3 para fazer 500 mM de DTT. 10 μL de 500 mM DTT são então adicionados a 90 μL de 25 mM NH4HCO3 para fazer 50 mM DTT.
  2. Centrifugue a 1500 x g por 5 min e depois misture suavemente a 850 rpm por 3 min.
  3. Incubar a 56°C durante 1 h com agitação suave a 100 x g.
  4. Resfrie as amostras à temperatura ambiente e centrifugue a 1500 x g por 3 min.
  5. Adicione 0,5 μL de IAA 60 mM ao tubo RT-PCR com a concentração final de ~ 2 mM.
    NOTA: A solução IAA precisa ser preparada de cada vez. Pesar 74,3 mg de IAA e depois dissolver em 1 ml de 25 mM NH4HCO3 para perfazer 400 mM de IAA. 15 μL de IAA 400 mM são adicionados a 85 μL de NH4HCO3 de 25 mM para fazer 60 mM IAA.
  6. Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 30 min com agitação suave a 100 x g.
    NOTA: As etapas de redução e alquilação são opcionais quando não há peptídeos contendo cisteína selecionados para proteínas-alvo.

6. Digestão de tripsina

  1. Reduza o volume da amostra para ~4 μL usando um concentrador SpeedVac.
    NOTA: TFE é um solvente volátil com ponto de ebulição a 74 ° C. A alta porcentagem de TFE inibe a digestão da tripsina.
  2. Adicione 9 μL de 25 mM NH4HCO3 e 1-3 μL de tripsina 15 ng/μL para digestão com a concentração final de tripsina de 1-3 ng/μL.
    NOTA: Para 10 células mamárias humanas classificadas por FACS (~ 1 ng), a proporção da enzima tripsina sobre a proteína é ≥15: 1, 750 vezes maior do que na digestão padrão de tripsina (a proporção de 1:50).
  3. Misture suavemente a 100 x g por 3 min e incube durante a noite (~ 16 horas) a 37 ° C.
  4. Adicione 0,5 μL de ácido fórmico a 5% para interromper a reação enzimática.
  5. Centrifugar durante 1 h a 1500 x g.
  6. Armazene no freezer a -80 °C até uma análise adicional do LC-SRM ou no freezer a 4 °C para análise imediata.

7. Preparação para análise direta de LC-SRM

  1. Remova a tampa do tubo de PCR que foi usado para coleta (Etapa 2) e processamento (Etapa 6) das células mamárias classificadas por FACS.
  2. Insira o tubo de PCR no frasco LC.
  3. Feche o frasco LC para análise LC-SRM.
    NOTA: Para um pequeno número de células processadas em placa de PCR de 96 poços, a tampa da esteira será adicionada para selar a placa para análise direta de LC-SRM.

