Descrevemos um método modificado à base de ágar projetado para quantificar os efeitos antifúngicos de produtos derivados de plantas. Tanto contribuições voláteis quanto não voláteis para a atividade antifúngica podem ser avaliadas através deste protocolo. Além disso, a eficácia contra fungos pode ser medida em estágios-chave de desenvolvimento em uma única configuração experimental.
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Artigo de método
Medindo atividade antifúngica volátil e não volátil de produtos de biocontrole
Neste artigo
Resumo
Resumo
O protocolo descrito baseia-se em uma técnica de transferência de plug-plug que permite a determinação precisa das quantidades de microrganismos e seus estágios de desenvolvimento. Um número especificado de esporos estão espalhados em uma placa de ágar. Esta placa de ágar é incubada por um período definido para permitir que os fungos atinjam o estágio de desenvolvimento esperado, exceto para esporos onde a incubação não é necessária. Os plugues ágar cobertos por esporos, hifas ou micélio são retirados e transferidos para a mídia ágar contendo o composto antifúngico a ser testado a uma distância dos fungos ou em contato. Este método é aplicável para testar tanto extratos líquidos quanto amostras sólidas (pós). É particularmente adequado para quantificar as contribuições relativas de agentes voláteis e não voláteis em misturas bioativas e para determinar seus efeitos, especificamente sobre esporos, higiais precoces e micélio.
O método é altamente relevante para a caracterização da atividade antifúngica de produtos de biocontrole, notadamente produtos derivados de plantas. De fato, para o tratamento da estação, os resultados podem ser usados para orientar a escolha do modo de aplicação e estabelecer os limiares de gatilho.
Introdução
As perdas globais de frutas e hortaliças podem atingir até 50% da produção1 e resultar principalmente da decadência alimentar causada pela deterioração de fungos no campo ou durante o armazenamento pós-colheita2,3, apesar do amplo emprego de fungicidas sintéticas desde meados do séculoXX 4. O uso dessas substâncias está sendo reconsiderado, pois representa sérios riscos ambientais e à saúde. Como as consequências nocivas de seu uso estão aparecendo em todos os ecossistemas e evidências de potenciais impactos à saúde acumularam5,....
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Protocolo
1. Preparação de inócula
- Antes do experimento, estava 5 μL de Trichoderma spp. Os esporos SBT10-2018 armazenados a 4 °C no natural de ágar médio (PDA) e incubam por 4 dias a 30°C com exposição regular à luz para promover a formação conidia42 (Figura 1, painel A).
NOTA: Trichoderma spp. O SBT10-2018 foi isolado da madeira e é usado como modelo neste estudo para seu rápido crescimento e facilidade de recuperação de esporos. Esta cepa é preservada pelo nosso laboratório. - Recuperar conidia (Figura 1, painel A)
- Coloque 3 mL de 0,05% Tween-20 ....
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Resultados
Para avaliar a capacidade do método quantitativo de discriminar o modo de ação de diferentes tipos de compostos antifúngicos, comparamos a eficácia de três agentes antifúngicos conhecidos. Carbendazim é um fungicida sintético não volátil que tem sido amplamente utilizado para controlar uma ampla gama de doenças fúngicas nas plantas39,40. O óleo essencial de timo vulgar foi descrito em grande parte por sua atividade antibacteriana e antifúngica e é usado .......
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Discussão
A abordagem aqui apresentada permite a avaliação de propriedades antifúngicas de produtos minimamente processados derivados de plantas. Neste protocolo, a distribuição homogênea dos esporos na superfície do ágar é alcançada utilizando contas de vidro de 2 mm. Esta etapa requer habilidades de manuseio para distribuir corretamente as contas e obter resultados reprodutíveis, permitindo, em última análise, a comparação de efeitos antifúngicos em diferentes estágios de crescimento fúngico. Descobrimos que contas de vidro de 5.......
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Agradecimentos
Somos muito gratos a Frank Yates por seu precioso conselho. Este trabalho foi apoiado pela Sup'Biotech.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Autoclave-vacuclav 24B+ | Melag | ||
| Carbendazim | Sigma | 378674-100G | |
| destilada | |||
| Tubos Eppendorf | Sarstedt | 72.706 | 1,5 mL |
| Tubos Falcons | Sarstedt | 547254 | 50 mL |
| de varejo | tubos de aço inoxidável de cinco milímetros de diâmetro | / | |
| Desidratador de alimentos | Sancusto | seis bandejas | |
| Alho em pó | Loja | ||
| Contas de vidro | CLOUP | 65020 |  |
| Célula de contagem de hemocitômetro | Jeulin | 713442 | / |
| Incubadora | Memmert | UM400 | 30 ° C |
| Moinho de facas | Bosch | TSM6A013B | |
| Contador manual de células | Labbox | HCNT-001-001 | / |
| Régua de medição | loja | ||
| Armários de segurança microbiológica | MAIS RÁPIDO | MAIS RÁPIDO BHA36, TIPO II, Micropipeta Cat 2 | |
| Mettler-Toledo | 17014407 | 100 - 1000 µ L | |
| Micropipeta | Mettler-Toledo | 17014411 | 20 - 200 µ L |
| Micropipeta | Mettler-Toledo | 17014412 | 2 - 20 µ L |
| Placa de Petri | Sarstedt | 82-1194500 | Placa de Petri de 55 mm |
| Sarstedt | 82-1473 | 90 mm | |
| Controladores de Pipeta-EASY 60 | Labbox | EASY-P60-001 | / |
| Potato Dextrose Agar | Sigma | 70139-500G | |
| Balança de precisão-RADWAG | Grosseron | B126698 | AS220. R2-ML 220g/0.1mg |
| Rake | Sarstedt | 86-1569001 | / |
| Microscópio reverso AE31E trinocular | Grosseron | M097917 | / |
| Pipeta graduada estéril | Sarstedt | 1254001 | 10 mL |
| Óleo essencial de timo Óleo essencial | farmácia | 100% | |
| Tips 1000 µ L | Sarstedt | 70.762010 | |
| Pontas 20 µ L | Sarstedt | 70.760012 | |
| Pontas 200 µ L | Sarstedt | 70.760002 | |
| Palito de dente | de loja | ||
| Trichoderma spp cepa | de laboratório LRPIA | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379-250ML | |
| Tween-80 | Sigma | P1754-1L | |
| Pinças | Labbox | FORS-001-002 | / |
Referências
- FAO. Global food losses and food waste - Extent, causes and prevention. FAO. , Rome. (2011).
- da Cruz Cabral, L., Fernández Pinto, V., Patriarca, A. Application of plant compounds to control fungal spoilage and mycotoxin production in foods. Intern....
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Reimpressões e permissões