8. Análise LC-SRM

  1. Analise amostras usando UPLC acoplado a um espectrômetro de massa triplo quadrupolo.
  2. Conecte as colunas capilares C18 (75 μm de diâmetro interno × 20 cm para gradiente padrão e 100 μm de diâmetro interno × 10 cm para gradiente curto) a um emissor de eletrospray de sílica fundida de 20 μm de diâmetro interno quimicamente gravado por meio de uma união de metal inoxidável.
  3. Use um loop de amostra de 20 μL para carregar diretamente toda a amostra (~15 μL no total) na coluna LC para maximizar a sensibilidade de detecção.
  4. Use ácido fórmico a 0,1% em água e ácido fórmico a 0,1% em acetonitrila a 90% como fases móveis A e B para separação capilar de RPLC.
  5. Use o gradiente LC binário a taxas de fluxo de 300 nL / min para um gradiente padrão quando um grande número de proteínas-alvo (>10) for medido. Gradiente padrão: 5-20% B em 26 min, 20-25% B em 10 min, 25-40% B em 8 min, 40-95% B em 1 min e a 95% B por 7 min para um total de 52 min e a coluna analítica reequilibrada em 99,5% A por 8 min.
  6. Use o gradiente LC binário a taxas de fluxo de 400 nL / min para um gradiente curto quando um pequeno número de proteínas-alvo (≤10) for medido. Gradiente curto para separação rápida: 5-95% B em 5 min e a coluna analítica reequilibrada em 99,5% A por 5 min com um tempo total de execução de LC de 10 min.
  7. Opere o espectrômetro de massa QQQ com tensões de pulverização de íons de 2.400 ± 100 V, uma tensão de deslocamento capilar de 35 V, uma tensão de deslocamento do skimmer de -5 V e uma temperatura de entrada capilar de 220 ° C.
  8. Obtenha os outros parâmetros QQQ MS do ajuste e calibração automáticos sem otimização adicional.
  9. Aumente diferentes concentrações de padrões brutos de peptídeos pesados em 20-50 ng/μL de digestão de lisado de células não humanas antes da análise LC-SRM de amostras para determinar o tempo de retenção de LC (RT) do peptídeo para construir um método SRM programado e possíveis transições de interferência para quantificação precisa.
  10. Use o modo SRM programado RT para quantificação multiplexada com a janela de varredura de ≥6 min.
    NOTA: A janela de varredura será ajustada de acordo, dependendo do número de transições em uma determinada janela de tempo.
  11. Defina o tempo total do ciclo como 1 s e o tempo de permanência para cada transição é ajustado automaticamente dependendo do número de transições verificadas em diferentes janelas de tempo de retenção. Um tempo mínimo de permanência de 10 ms é necessário para cada transição de SRM. Todas as proteínas-alvo podem ser monitoradas simultaneamente em uma única análise LC-SRM

9. Análise de dados

  1. Importe arquivos de dados brutos para o software Skylinedisponível publicamente 33 para visualização de dados de cada peptídeo alvo para determinar sua detectabilidade.
  2. Use dois critérios para determinar a detecção e integração de pico de SRM: 1) mesmo tempo de retenção de LC; 2) aproximadamente as mesmas taxas de intensidade de pico SRM relativas em várias transições entre peptídeos endógenos (leves) e seus padrões internos de peptídeos marcados com isótopos correspondentes (pesados).
  3. Inspecione todos os dados do SRM manualmente para garantir a atribuição correta do pico do SRM e o limite do pico do SRM para uma quantificação confiável usando os dois critérios acima.
  4. Use a melhor transição com um sinal SRM alto, mas sem interferência de matriz para quantificação de proteínas, e use as outras transições como referência.
  5. Use várias réplicas para obter o desvio padrão (DP) e o coeficiente de variação (CV).
  6. Calcule a relação sinal-ruído (S/N) pela intensidade do ápice de pico sobre o ruído de fundo médio dentro de uma região de tempo de retenção de ±15 s para gradiente padrão e ±6 s para gradiente curto. O limite de detecção (LOD) e o limite de quantificação (LOQ) são definidos como os pontos de concentração mais baixos em que a relação S/R é de pelo menos 3 e 7, respectivamente.
  7. Aplique um critério adicional para determinar de forma conservadora os valores de LOQ além de S/N ≥7: a resposta do peptídeo substituto contra diferentes números de células deve estar dentro da faixa dinâmica linear.
  8. Use o software Excel para traçar todas as curvas de calibração. Carregue os dados RAW do QQQ MS no software Skyline disponível publicamente para exibir gráficos de cromatogramas de íons extraídos (XICs) de várias transições de proteínas-alvo monitoradas.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pequenas quantidades de lisados de células MCF7 (0,5-20 ng equivalente a 5-200 células) foram usadas pela primeira vez para avaliar o desempenho de cLC-SRM por quantificação direcionada de proteínas da via EGFR / MAPK porque são mais uniformes com menos variações quando comparadas a um pequeno número de células classificadas por FACS. Conforme mostrado na Figura 2A, os XICs mostram claramente a detecção de transições SRM para ATADDELSFK derivadas de GRB2 pres...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cLC-SRM é um método proteômico direcionado conveniente que permite a análise precisa de proteínas multiplexadas de um pequeno número de células, incluindo células únicas. Este método capitaliza a preparação de amostras de um pote assistida por transportador de proteínas, na qual todas as etapas, incluindo coleta de células, lise e digestão de células em várias etapas e transferência de digestão de peptídeos para coluna LC capilar para análise de MS, são realizadas em um pote (por exemplo...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelo NIH Grant R21CA223715 (TS) e UG3CA256967 (TS e HL). O trabalho experimental aqui descrito foi realizado no Laboratório de Ciências Moleculares Ambientais, Laboratório Nacional do Noroeste do Pacífico, uma instalação científica nacional patrocinada pelo Departamento de Energia dos Estados Unidos da América sob o Contrato DE-AC05-76RL0 1830.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Frasco de vidro LC de 2 mLMicrosolv 9502S-WCVVaso para segurar o tubo de PCR para injeção de autoamostra
BSASigma-AldrichP0834-10 e vezes; 1mLde proteína transportadora para reduzir significativamente as perdas de adsorção de superfície
Reagente DTTThermo ScientificA39255para redução
ácido fórmicoReagente Thermo Scientific28905para parar a reação enzimática
IAAThermo ScientificA39271Reagente para alquilação
Peptídeo padrões internos do peptídeoNew EnglandQuantificação direcionada de proteínas da via EGFR/MAPK
Tubo RT-PCR GeneMate BioexpressT-3035-10.2 mL para preparação de amostras de um pote 
Software SkylineUniversidade de WashingtonDisponível publicamente para análise de dados SRM
SonicatorHielscher Tecnologia de UltrassomUTR200Sonicação no gelo para lise celular
Concentrador Speed VacThermo ScientificRedução da porcentagem de TFE para digestão eficaz de tripsina
TFESigma-Aldrich18370-10× 1mL60% TFE para termociclador de lise celular
com tampa aquecida TermocicladorPeltier PTC-200Aquecimento para desnaturação de proteínas
Tripsina GoldPromegaV528AEnzima para digestão de proteínas 
Coluna Waters BEH C18Coluna WatersC18 para separação de peptídeos
do Tubo de PCR

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  2. Miyamoto, D. T., et al. RNA-Seq of single prostate CTCs implicates noncanonical Wnt signaling in antiandrogen resistance. Science. 349 (6254), 1351-1356 (2015).
  3. Wang, Y., Navin, N. E. Advances and applications of single-cell sequencing technologies. Molecular Cell. 58 (4), 598-609 (2015).
  4. Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
  5. Gavasso, S., Gullaksen, S. E., Skavland, J., Gjertsen, B. T. Single-cell proteomics: potential implications for cancer diagnostics. Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (5), 579-589 (2016).
  6. Wu, M., Singh, A. K. Single-cell protein analysis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (1), 83-88 (2012).
  7. Hughes, A. J., et al. Single-cell western blotting. Nature Methods. 11 (7), 749-755 (2014).
  8. Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
  9. Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance. Cell. 165 (3), 535-550 (2016).
  10. Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (6), 427-439 (2010).
  11. Mertins, P., et al. Proteogenomics connects somatic mutations to signalling in breast cancer. Nature. 534 (7605), 55-62 (2016).
  12. Zhang, H., et al. Integrated Proteogenomic Characterization of Human High-Grade Serous Ovarian Cancer. Cell. 166 (3), 755-765 (2016).
  13. Zhang, B., et al. Proteogenomic characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 513 (7518), 382-387 (2014).
  14. Gaudet, S., Miller-Jensen, K. Redefining Signaling Pathways with an Expanding Single-Cell Toolbox. Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).
  15. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  16. Di Palma, S., Bodenmiller, B. Unraveling cell populations in tumors by single-cell mass cytometry. Current Opinion in Biotechnology. 31, 122-129 (2015).
  17. Schulz, K. R., Danna, E. A., Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Single-cell phospho-protein analysis by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , Chapter 8 Unit 8 11-20 (2012).
  18. Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Current Opinion in Biotechnology. 24 (4), 745-751 (2013).
  19. Lee, J. Y., et al. Detection of Head and Neck Cancer Based on Longitudinal Changes in Serum Protein Abundance. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 29 (8), 1665-1672 (2020).
  20. Shi, T., et al. Advancing the sensitivity of selected reaction monitoring-based targeted quantitative proteomics. Proteomics. 12 (8), 1074-1092 (2012).
  21. Shi, T., et al. Advances in targeted proteomics and applications to biomedical research. Proteomics. 16 (15-16), 2160-2182 (2016).
  22. Lange, V., Picotti, P., Domon, B., Aebersold, R. Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial. Molecular Systems Biology. 4, 222(2008).
  23. Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions. Nature Methods. 9 (6), 555-566 (2012).
  24. Zhu, Y., et al. Proteomic Analysis of Single Mammalian Cells Enabled by Microfluidic Nanodroplet Sample Preparation and Ultrasensitive NanoLC-MS. Angewandte Chemie International Edition. 57 (38), 12370-12374 (2018).
  25. Cong, Y., et al. Improved Single-Cell Proteome Coverage Using Narrow-Bore Packed NanoLC Columns and Ultrasensitive Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (3), 2665-2671 (2020).
  26. Zhu, Y., et al. Nanodroplet processing platform for deep and quantitative proteome profiling of 10-100 mammalian cells. Nature Communications. 9 (1), 882(2018).
  27. Shao, X., et al. Integrated Proteome Analysis Device for Fast Single-Cell Protein Profiling. Analytical Chemistry. 90 (23), 14003-14010 (2018).
  28. Li, Z. Y., et al. Nanoliter-Scale Oil-Air-Droplet Chip-Based Single Cell Proteomic Analysis. Analytical Chemistry. 90 (8), 5430-5438 (2018).
  29. Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology. 19 (1), 161(2018).
  30. Zhang, P., et al. Carrier-Assisted Single-Tube Processing Approach for Targeted Proteomics Analysis of Low Numbers of Mammalian Cells. Analytical Chemistry. 91 (2), 1441-1451 (2019).
  31. Shi, T., et al. Facile carrier-assisted targeted mass spectrometric approach for proteomic analysis of low numbers of mammalian cells. Communications Biology. 1, 103(2018).
  32. Vitrinel, B., Iannitelli, D. E., Mazzoni, E. O., Christiaen, L., Vogel, C. Simple Method to Quantify Protein Abundances from 1000 Cells. ACS Omega. 5 (25), 15537-15546 (2020).
  33. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  34. Shi, T., et al. Conservation of protein abundance patterns reveals the regulatory architecture of the EGFR-MAPK pathway. Science Signaling. 9 (436), 6(2016).
  35. Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
  36. He, J., et al. Analytical platform evaluation for quantification of ERG in prostate cancer using protein and mRNA detection methods. Journal of Translational Medicine. 13, 54(2015).
  37. Shi, T., et al. Antibody-free, targeted mass-spectrometric approach for quantification of proteins at low picogram per milliliter levels in human plasma/serum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (38), 15395-15400 (2012).
  38. Shi, T., et al. Targeted quantification of low ng/mL level proteins in human serum without immunoaffinity depletion. Journal of Proteome Research. 12 (7), 3353-3361 (2013).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Prepara o de Amostras Assistida por TransportadorProcessamento em Recipiente nicoAn lise LC SRMProte mica de C lula nicaM todo do Transportador de Prote nasDigest o por Lise CelularProtocolo de An lise de DadosRedu o de Adsor o SuperficialTransportador de Prote nas Ex geno
Vídeo em breve

Artigos relacionados